南通地区630例外周血15个遗传性耳聋基因突变位点筛查分析

我国耳聋发病率为0.1%~0.3%[1-2]，新生儿先天性耳聋发病率为1‰~3‰，其中一半以上由遗传因素所致[3]。

此外，我国每年药物性耳聋和迟发性耳聋导致约3万儿童听力障碍[4]，这意味听力正常夫妇如果携带致聋基因，也面临生育聋儿的风险[5]。

本研究采用微量、快速、高通量芯片检测技术，对2017年11月—2018年5月在我院产科门诊就诊的606例孕妇和耳鼻喉科就诊的24例患者进行遗传性耳聋常见的4个基因中15个位点进行检测，旨在实现对耳聋基因突变者的早发现、早治疗及生育指导。

1　资料与方法1.1　一般资料　孕妇606例，年龄25~35岁，平均28±3.0岁。

24例耳鼻喉科门诊就诊患者，其中男性1例，女性23例，年龄8个月~56岁，均以听力问题就诊。

受检者认真阅读并签署知情同意书。

1.2　方法1.2.1　DNA 提取：EDTA 抗凝管采集5~6 mL 外周静脉血，共收集630份血液样品。

采用血液基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，用紫外分光光度计测定DNA 浓度，浓度控制在8 ng/μL，样本保存于-20 ℃冰箱中待检，如长期保存则需置于-80 ℃冰箱。

1.2.2　PCR 扩增：按照被检样品数的3倍准备离心管，在管上标记体系编号和样品编号。

将PCR 扩增试剂A、B、C分装入各管中，每管20 μL，并加入5 μL DNA与其混合。

瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR总反应时间约4 h 20 min。

1.2.3　芯片杂交：采用15项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（微阵列芯片法）检测中国人群中常见的4个耳聋相关基因的15个突变位点。

从A、B、C 3个PCR体系中按顺序吸取20 μL PCR产物，混合。

准备结合缓冲液与磁珠混合液，并向每个样本中加入30 μL。

混匀后静置10 min，让磁珠捕获产物。

弃上清，加入NaOH 0.1 moL/L 100 μL，混匀后静置10 min予以碱变性。

最后弃上清，加入杂交缓冲液，将磁珠混匀后，点在芯片上，进行60 min杂交。

1.2.4　洗片与干燥：将芯片放到洗干仪中，进行2次清洗，最后离心干燥。

1.2.5　芯片扫描：使用芯片扫描仪和相关软件进行结果判读。

软件可一次性扫描判读15个位点，即GJB2基因35 del G、176_199 del 16、235 del C、299_300 del AT，GJB3基因 538C>T、SLC26A4基因IVS7-2 A>G、2168 A>G、1174 A>T、1226 G>A、1229 C>T、IVS15+5 G>A、1975 G>C、2027 T>A，线粒体12SrRNA 基因1494C>T、1555A>G。

芯片上点制了质控探针和15个位点的野生型和突变型探针，若某位点仅有其野南通地区630例外周血15个遗传性耳聋基因突变位点筛查分析施　健（南通大学附属医院酶学研究室，江苏226001）[摘　要]　目的：通过对遗传性耳聋基因高频突变位点进行筛查分析，为南通地区遗传性耳聋的防治提供参考。

方法：采集产科门诊孕妇606例以及因耳聋、听力障碍于耳鼻喉科门诊就诊患者24例共630例血液样本，采用微阵列基因芯片法进行遗传性耳聋常见的4个基因15个位点的检测。

结果：630例样本中显示耳聋基因突变者为48例，突变率为7.62%，其中两个不同基因同时发生突变1例，以及同一个基因两个位点同时发生突变1例。

包括GJB 2基因突变率为3.33%，其中杂合突变19例、纯合突变2例；SLC26A4基因突变率为3.02%，其中杂合突变18例、纯合突变1例；线粒体12S rRNA基因均质或异质突变5例（突变率为0.79%）；GJB3基因杂合突变1例（携带率为0.16%）。

孕妇样本阳性率为5.78%，耳鼻喉科患者样本阳性率为54.2%。

结论：遗传性耳聋基因筛查可以有效筛查出听力正常人群中的携带者，指导其婚育。

在听力损失人群中进行筛查，可以明确一部分病因，为患者及其家族成员提供遗传咨询和指导。

[关键词]　遗传性耳聋；基因突变；携带人群；微阵列芯片法[中图分类号]　R764.43 [文献标志码]　B [DOI]　10.19767/ki.32-1412.2019.03.005[文章编号] 1006-2440[2019]03-0228-04·论著与经验交流·生型位置出现信号，且达到CUTOFF值，则判读该位点为野生型；若野生型和突变型位置都出现信号，且达到其各自CUTOFF值和相应比值，则判读该位点为杂合突变型或异质突变型；若某位点仅有突变型位置出现信号，且达到CUTOFF值，则判读该位点为纯合突变型或均质突变型。

检测结果用“通过”或“未通过”形式表述，其中任何一个位点有突变均视为“未通过”，咨询人员重点对“未通过”受检者进行电话随访，并提供耳聋专科门诊咨询及临床干预。

2　结　果2.1　所有样本耳聋基因突变筛查结果　630例血样中显示耳聋基因突变48例，突变率为7.62%，其中两个不同基因同时发生突变1例，以及同一个基因两个位点同时发生突变1例。

包括GJB 2基因突变率为3.33%，其中杂合突变19例、纯合突变2例；SLC26A4基因突变率为3.02%，其中杂合突变18例、纯合突变1例；线粒体12S rRNA基因均质或异质突变5例（突变率为0.79%）；GJB3基因杂合突变1例（携带率为0.16%）。

见表1。

表1　耳聋基因筛查各位点突变率（n=630）检测基因突变位点突变例数突变率(%) GJB235delG00176_199del16 20.32235delC10 1.59299_300delAT9 1.43GJB2合并SLC26A4299_300d e l A T、IVS7-2 A>G10.16GJB3538C>T10.16 SLC26A42168 A>G30.48 IVS7-2 A>G14 2.221174A>T001226G>A10.161229C>T00IVS15+5G>A001975G>C002027T>A10.16IVS7-2 A>G复合1174 A>T10.16线粒体12S rRNA 1494 C>T20.32 1555 A>G30.482.2　耳鼻喉科就诊患者耳聋基因突变筛查结果　24例耳鼻喉科就诊患者性别、年龄、具体就诊原因以及耳聋基因突变筛查结果见表2。

24例中检出阳性结果13例，阳性率为54.2%，其中纯合突变和复合杂合突变共4例，可以通过基因检测结果确诊病因。

各位点突变情况见表3。

表2　耳鼻喉科就诊患者基本信息及筛查结果编号 性别 年龄 就诊原因 筛查结果1男1岁聋儿IVS7-2 A>G杂合、1174A>G杂合2女8月听力弱 235del C 杂合3女1岁听力下降正常4女42岁听力下降正常5女35岁听力下降正常6女47岁听力下降正常7女23岁听力减退正常8女27岁听力减退正常9女2岁聋儿299del AT 纯合10女29岁听力下降正常11女11月聋儿IVS7-2 A>G纯合12女2岁聋儿IVS7-2 A>G杂合13女5岁听力障碍正常14女5岁聋儿IVS7-2 A>G杂合15女1岁聋儿235del C 杂合16女7岁聋儿235del C纯合17女11岁听力减退176del 16杂合18女28岁听力减退正常19女25岁听力弱正常20女52岁听力减退正常21女56岁聋人IVS7-2 A>G杂合22女5岁听力弱IVS7-2 A>G杂合、299delAT杂合23女25岁聋人299del AT 杂合24女27岁聋人2168 A>G杂合表3　耳鼻喉科就诊患者各位点突变情况突变基因突变位点例数GJB2176_199del16杂合突变1235delC杂合突变2235delC纯合突变1299_300delAT杂合突变1299_300delAT纯合突变1 SLC26A42168 A>G杂合突变1IVS7-2 A>G杂合突变3IVS7-2 A>G纯合突变1双杂合299_300delAT、IVS7-2 A>G杂合突变1复合杂合IVS7-2 A>G、1174 A>T杂合突变12.3　孕妇耳聋基因突变筛查结果　本次筛查产科孕妇样本606例，检出阳性结果35例，阳性率为5.78%。

其中线粒体阳性5例。

基于线粒体突变的母系遗传方式，检出一人则至少可提示其10位母系家族成员禁用氨基糖苷类药物。

3　讨　论国内耳聋分子流行病学调查显示，绝大部分非综合征型耳聋患者由四个基因突变引起的：GJB2、SLC26A4、线粒体DNA 12S rRNA和GJB3[6-10]，最常见的突变基因是GJB2，在我国由该基因突变造成先天性耳聋约占21%，其次致聋基因是SLC26A4基因（占比近20%）和线粒体12SrRNA 1555 A>G突变（占1%~2%）[11-12]。

遗传性耳聋患者在择偶时避免选择与自己相同致聋基因的聋哑人，可以有效降低生育聋儿的风险。

例如，目前约21％耳聋者是GJB2相关性耳聋，如果GJB2相关性耳聋患者之间婚配，他们生育的下一代100%是聋儿，如果在其余79%耳聋者，即非GJB2相关性耳聋者中选择配偶，其生育聋儿的风险将大大降低。

目前致聋基因诊断技术可为约60%遗传性耳聋患者做出病因诊断，要尽量避免相同耳聋基因耳聋者间的婚配，以减少聋儿的出生。

GJB2基因突变是我国非综合征型感音神经性耳聋的主要致病基因[13-14]，表现为隐性遗传，包括GJB2基因纯合突变、复合突变导致的耳聋。

本次筛查出GJB2基因杂合突变，提示该受检者可能为携带者，虽不发病但可能将此基因遗传给后代，若有听力异常，则建议进行进一步的基因测序，排除其它位点有无突变。

在排除其他基因位点突变的情况下，两个GJB2基因杂合突变携带者婚配后生育听障儿童的概率有25％。

如果为GJB2单基因复合杂合突变或纯合突变，则提示患者为先天性耳聋。

由于GJB2基因突变的特性，符合人工耳蜗移植的条件，在出生后18个月内即可进行人工耳蜗的移植，避免由聋致哑。

目前无特效药物治疗,以助听器和电子耳蜗治疗为主。

GJB3基因编码连接蛋白31，突变造成的耳聋为常染色体显性或隐性遗传，听力呈进行性下降[15]。

听力异常的常染色体显性遗传的非综合征患者，有50%的几率向下一代遗传。

文献报道，GJB3基因538 C>T在中国耳聋患者中有一定的检出率[16]。

常染色体隐性遗传的GJB3基因538 C>T杂合突变的携带者，要避免与其他致聋基因携带者婚配，如GJB2基因与GJB3基因双杂合突变也可导致耳聋的发生[17]。