传奇公司 CAR-T细胞产品的质量控制和非临床研究

介绍1.CAR-T细胞质量控制1.1控制生产材料1.2过程控制1.3释放试验1.4工艺验证1.5稳定性研究2.非临床研究2.1实验室规范2.2测试样本来源、分析2.3体内药效学、药代动力学研究2.4非临床安全性研究3.质控要点3.1基因修饰载体质量控制3.2微生物安全3.3其他•嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T，Chimeric antigen receptor T cell）是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T 细胞激活信号的遗传物质转入T 细胞，使T 细胞通过直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B 等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的，而且还可形成免疫记忆T 细胞从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。

目前，CAR-T 细胞对多种血液肿瘤显示了非常好的临床效果，对实体瘤治疗也表现出了非常大的潜力。

CAR通常含有三个结构域：识别肿瘤相关抗原的细胞外结构域（例如，单链片段可变（scFv））;一个信号转导结构域（例如，CD3ζ）;和细胞内共刺激结构域（例如，可衍生自CD28，4-1BB，OX40，等）。

CAR的结构分为三部分：1.抗原结合区，通常为scFv，用来结合肿瘤细胞上的抗原；2.跨膜区，用来向细胞内传递结合信号；3.胞内信号区，用来激活T细胞，发挥生物学功能。

以研发为目的的，采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统的贴壁细胞。

转染试剂采用磷酸钙、PEI 、阳离子转染试剂。

小规模生产慢病毒载体大规模生产慢病毒贴壁细胞大规模生产慢病毒悬浮培养生产慢病毒目标转向临床实验或产业化，可以通过扩展方法(增加生产单元)，也可以通过采用悬浮培养系统实现。

贴壁细胞大规模生产慢病毒小规模生产的直接放大，即通过增加培养/生产单元来实现。

生产基本上采用大量的多层培养系统。

如：10层细胞工厂在悬浮培养模式下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。

通过大的生物反应器中培养细胞，主要用于工业化生产。

悬浮生长，这使得细胞培养和扩大比贴壁培养更加容易，同时培养基无动物来源成分可降低外源物质污染风险。

核酸酶转染试剂冷冻保护剂血清细胞培养基基因修饰的载体控制生产材料.•生产CAR-T 细胞的每种物质，都应明确定义并评估其适用性。

应测试成份，纯度，细菌内毒素，无菌，外来因子和生物活性，以证明质量，尽可能用简单的培养基，避免使用人或动物来源的成分，或可能引起过敏的药物。

核酸酶转染试剂冷冻保护剂血清细胞培养基基因修饰的载体控制生产材料.•培养过程中对培养基、活性因子等外源蛋白的要求-明确的来源及批号，应有质量检定合格报告•CAR-T 细胞制剂制备所用的样本及物料-《生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程》实行管理。

物料供应商应有相应的资质，并提供证明文件。

3.3其他•生产病毒的起始原材料➢含有CAR基因的穿梭载体➢辅助质粒载体➢包装细胞质粒菌种菌种库的建立细胞库的建立质粒应序列信息明确，并经过鉴定和确认。

质粒菌种应采取种子库系统，并按照《中国药典》相关要求完成菌种库的检定。

菌种建库过程应符合药品GMP 规范，同时应有明确来源和批质粒的质量应经过检测，包括但不限于：a) 纯度：超螺旋型的含量，细菌基因组DNA、RNA 和蛋白残留量；b) 无菌试验；c) 内毒素试验；d) 酶切鉴定；e) 基因测序；f) 如工艺中使用有潜在危险性的物质，则需做物质残余量的测定。

•制备质粒载体时，从工作种子批取一支或几支菌种复苏，逐级扩大培养后（培养过程中不应再使用抗生素等具有筛选压力的试剂）进行质粒提取，经纯化及除菌过滤后成为质粒批质粒鉴别含量纯度（包括DNA 形式及杂质）无菌内毒素等转染T 细胞的质粒载体质粒的细胞转染效率质粒的质量控制N o .Standard QC Release Test Description Standard 1Appearance Visual inspection Clarify 2A260/A280Absorbance ratio 1.8-2.03Restriction Digest EtBr-stained AGE Match expected 4Plasmid Form (% supercoiled)HPLC >90%supercoiled 5Host Protein ELISA<1.0%6DNA Homogeneity Densitometry after agarosegelelectrophoresis (AGE)>90%in supercoiled state 7Residual E. coli DNA qPCR for host DNA <0.1%8Residual E. coli RNAGel or HPLC for host RNA<0.1%by HPLC;undetectable (gel)9Endotoxin Limulus Amebocyte Lysate (LAL)assay <10EU/mg 10Mycoplasma PCR detection Not detectable 11SterilityUSP <71>Sterility TestNo growth种子库系统细胞种子库细胞主库细胞工作库细胞库质量要求种子库的管理中国药典《生产用动物细胞基质制备及检定规程》细胞鉴别（种属、株及专属特性）外源因子污染检查（包括非病毒性及病毒性内外源因子成瘤性及致瘤性检测染色体核型均一性以及稳定性中国药典•在生产CAR-T细胞期间应进行过程控制和测试。

过程控制监控生产过程;这包括监控过程参数和实现过程控制的目标。

在充分了解整个过程和累积生产经验的基础上，研究人员应明确过程控制中的关键生产步骤，并明确敏感参数的限制，以避免过程偏差。

过程中测试在准备过程中监控细胞质量;这涉及在关键步骤或中间产品级别测试产品的关键质量属性。

通过建立测试方法和过程测试的验收标准，结合最终产品的发布测试，可以实现对CAR-T 整体工艺和产品质量的控制，以确保生产过程的可重复性和批次到-最终产品的批次一致性•在CAR-T产品发布之前，必须进行适当的测试以确保产品符合指定的释放标准。

基本原则是必须进行适当的测试，以确保产品的特性，纯度，安全性和有效性符合要求。

应通过各种方法测试产品的这些特性，只有在合格和认证的情况下才能释放产品。

•放行检测项目应至少包括：无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞存活率、细胞数量、非T 细胞表型、效应细胞比率、CAR 转导/转染效率、CAR 基因拷贝数、复制型病毒以及可能的毒性物质残留等。

•对于CAR-T细胞产物制备的，全面的工艺鉴定和生产的多个连续批（至少三个批次）的工艺验证的全过程是必需的。

在此基础上，应建立适当的工艺参数和质量标准，以确保有效控制每道工序。

•在生产和使用的CAR-T细胞产品的过程中，控制良好的冷链运输和储存，确保细胞产品的质量和防止细菌和支原体污染的发生发挥了重要作用。

对于需要在生产过程中被暂时保存的样品，需要稳定的研究来验证他们的储存条件和储存期。

•2.1良好的实验室规范•CAR-T细胞治疗产品的体内药效学和药代动力学研究可以在非良好实验室规范（GLP）条件下进行;但是，对于非临床安全性评估，它们应符合GLP要求。

P2设计标准1.设计和建造标准达到国家生物安全防护实验室二级规范要求。

2.洁净度为万级3.室内照度设计：一般区域≥200Lux万级区≥300Lux4.噪音整体设计：≤60dB(A)5.室内温湿度设计：22℃±5/30—70%RH6.室内压差值：-5Pa—-20Pa（如果实验室内部操作物质是有毒物质，肯定要做成负压,如果内部操作物质非有毒有害，而实验室外部环境存在爆炸性物质，一般做成正压。

P2是采用微负压，-5~-20pa）•2.1良好的实验室规范•CAR-T 细胞制剂制备场所按照不同工艺应至少包括质粒制备区、病毒制备区、细胞制备区，质控区（支原体测定、内毒素测定、流式细胞仪检测和分子生物学等相关检测）和储存区（病毒储存区、细胞储存区），各个区域应相对独立。

病毒制备区、病毒储存区应具有独立的空调系统。

•载体的制备应在C 级背景下A 级洁净度级别的环境中进行，载体在非密闭CAR-T 细胞制剂制备过程中与细胞有关的操作，如细胞分离、转导/转染、扩增、收获等应在非密闭条件下的操作应在B 级背景下A 级洁净度级别的环境中进行。

•一般而言，没有必要使用患者的血液来制备用于非临床研究的CAR-T细胞产品;相反，可以使用源自健康供体的CAR-T细胞。

一个验证的概念，使用动物源性产品的替代品的研究也应该发挥辅助作用。

•鉴于CAR-T细胞产品制备过程的特殊性，应提供完整的质量分析报告和测试样品的稳定性研究数据。

稳定性研究应涵盖所有剂量浓度，并应在给予动物之前模拟所有运输过程和治疗操作。

如果在给药前需要诸如复苏和再悬浮的治疗操作，则在给予动物之前应至少测试细胞形态，活细胞总数，细胞活力，颜色和外来物质。

•目前，免疫缺陷小鼠的移植肿瘤模型被用于研究CAR-T细胞对肿瘤的抑制作用。

对于靶向淋巴细胞白血病或淋巴瘤的CAR-T细胞，人源细胞系（例如，Raji，Daudi，Nalm-6和Jeko-1）或呈现特定靶标的稳定的基因修饰细胞系（例如，CD19-K562和CD20-K562）可用于在免疫缺陷啮齿动物中建立移植的淋巴瘤模型。

研究CAR-T细胞药效学最直接的方法是使用生物发光成像（BLI）技术检测表达荧光素酶的肿瘤细胞。

•CAR-T细胞的药代动力学研究主要集中在它们的体内增殖，分布和持久性上。

可选技术包括成像技术，流式细胞术，免疫组织化学，定量聚合酶链反应（PCR）技术等。

不同的方法适用于不同的样品和测试目的。

该成像方法可以在视觉上检测CAR-T细胞的体内分布;它需要细胞标记，如放射性同位素标记，遗传修饰标记（如绿色荧光蛋白或荧光素酶）或纳米颗粒标记（例如，铁-葡聚糖纳米颗粒）。

•流式细胞术可以检测动物血液，骨髓和脾脏中的CAR-T细胞。

免疫组化方法可以检测脾脏和其他器官中的CD3+细胞或CAR+细胞，从而揭示人体T细胞在器官中的分布和积累。

Q-PCR方法可以检测所有类型样品中来自人源CAR-T细胞的DNA或RNA水平。

目前，已经开发了某些其他技术，例如原位杂交，以检测CAR-T细胞的组织分布。

致癌风险细胞因子释放综合征（CRS ）B 细胞耗竭神经毒性对肿瘤细胞的清除过程伴随着大量细胞因子的释IL-6R 单抗药物阻断免疫系统的理。