第五章基因工程育种微生物遗传育种
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异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均 识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者 切后产生粘性末端。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（4） 同尾酶 ( isoocaudamer )
两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的 粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: G↓GATCC BglⅡ：T↓ GATCA
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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二、DNA连接酶（DNA ligase ）
催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’OH之间形成磷酸二酯键。 1、体外DNA连接 连接具有互补粘性末端的DNA片段 连接具有平末端的DNA片段 先在DNA片段末端加上人工接头，使其 形成粘性末端，再行连接
第五章基因工程育种微生物遗传育种
限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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2、限制性核酸内切酶的类型
特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
功能
限制、修饰
限制
限制、修饰
蛋白质结构 3种不同亚基
所需辅助因 ATP, Mg2+, SAM 子
识别序列 切割位点
EcoB: TGA(N)8TGCT
距识别位点至少 1000kb处随机 切割
SDS、高盐浓度。 其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（3）同裂酶 ( isoschizomers )
狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。 HpaⅡ与MspI: CCGG
广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的 限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同
第五章基因工程育种微生物遗传育种
3
第一节 基因克隆的酶学基础
一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断 裂的酶。
核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase) 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease
16
三、反转录酶 (reverse transcriptase) 催化以mRNA为模板的cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：
互补于mRNA的DNA片段
DNA ↓转录 前体mRNA ↓修饰 成熟mRNA
内含子
外显子
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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Reverse transcription
[例]
EcoRI, EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得
HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征
（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转 对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure )
Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖
DNA的分子克隆
Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与λ噬菌体基 因融合，成功构建重组DNA；
Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的 tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli， 首次实现了DNA的分子克隆。
3’-G ↑ ACGT C-5’
产生5’-P单链粘性末端: EcoRI 5’-G↓AATT C -3’
3’-C TTAA ↑G-5’
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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第五章基因工程育种微生物遗传育种
10
酶剪切条件
需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。 辅助条件：DTT、牛血清蛋白。 抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、
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2、连接用酶 （1）T4 DNA连接酶： 催化反应需要Mg+2, ATP 催化粘性末端连接，效率较高 催化平末端连接 （2）大肠杆菌连接酶 催化反应需要NAD+ 只能催化粘性末端的连接
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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减少载体 自身连接 的方法： 脱磷酸； 双酶切
第五章基因工程育种微生物遗传育种
单一成分
2种不同亚基
Mg2+
ATP, Mg2+, SAM
4~8bp,旋转对 EcoPI:
称
AGACC
在识别序列内 距识别位点3’（或附近） 端24~26bp处
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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3、限制性核酸内切酶的命名
用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋ 种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一
个字母]＋编号（罗马数字）
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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1、寄主控制的限制与修饰作用
（1）寄主控制的限制作用(Restriction) 作用：破坏外源DNA，使之迅速降解 机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进
行切割 （2）寄主控制的修饰作用(Modification) 作用：保护自身的DNA，使之不受限制 机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到
DNA的快速测序
Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法 DNA快速测序技术
1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger
第五章基因工程育种微生物遗传育种
2
基因工程操作的主要步骤
➢ 分离或合成基因； ➢ 通过体外重组将基因插入载体； ➢ 将重组DNA导入细胞； ➢ 扩增克隆的基因； ➢ 筛选重组体克隆； ➢ 对克隆的基因进行鉴定或测序； ➢ 控制外源基因的表达； ➢ 得到基因产物或转基因动物、转基因植物
第五章 基因工程育种
Genetic engineering
基因工程是将不同生物的基因在体外人工 剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒 ）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进 行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产 生所需要的蛋白质。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
1
奠定基因工程的三项关键技术
DNA的特异切割
例：AluI：5’-AGCT-3’ AsuI：5’-GGNCC-3’ PstI： 5’-CTGCAG-3’
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（2） 切割： 产生平末端：SmaI
5’-CCC↓GGG-3’ 3’-GGG↑CCC-5’
5’-C TGCA ↓ G -3’
产生3’-OH单链粘性末端: PstI
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（4） 同尾酶 ( isoocaudamer )
两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的 粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: G↓GATCC BglⅡ：T↓ GATCA
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二、DNA连接酶（DNA ligase ）
催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’OH之间形成磷酸二酯键。 1、体外DNA连接 连接具有互补粘性末端的DNA片段 连接具有平末端的DNA片段 先在DNA片段末端加上人工接头，使其 形成粘性末端，再行连接
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限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。
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特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
功能
限制、修饰
限制
限制、修饰
蛋白质结构 3种不同亚基
所需辅助因 ATP, Mg2+, SAM 子
识别序列 切割位点
EcoB: TGA(N)8TGCT
距识别位点至少 1000kb处随机 切割
SDS、高盐浓度。 其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。
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（3）同裂酶 ( isoschizomers )
狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。 HpaⅡ与MspI: CCGG
广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的 限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同
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第一节 基因克隆的酶学基础
一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断 裂的酶。
核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase) 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease
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三、反转录酶 (reverse transcriptase) 催化以mRNA为模板的cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：
互补于mRNA的DNA片段
DNA ↓转录 前体mRNA ↓修饰 成熟mRNA
内含子
外显子
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Reverse transcription
[例]
EcoRI, EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得
HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征
（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转 对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure )
Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖
DNA的分子克隆
Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与λ噬菌体基 因融合，成功构建重组DNA；
Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的 tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli， 首次实现了DNA的分子克隆。
3’-G ↑ ACGT C-5’
产生5’-P单链粘性末端: EcoRI 5’-G↓AATT C -3’
3’-C TTAA ↑G-5’
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第五章基因工程育种微生物遗传育种
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酶剪切条件
需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。 辅助条件：DTT、牛血清蛋白。 抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、
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2、连接用酶 （1）T4 DNA连接酶： 催化反应需要Mg+2, ATP 催化粘性末端连接，效率较高 催化平末端连接 （2）大肠杆菌连接酶 催化反应需要NAD+ 只能催化粘性末端的连接
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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减少载体 自身连接 的方法： 脱磷酸； 双酶切
第五章基因工程育种微生物遗传育种
单一成分
2种不同亚基
Mg2+
ATP, Mg2+, SAM
4~8bp,旋转对 EcoPI:
称
AGACC
在识别序列内 距识别位点3’（或附近） 端24~26bp处
第五章基因工程育种微生物遗传育种
6
3、限制性核酸内切酶的命名
用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋ 种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一
个字母]＋编号（罗马数字）
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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1、寄主控制的限制与修饰作用
（1）寄主控制的限制作用(Restriction) 作用：破坏外源DNA，使之迅速降解 机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进
行切割 （2）寄主控制的修饰作用(Modification) 作用：保护自身的DNA，使之不受限制 机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到
DNA的快速测序
Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法 DNA快速测序技术
1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger
第五章基因工程育种微生物遗传育种
2
基因工程操作的主要步骤
➢ 分离或合成基因； ➢ 通过体外重组将基因插入载体； ➢ 将重组DNA导入细胞； ➢ 扩增克隆的基因； ➢ 筛选重组体克隆； ➢ 对克隆的基因进行鉴定或测序； ➢ 控制外源基因的表达； ➢ 得到基因产物或转基因动物、转基因植物
第五章 基因工程育种
Genetic engineering
基因工程是将不同生物的基因在体外人工 剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒 ）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进 行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产 生所需要的蛋白质。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
1
奠定基因工程的三项关键技术
DNA的特异切割
例：AluI：5’-AGCT-3’ AsuI：5’-GGNCC-3’ PstI： 5’-CTGCAG-3’
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（2） 切割： 产生平末端：SmaI
5’-CCC↓GGG-3’ 3’-GGG↑CCC-5’
5’-C TGCA ↓ G -3’
产生3’-OH单链粘性末端: PstI