第五章基因工程育种微生物遗传育种
微生物遗传育种学
微生物遗传育种学一、名词解释（3*5）1、pcr:聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定dna片段的核酸合成技术。
2、操纵子：操纵子(operon)：原核生物能mRNA出来一条mrna的几个功能有关的结构基因及其上游的调控区域，称作一个操纵子（operon）。
3、启动子(promoter)：真核基因启动子是rna聚合酶结合点周围的一组转录控制元件，包括：至少一个转录起始点及一个以上的功能组件。
4、冈崎片段:冈崎片段就是由于解链方向与激活方向不一致，其中一股子链的激活，Gondrecourt母链求出足够多长度才已经开始分解成引物接着缩短。
这种不已连续的激活片段就是冈崎片段。
5、营养缺陷型：指某一菌株在诱变后丧失了合成某种营养成分（生长因子）的能力，使其在基本培养基上不能生长，必须加入相应物质才能生长的突变体。
6、准性生殖：就是一种类似有性生殖但比它更为完整的一种生殖方式。
可使同一种生物的两个相同来源（即为同种相同株）的体细胞经融合后，不通过有丝分裂而引致高频率的基因重组。
准性生殖常见于某些真菌，尤其就是半知菌中。
7、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别并切割特异的双链dna序列的一种内切核酸酶。
8、密码的自旋性：密码的自旋性就是多个密码子编码同一个氨基酸的现象。
9、转座子(transposons):转座子是可以从一个染色体位点转移至另一个位点的分散的重复序列。
转座子也包括含有两个反向重复序列的侧翼，内有转座酶基因，并含有抗生素耐药基因等其他基因。
10、微生物繁育：人为地使用物理、化学的因素，引致有机体产生遗传物质的突变，经选育成为新品种的途径。
二、是非题（2*5）三、选择题（3*5）1、限制性内乌酶的种类、辨识位点、功能、区别根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。
ⅱ型酶所占到的比例最小，相对来说最简单，它们辨识回文等距序列，在回文序列内部或附近研磨dna。
食品微生物 第5章 微生物遗传变异与菌种选育第二节
携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为 转导噬菌体。
普遍性转导
细菌转导的二种类型：
特异性转导
1、普遍性转导（generalized transduction）
通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段 DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍 性转导。 (1) 意外的发现
保藏期 3-6 月
1-2 年 1-10 年 5-15 年
菌种保藏机构
ATCC采用的菌种保藏法：
（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中心）
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法：
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism， 中国微生物菌种保藏委员会）
转化（transformation）
转化：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色 体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性 状的现象。
转化因子
吸附吸收
受体细胞 高1000倍 感受态
整合
转化子
(2) 转化过程
供体(strR)
ds DNA
感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合 为一个新细胞的技术。
五、基因工程技术用于工业菌种改良
基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。将含 目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受 体细胞并使之扩增、表达的过程。
•目的基因 •载体选择 •体外重组 •导入细胞 •筛选 •鉴定
分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等 质粒、噬菌体、病毒
微生物育种ppt课件
出发菌株的纯化
纯种分离方法，常用划线分离法和稀释平板法。
在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但 它是不可缺少的技术步骤，例如前面的例子中，灰黄 霉素变种B-53，经自然分离，获得的变株C-04的产 量比前者显著提高。 ▲
组织松,生长速度快
C-2 UV
C-3 NM C-4 X射线 C-7 UV+Lф C-8 UV C-15 NTG C-17 EMS C-19 NS C-20 EMS
213
548 829 1120 1610 2630 3028 3223 4000 8-11.5 7-8 6-8 4-5 4.5-5.2 8-9 8-9 乳白 柠檬黄 柠檬黄 柠檬黄 鹅黄 (边缘柠檬黄) 乳黄 粉玉色
一代诱变约需2～3个月
突变的机制
碱基置换（转换 颠换）
点突变 移码突位、倒位 突 变
自发突变
第一节 诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从中筛选出产量高、性状优良的突变株， 并 设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工 艺条件下最有效地合成产物。
当的知识和全面的了解。
2.
诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7～
10天的抗生素菌种来说，一代诱变需2～3月，因此 事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征 和生化特征，以及有关培养条件对其影响等，最 后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。
诱变育种的步骤 •出发菌株的选择与纯化 •单孢子（单细胞）悬液的制备 •诱变剂及诱变剂量的选择 •诱变处理方法 •高产菌株的分离
4、能诱变产生遗传性变异 5、产量高、收得率高
高产突变是一种数量遗传，是由多基因决定的，产量的提 高，需要通过多代诱发突变逐渐积累 诱变是不定向的，会产生各种突变体，从中筛选出复合要 求的菌种是诱变育种中一项重要而艰苦的工作
微生物 10-4、5、6第十章 微生物的遗传变异和育种
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、 人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成 素、重组链激酶等都已先后供应市场，不仅保 证了这些药物的来源，而且使成本大大降低。 但工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳 定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发 生DNA片断脱落；表达产物不稳定。 工程菌的稳定与否，与重组质粒本身的分子组 成、宿主细胞生理和遗传性以及环境条件等因 素有关。
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否 则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c ）死亡。
一、菌种的衰退与复壮
衰退：菌种出现或表现出负变性状
菌种衰退的原因： ①大量群体中的自发突变
自发突变
纯菌种
不纯菌种
传代增殖
衰退菌种
原始个体
突变个体 菌种衰退的原因： ②分离现象。 菌种衰退的原因： ③培养条件与传代。
准性杂交育种
第五节 分子育种（基因工程育种）
一、基因工程 定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使 物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的 生物新品系。
特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性
二、基因工程的基本操作 获得目的基因
选择基因载体
体外重组 外源基因导入 筛选和鉴定
应用
通过基因工程改变后的菌株被称为“工程菌”， 工程菌已逐渐应用于药物的微生物发酵生产中， 主要有以下几个方面：①增加生物合成基因量而 增加抗生素产量；②导入强启动子或抗性基因而 增加抗生素产量；③把两种不同的生物合成基因 在体外重组后再导入受体而产生杂交抗生素；④ 激活沉默基因，以其产生新的生物活性物质或提 高抗生素产量；⑤把异源基因克隆到宿主中表达， 以期彻底改变生产工艺。
遗传育种
浅谈遗传育种学遗传育种学，从内容上可以分为遗传学和育种学两部分。
遗传学主要是研究遗传与变异的科学，主要内容内容包括遗传的细胞学基础、分离规律、自由组合规律、连锁遗传规律、染色体结构变异、染色体的数目变异、遗传物质的分子基础、基因工程、数量性状的遗传、近亲繁殖和杂种优势、细胞质遗传、群体遗传等；而育种学是研究动植物在繁育过程中如何得到优良品种的后代的一门科学，其主要包括育种与农业生产、育种目标、种质资源、植物的繁殖方式、引种和训化、选择育种、杂交育种、回交育种、远缘杂交及倍性育种、杂种优势利用、诱变育种、生物技术等内容。
从研究对象上，遗传育种学可分为植物遗传育种学、动物遗传育种学以及微生物遗传育种学等，而作为生物学上的一个小分支，其运用范围和前景越来越广泛。
一、遗传学1、定义研究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规律的学科及研究生物的遗传与变异的科学。
研究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规律的学科。
2、学科分支从噬菌体到人，生物界有基本一致的遗传和变异规律，所以遗传学原则上不以研究的生物对象划分学科分支。
人类遗传学的划分是因为研究人的遗传学与人类的幸福密切相关，而系谱分析和双生儿法等又几乎只限于人类的遗传学研究。
微生物遗传学的划分是因为微生物与高等动植物的体制很不相同，因而必须采用特殊方法进行研究。
此外，还有因生产意义而出现的以某一类或某一种生物命名的分支学科，如家禽遗传学、棉花遗传学、水稻遗传学等。
更多的遗传学分支学科是按照所研究的问题来划分的。
例如，细胞遗传学是细胞学和遗传学的结合；发生遗传学所研究的是个体发育的遗传控制；行为遗传学研究的是行为的遗传基础；免疫遗传学研究的是免疫机制的遗传基础；辐射遗传学专门研究辐射的遗传学效应；药物遗传学则专门研究人对药物反应的遗传规律和物质基础，等等。
从群体角度进行遗传学研究的学科有群体遗传学、生态遗传学、数量遗传学、进化遗传学等。
这些学科之间关系紧密，界线较难划分。
基因工程育种技术
基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。
基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。
但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。
第一节基因工程的基本过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1．外源DNA的获得与酶切；2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选；分离D NA酶切酶切供体细胞重组转化子图6-1 基因工程的基本过程由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA 体外重组用的酶以及宿主细胞。
一、 载体外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。
图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。
图6-2 载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一) 复制原点载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。
不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。
图6-2所示的pUC 系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。
整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。
(二) 筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。
载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Amp r），能分解氨苄青霉素中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。
基因工程育种微生物遗传育种
• 基因工程育种与微生物遗传育种概述 • 基因工程育种技术 • 微生物遗传育种技术 • 基因工程育种与微生物遗传育种的应
用 • 基因工程育种与微生物遗传育种的挑
战与前景
01
基因工程育种与微生物遗传育种概述
基因工程育种定义与特点
定义
基因工程育种是通过基因工程技术对 生物体的基因进行改造，以达到改良 生物性状和提高产量等目的的育种方 法。
工业领域的应用
工业酶
利用基因工程技术生产具有特殊功能的工业酶，广泛应用于洗涤 剂、食品、纺织和制药等行业。
生物燃料
通过基因工程技术改良微生物，生产高效、环保的生物燃料，减少 对化石燃料的依赖。
生物材料
利用基因工程技术生产具有特殊性能的生物材料，如可降解塑料、 生物纤维等，替代传统石化材料。
05
基因工程育种与微生物遗传育种的挑
战与前景
技术挑战与伦理问题
技术挑战
基因工程育种和微生物遗传育种技术需要高 水平的科学知识和技术能力，同时面临着技 术难度大、成本高、周期长等问题。
伦理问题
基因工程育种和微生物遗传育种涉及到人类 基因和生命形式的改变，可能引发伦理和道 德方面的争议，需要慎重考虑和规范。
未来发展方向与前景
精准育种
随着基因组学和生物信息学的发展，基因工程育种和微生物遗传育种将更加精准和高效， 能够更好地满足农业生产和生物医药等领域的需求。
VS
细胞工厂构建
通过代谢工程手段改造微生物细胞，使其 具备生产特定化学品、燃料或材料的能力 。
04
基因工程育种与微生物遗传育种的应
用
医药领域的应用
基因治疗
利用基因工程技术修复或替换缺陷基因，以达到治疗 遗传性疾病和恶性肿瘤等疾病的目。
遗传育种学知识点总结
遗传育种学知识点总结遗传育种学是一门研究如何通过遗传改良提高农作物和家畜品质的学科。
在农业生产中，遗传育种是非常重要的，它可以通过选择、杂交、转基因等方法来改良作物的抗病性、产量和品质，从而提高农作物的产量和品质，确保粮食安全。
本文将从遗传育种学的基本概念、遗传变异、杂交育种、分子标记辅助育种和转基因等方面对遗传育种学的知识点进行总结。
一、基本概念1. 遗传育种学的定义遗传育种学是研究动植物的优良性状如何通过遗传改良的学科。
它以遗传学为基础，结合植物学、动物学、生物化学等学科知识，通过选择和杂交的方法，提高动植物的抗逆性、适应性、产量、品质等性状，为农业生产提供新的种质资源。
2. 农作物的种质资源种质资源是指供遗传改良使用的农作物品种、种群和野生近缘种的总称。
农作物的种质资源是遗传育种的基础，包括不同的品种、种系和野生近缘种，它们具有丰富的遗传变异，为遗传改良提供了大量的遗传资源。
3. 遗传育种的目标遗传育种的目标是通过选择和杂交等方法，提高农作物和家畜的抗病性、抗逆性、产量和品质，适应不同的生产环境，提高农业生产的效益，确保粮食安全和国民经济的可持续发展。
4. 遗传育种的原理遗传育种的原理是通过选择和杂交的方法，利用基因的遗传变异，从而提高动植物的遗传性状。
选择是指在种质资源中选择具有优良性状的个体或种群，通过人为的选择和培育，逐步提高种群的产量和品质。
杂交是指将父本和母本中的不同基因型进行交配，通过基因的重新组合，产生具有优良性状的后代。
二、遗传变异1. 遗传变异的概念遗传变异是指在种群中存在着不同的基因型和表现型。
在自然界和人工选择的过程中，动植物的基因组会产生不同程度的变异，这种变异包括单体型变异、种间变异和种群变异。
2. 遗传变异的来源遗传变异的来源主要包括自然变异、人工诱变和基因工程。
自然变异是指在自然条件下，由于基因的突变、重组和分离等原因，使得种群中存在着不同的基因型和表现型。
人工诱变是指通过物理、化学或生物学的方法，诱发基因的突变或重组，产生新的遗传变异。
最终完美整理版微生物学教程(第二版周德庆)答案
微生物教程课后答案（周德庆）第五章名词解释：不产氧光合作用：在某些光合细菌(如红螺菌中),由于没有光反应中心Ⅱ的存在，不能光解水,因而没有氧气放出,故称为不产氧光合作用：在蓝细菌中,由于有光反应中心Ⅱ的存在,能光解水，并有氧气放出,故称产氧光合作用。
发酵：发酵是在微生物细胞内发生的一种氧化还原反应，在反应过程中,有机物氧化放出的电子直接交给基质本身未完全氧化的某种中间产物,同时放出能量和各种不同的代谢产物。
呼吸作用：葡萄糖在好氧和兼性好氧微生物里通过氧化作用放出电子，该电子经电子传递链传给外源电子受体分子氧或其它氧化型化合物生成水或其它还原型产物，并伴随有能量放出的生物学过程称为呼吸作用。
无氧呼吸指以无机氧化物(如NO3-，NO2-，SO42-等)代替分子氧作为最终电子受体的氧化作用。
有氧呼吸：指以分子氧作为最终电子受体的氧化作用生物氧化：生物体中有机物质氧化而产生大量能量的过程。
光合磷酸化：光合磷酸化是指光能转变为化学能的过程。
合成代谢：由小分子物质合成复杂大分子物质并伴随着能量消耗的过程。
分解代谢：营养物质或细胞物质降解为小分子物质并伴随着能量产生的过程。
产能代谢：微生物通过呼吸或发酵作用分解基质产生能量的过程耗能代谢：微生物在合成细胞大分子化合物时消耗能量ATP的过程。
环式光合磷酸化在某些光合细菌里，光反应中心的叶绿素通过吸收光而逐出电子使自己处于氧化状态，逐出的电子通过电子载体铁氧还蛋白，泛醌，细胞色素b 和细胞色素c组成的电子传递链的传递，又返回叶绿素，从而使叶绿素分子又回复到原来的状态。
电子在传递过程中产生ATP，由于在这种光合磷酸化里电子通过电子传递体的传递后又回到了叶绿素分子本身，故称环式光合磷酸化。
初级代谢：指能使营养物质转变成机体的结构物质,或对机体具有生理活性作用的物质代谢以及能为机体提供能量的一类代谢称初级代谢。
初级代谢产物：由初级代谢产生的产物称为初级代谢产物，这类产物包括供机体进行生物合成的各种小分子前体物，单体与多聚体物质以及在能量代谢和代谢调节中起作用的各种物质次级代谢：某些微生物为了避免在初级代谢过程中某种中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。
绪论-1
绪
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
论
微生物遗传育种学的概念 微生物育种学的发展简史 微生物的主要类群及结构 工业微生物菌种 微生物遗传育种的目的及方法
第一节 微生物遗传育种学的概念
微生物遗传学 微生物育种 微生物育种学
一、微生物遗传学
微生物遗传学是以病毒、细菌、小型真菌以及单细胞动植物
4、形成间体：
3、细胞质（cytoplasm ) 和内含物（inclusionbody）
细胞质化学组成：主要成分是水、蛋白质、核酸、 脂类，少量糖类和无机盐。
内含物：如大量核糖体、胞浆颗粒以及质粒 。
4、核 区（nuclear region）
由裸露的双股DNA
盘绕组成，没有组蛋 白包绕，也没有核膜
孢子丝
气生菌丝
基内菌丝
二、真核微生物
菌物界—— 粘菌 假菌 真菌 单细胞真菌——酵母菌 丝状真菌——霉菌 大型子实体真菌——蕈菌
真核生物与原核生物的比较
1、 酵母菌（yeast)
酵母细胞构造：
细胞壁：酵母纤维素，三明治状。 甘露聚糖、蛋白质（包括多种酶）、葡聚糖。 壁可由 玛瑙螺胃液---蜗牛消化酶 水解
是位于细胞表面，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧、 略具弹性的结构。 功能：（1）维持细胞外形。 （2）保护细胞免受机械性或渗透压的破坏。 （3）为鞭毛的运动提供支点。 （4）阻碍大分子物质和有害物质进入细胞。 （5）与细菌的抗原性、致病性、对噬菌体的敏感 性有关。
革兰氏染色 (Gram stain)的机制
几属重要的霉菌
青霉属 曲霉属
根霉属
微生物遗传育种课件,基因突变
1、突变（Mutation）：指遗传物质发生了稳定 的可遗传的变化，所有的突变都是DNA结构中碱 基所发生的改变。
2、突变体（Mutant）：携带突变的生物个体或 群体或株系，称为突变体。
3、突变基因（Mutant Gene）和野生型基因 （Wild Gene）：发生了突变的基因称为突变基 因，没有发生突变的基因称为野生型基因。
λ galK2 mtl-1 xyl-5 ara-14 rpsL31 tsx-33 - supE44
三、突变的分类
1、按照突变生成的过程（或原因）来看：可分为自发突变和诱发突变。
2、从DNA碱基序列改变多少来分可分为单点突变和多点突变。
点突变
碱基替代 碱基插入 碱基缺失
颠换 转换
3、从阅读框架的影响来看有所谓的移框突变。
2、产生同样表型的不同基因座位，在上述斜体小写的英文3个字母后加上一个 斜体的大写字母以示区别，如trp A。
3、一个基因的不同突变位点是在这个突变基因座位符号后，按分离先后次序 用数字来表示，如果不知道这些突变属于哪一个基因座位，则用“—”来代替。
如trp A 23,trp —54
4、表型特性同样用3个字母来表示，但第一个字母大写，以便于基因符号清楚 的区别。
第三节 诱变的机制
1. 概念：
原核或真核细胞基因组中可以从一个 位置转移到另一个位置的遗传因子叫做转 座因子。
第三节 诱变的机制
从不同体系中分离到的转座因子往往给 予不同的符号表示，如细菌的转座因子：IS （insertion sequence），Tn（transposon）； 酵母的转座因子：Ty（transposon yeast）； 果蝇的转座因子：Copia或FB(fold back)等等。 细菌中可能转座的遗传因子大致可分三类： 插入顺序（IS）、转座子（Tn）和某些温和 噬菌体（如Mu-1φ108）。
微生物的遗传和育种
微生物育种的社会和经济影响
社会影响
随着微生物遗传和育种技术的不 断发展，人们需要关注相关的伦 理、安全和环境问题，以确保技 术的可持续发展和应用。
经济影响
微生物育种技术的发展有望为工 业、农业、医药等领域带来巨大 的经济效益，同时也需要关注技 术的成本和商业化前景。
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土壤修复
微生物育种技术可用于土壤修复领域，通过改良土壤中微生物的种 类和数量，改善土壤质量，提高土壤肥力。
空气净化
某些微生物具有降解空气中有害物质的能力，通过微生物育种技术 可以改良这些微生物的降解能力，用于空气净化。
05
未来展望
基因编辑技术的发展
基因编辑技术
随着CRISPR等基因编辑技术的发展， 科学家们能够更精确、高效地修改微 生物基因，从而改良微生物的性状和 生产性能。
代谢工程育种
代谢途径分析
对微生物的代谢途径进行分析， 了解各代谢途径之间的相互关系 和调控机制。
代谢流量调控
通过调节代谢途径中的关键酶活 性或改变代谢流量的方向，以提 高目标产物的合成效率。
细胞工厂构建
通过基因工程技术对微生物进行 改造，构建具有特定代谢特征的 细胞工厂，实现目标产物的定向 生产。
基因编辑的应用
基因编辑技术有望在医药、农业、工 业等领域发挥重要作用，例如用于生 产新型药物、改良农作物、提高微生 物产物的产量和品质等。
合成生物学在微生物育种中的应用
合成生物学
合成生物学是一门新兴的交叉学科，旨 在通过设计和构建人工生物系统来改良 和优化生物功能。
VS
微生物育种中的应用
合成生物学在微生物育种中具有广阔的应 用前景，例如通过设计和构建人工微生物 来生产燃料、化学品、药物等，同时也有 助于解决环境问题和粮食安全问题。
第五章 微生物基因工程育种
1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元 （操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达 调控的重要规律。
基因的现代概念
移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene） 重复基因（repeated genes） 重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）
基 因 工 程 流 程 示 意 图
基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、 农业等各个领域得到了广泛的应用。
在医学上的应用
基因工程被用于大量生产过
去难以得到或几乎不可能得到的
蛋白质－肽类药物。
转基因动物和植物
转基因动物首先在小鼠获得成功。现在
转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/
第五章 工业微生物基因育种
王陶 2012年2月
目的与要求
了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的 原理与方法。
教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理
教学内容
1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变
孟 德 尔 研 究 的 七 对 性 状
豌豆杂交操作
孟 德 尔 分 离 律
孟 德 尔 自 由 组 合 律
黄圆 绿圆 黄皱 绿皱
1909年，丹麦的遗传学家W.
Johanssen 根据希腊语“给予生命”之义，创造了 “gene‖一词。但它只是一个抽象的单 位，并不代表物质实体。
生物育种
生物育种含义：
指人们按照自己的意愿，依据不同 的育种原理，有目的、有计划地获得人 们所需要的生物新品种。
一、常用育种方法
(1)图中A至D方向所示的途径表示 从F2开始发生性状分离
杂交
育种方式，这
种方法属常规育种，一般从F2代开始选种，这是因为
。
。
(2) B 常用的方法为
花药离体培养
。
(3) E方法所用的原理是
（2）产生 自然:(生殖细胞未受精,直接发育而成) 人工:（单倍体育种） （3）特点： 弱小、高度不育
（4）单倍体育种的过程和特点： 方法: ——花药离体培养
过程:
组织 花药离体 培养
人工诱导 正常植株 单倍体植株 染色体加倍
(纯合体)
优点：
1、可以缩短育种年限 2、后代不会发生分离
杂交育种 处理 原理 优缺 点 杂交
（2）方法： 用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗
（3）原理： 秋水仙素能抑制纺锤体形成 种子、幼苗 秋水仙素处理 染色体加倍、不分离 如：二倍体 多倍体
秋水仙素
生长素Байду номын сангаас
四倍体
二倍体
二倍体
多倍体形成的原因： 外界环境
内部因素
不能形成 纺锤体
染色体复制加 倍后不分离
多倍体
染色体加倍 的细胞
单倍体 由配子发育而成，体细胞中含有本 （1）定义： 物种配子染色体数目的个体。 发育 配子 单倍体
。
（5）由G到J过程中涉及的生物技术有
基因工程（DNA重组技术） 、
和 植物组织培养
。
（6）K→L→M这种育种方法的优越性表现在 克服远缘杂交 、 不亲和的障碍，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围 。
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
微生物遗传育种
原生质体融合操作示意图
五、基因工程育种
20世纪70年代 包括基因工程、分子定向进化等 以微生物本身为出发菌株利用基因工程方法进行改造而获得
的工程菌，或者是将微生物甲的某种基因导入到乙中，使后 者具有前者的某些性状或表达前者的某些基因产物而获得的 新菌种。 优点：克服远缘杂交的不亲和障碍、定向改变生物性状 缺点：可能会引起生态危机、技术难度大
3.溶源性转变
概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主 的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。
区别： 当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失 温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新 性状 温和噬菌体是完整的，不是缺陷的 获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子
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基因重组（gene recombination）：通过两个具有不同优良性状的亲本菌株 杂交达到基因重组，使两个亲本的优良性状集中到一个重组菌株内。
杂交育种(Hybridization breeding)：一般是指人为利用真核微生物的有性 杂交或准性生殖，或原核微生物的接合、转导和转化等过程，促使两个具不 同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
诱变育种的特点
诱变育种存在一定的盲目性和随机性，但操作简便、突变率高、突 变谱广，不仅能提高产量、改进质量，还能扩大产品种类和简化工艺条 件，用于代谢控制育种和杂交育种。因此，发酵工业的优良菌种的选育 主要采用诱变育种方法。
长期诱变会出现产量性状难以继续提高的问题，菌株生活能力一般 会逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓 慢等。
常见微生物菌种保藏方法比较
微生物育种资料名词解释富集培养目的微生物含量较少时根据
微生物育种资料名词解释1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。
2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。
3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。
4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。
获得远缘杂交重组体的特殊方式。
5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
解答1．工业生产的微生物菌种的特性①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定2．工业微生物的发展史（1）诱变育种。
以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。
（2）杂交育种。
使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。
（3）代谢控制育种。
进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。
几种微生物遗传育种方法的比较
几种微生物遗传育种方法的比较摘要：微生物是一类形体微小的单细胞或个体结构比较简单的多细胞，甚至没有细胞结构的低等生物，是眼看不见，手摸不着，有生命的微小生物，只有借助于显微镜才能看到。
微生物与人类的关系极为密切，每时每刻都以不同的方式影响着人类的生活。
研究和应用微生物技术有助于消除环境污染，增进人类健康。
微生物育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行多方位的改造。
通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。
用于微生物育种的方法主要有诱变、基因转移和基因重组，其中诱变是菌株改良的一项基本手段，基因重组则包括若干有效手段，如原生质体技术、基因克隆技术等是当今菌种改良中最具潜力的方法。
关键词：微生物；育种；诱变；基因重组；遗传微生物从发现到现在短短的300年间，特别是20世纪中叶，已在人类的生活和生产实践中得到广泛的应用，并形成了继动、植物两大生物产业后的第三大产业。
这是以微生物的代谢产物和菌体本身为生产对象的生物产业，所用的微生物主要是从自然界筛选或选育的自然菌种。
21世纪，微生物产业除了更广泛的利用和挖掘不同生境（包括极端环境）的自然资源微生物外，基因工程菌将形成一批强大的工业生产菌，生产外源基因表达的产物，特别是药物的生产将出现前所未有的新局面，结合基因组学在药物设计上的新策略将出现以核酸（DNA或RNA）为靶标的新药物（如反义寡核苷酸、肽核酸、DNA疫苗等）的大量生产，人类将完全征服癌症、艾滋病以及其他疾病。
此外，微生物工业将生产各种各样的新产品，例如降解性塑料、DNA芯片、生物能源等，在21世纪将出现一批崭新的微生物工业，为全世界的经济和社会发展做出更大贡献。
为了更好的运用微生物为我们创造更大的效益，我们需要微生物育种技术帮助我们改良现有的菌种。
本文参考了一些书籍及文献，概述几种微生物育种方法并做一下比较。
1 突变与育种1.1自发突变与育种1.1.1 生产中选育菌株在日常生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。
微生物育种[整理]
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工业微生物育种第一章绪论1.工业微生物菌种具备特征：1）菌种要纯2）目的产物的产量较高且稳定3）生长快，易繁殖4）抗杂菌和噬菌体的能力强5）微生物的发酵培养基来源广，价格低6）生产目的产物的时间短7）目的产物易分离纯化。
2.工业微生物育种的基础及作用：遗传与变异改良微生物并培育出各种有娘的工业微生物菌种。
3.工业微生物育种在发酵工业中的作用：不仅可以为发酵工业提供合适的菌种，还可不断提高发酵产品的产量和质量，甚至可培育出全新的菌种以生产新的发酵产品。
4.工业微生物育种的方法：1）自然选育（选择育种，通过改变群体的遗传结构，去掉不良细胞，使优良基因不断增加）2）右边育种（通过人工诱变剂）3）代谢控制育种（先诱变破坏微生物正常代谢）4）杂交育种（通过基因重组）5）基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.原核微生物产生变异的方式：转化，转导，结合，原生质体融合。
2.真核微生物产生变异的方式：有性杂交，准性生殖，原生质体融合。
3.核基因：细胞核内的DNA即染色体上的DNA，是微生物生长繁殖的必需基因，直接控制初级代谢产物的合成，间接控制次级代谢产物的合成。
4.核外基因：是细胞质中的DNA，是微生物的非必需基因，与次级代谢产物的合成有关。
5.表型延迟：有些基因发生突变后，要经两代以上的繁殖复制，表型才能相应的改变。
6.基因突变的类型：1）碱基的变化（碱基置换，移码突变）2）染色体畸变（缺失，重复，倒位，易位等结构变化）3）染色体数目变异（包括染色体单条的变化和整倍的改变）4）遗传信息的变化（同义突变，中性突变，错义突变，无义突变）7.基因突变的修复机制：光复活修复，切除修复，重组修复，SOS修复。
8.基因突变与表型的关系：基因突变指生物体的遗传物质发生改变，从而引起表型的变异。
同义突变与中性突变表型不变，错义突变与无义突变表型改变。
9.原核生物基因重组的特点：通常只有部分遗传物质的转移和重组，形成部分二倍体再进行重组。
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DNA的快速测序
Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法 DNA快速测序技术
1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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基因工程操作的主要步骤
➢ 分离或合成基因； ➢ 通过体外重组将基因插入载体； ➢ 将重组DNA导入细胞； ➢ 扩增克隆的基因； ➢ 筛选重组体克隆； ➢ 对克隆的基因进行鉴定或测序； ➢ 控制外源基因的表达； ➢ 得到基因产物或转基因动物、转基因植物
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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二、DNA连接酶（DNA ligase ）
催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’OH之间形成磷酸二酯键。 1、体外DNA连接 连接具有互补粘性末端的DNA片段 连接具有平末端的DNA片段 先在DNA片段末端加上人工接头，使其 形成粘性末端，再行连接
第五章基因工程育种微生物遗传育种
单一成分
2种不同亚基
Mg2+
ATP, Mg2+, SAM
4~8bp,旋转对 EcoPI:
称
AGACC
在识别序列内 距识别位点3’（或附近） 端24~26bp处
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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3、限制性核酸内切酶的命名
用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋ 种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一
个字母]＋编号（罗马数字）
异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均 识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者 切后产生粘性末端。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（4） 同尾酶 ( isoocaudamer )
两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的 粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: G↓GATCC BglⅡ：T↓ GATCA
3’-G ↑ ACGT C-5’
产生5’-P单链粘性末端: EcoRI 5’-G↓AATT C -3’
3’-C TTAA ↑G-5’
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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第五章基因工程育种微生物遗传育种
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酶剪切条件
需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。 辅助条件：DTT、牛血清蛋白。 抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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1、寄主控制的限制与修饰作用
（1）寄主控制的限制作用(Restriction) 作用：破坏外源DNA，使之迅速降解 机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进
行切割 （2）寄主控制的修饰作用(Modification) 作用：保护自身的DNA，使之不受限制 机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到
例：AluI：5’-AGCT-3’ AsuI：5’-GGNCC-3’ PstI： 5’-CTGCAG-3’
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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（2） 切割： 产生平末端：SmaI
5’-CCC↓GGG-3’ 3’-GGG↑CCC-5’
5’-C TGCA ↓ G -3’
产生3’-OH单链粘性末端: PstI
[例]
EcoRI, EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得
HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征
（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转 对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure )
SDS、高盐浓度。 其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。
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（3）同裂酶 ( isoschizomers )
狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。 HpaⅡ与MspI: CCGG
广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的 限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同
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三、反转录酶 (reverse transcriptase) 催化以mRNA为模板的cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：
互补于mRNA的DNA片段
DNA ↓转录 前体mRNA ↓修饰 成熟mRNA
内含子
外显子
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Reverse transcription
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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第一节 基因克隆的酶学基础
一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断 裂的酶。
核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase) 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease
限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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2、限制性核酸内切酶的类型特性ຫໍສະໝຸດ Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型
功能
限制、修饰
限制
限制、修饰
蛋白质结构 3种不同亚基
所需辅助因 ATP, Mg2+, SAM 子
识别序列 切割位点
EcoB: TGA(N)8TGCT
距识别位点至少 1000kb处随机 切割
Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖
DNA的分子克隆
Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与λ噬菌体基 因融合，成功构建重组DNA；
Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的 tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli， 首次实现了DNA的分子克隆。
第五章 基因工程育种
Genetic engineering
基因工程是将不同生物的基因在体外人工 剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒 ）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进 行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产 生所需要的蛋白质。
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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奠定基因工程的三项关键技术
DNA的特异切割
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2、连接用酶 （1）T4 DNA连接酶： 催化反应需要Mg+2, ATP 催化粘性末端连接，效率较高 催化平末端连接 （2）大肠杆菌连接酶 催化反应需要NAD+ 只能催化粘性末端的连接
第五章基因工程育种微生物遗传育种
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减少载体 自身连接 的方法： 脱磷酸； 双酶切
第五章基因工程育种微生物遗传育种