Ca_2_对节旋藻生长和光合色素含量的影响_陈瑾

Ca 2+对节旋藻生长和光合色素含量的影响陈瑾，王素英，孙宏，董世瑞*天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134摘要：为探讨Ca 2+对节旋藻生物量、叶绿素、类胡萝卜素及藻胆蛋白含量的影响，本实验以节旋藻TJSD091藻株为研究对象，在AB 液体培养基中加入不同浓度的Ca 2+，在TJSD091藻株的快速生长期末测定生物量、叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白的含量。

结果表明：当Ca 2+浓度在0.02 g/L 时藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的浓度最高，分别为7.607和5.608 mg/L ；当Ca 2+浓度在0.06 g/L 时生物量、叶绿素、类胡萝卜素含量较低，分别为A 560 nm =0.789、5.149、0.193 mg/L ；当Ca 2+浓度在0.08 g/L 时生物量、叶绿素和类胡萝卜素含量处于较高值，分别为A 560 nm =1.193、16.13、0.257 mg/L 。

方差分析表明，Ca 2+浓度对节旋藻TJSD091藻株的生end of showed that the concentration of Ca 2+ had a significant effect on the biomass and the contents of chlorophyll, carotenoid and phycobiliprotein (p <0.05).Key words: Ca 2+, Arthrospira , biomass, chlorophyll, carotenoid, phycobiliprotein节旋藻属蓝藻门、颤藻科、节旋藻属，是由单细胞或多细胞组成的螺旋形原核生物[1]。

其营养丰富，蛋白质含量为60%~70%[2-3]，主要是藻胆蛋白，包括藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)及藻红蛋白(PE)。

节旋藻还含有人体必需氨基酸、多糖、维生素、类胡萝卜素和藻 收稿日期:作者简介: 陈瑾（1991年—），女，硕士研究生，研究方向：微生物资源开发与利用。

*为通讯作者基金项目: 国家自然科学基金项目（31270050）;天津市教委高等学校科技发展基金计划项目（20130624）；天津市高等学校创新团队（TD12-5049） 网络出版时间：2016-01-10 14:19:13网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20160110.1419.004.html蓝素等多种生物活性物质[4]，被用作膳食补充剂，是人类理想的食物和药物。

Ca2+作为普遍的信号传导因子,在细胞的分裂、生长和死亡过程中起着重要作用，能够影响细胞壁的胞间层[5]，还能稳定细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白，调控细胞内各种生化过程[6-9]。

赵联芳等[10]设置不同水平的Ca2+浓度研究其对铜绿微囊藻和斜生栅藻生长的影响，发现铜绿微囊藻的生物量随着Ca2+浓度的升高而降低，而斜生栅藻的生物量变化规律不明显。

Ca2+作为节旋藻培养基中重要的无机元素对于节旋藻的生长必不可少，但未见Ca2+对节旋藻天然色素和藻胆蛋白含量的影响相关的研究报道。

本文旨在研究不同浓度的Ca2+对节旋藻的天然色素及藻胆蛋白含量的影响，为生产上合理使用Ca2+及开发相关富钙节旋藻产品提供依据。

1 材料与方法1.1 材料与仪器藻株：Arthrospira sp. TJSD091为课题组自天津滨海湿地分离纯化的纯培养藻株。

节旋藻培养基为AB培养基[11]，配方及配制方法如下：将993 mL蒸馏水分三份用于溶解A、B、C，PIV 6 mL，A5 1 mL。

其中A：NaHCO3 13.61 g，Na2CO3 4.03 g，KH2PO4 0.5 g，NaNO3 2.5 g；B：K2SO4 1 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g；C：CaCl2·2H2O 0.04 g;A5(g/L)：H3BO3 2.86，MnCl2·4H2O 1.81，ZnSO4·7H2O 0.22，MnSO4·7H2O 2.50，CuSO4·5H2O 0.074，Na2MoO4 0.021；PIV(g/L)：Na2EDTA 0.750，FeCl3·7H2O 0.097，MnCl2·4H2O 0.041，ZnCl2 0.005，CoCl2·6H2O 0.002，Na2MoO4·2H2O 0.004。

按照配方称量药品，相应蒸馏水溶解，121 ℃灭菌20 min后，静置，待液体温度恢复至室温时，将A、B、C混合并加入相应体积的PIV 和A5，摇匀即可。

以上试剂均为国产分析纯试剂。

仪器：754型紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Scientz--IID型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；MGC-250型智能型光照培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；ECLIPSE Ci-L型科研显微镜尼康映像仪器销售有限公司1.2 实验方法1.2.1 节旋藻TJSD091的培养将藻种按10%的比例接种于200 mL AB培养基中扩大培养。

℃℃，光照强度3000 lx，每日早中晚各摇匀一培养条件：光暗周期12 h/12 h，温度32 /28次，培养14 d至快速生长期末。

实验设定十个Ca2+浓度梯度，即0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18和0.20 g/L，每个梯度三个重复。

1.2.2 节旋藻形态记录 生物显微镜测定并记录节旋藻细胞宽度、螺径和螺距。

1.2.3 生物量测定紫外分光光度计测定藻液在560 nm处的吸光度值。

1.2.4 叶绿素浓度的测定 取4 mL藻液8000 r/min离心15 min，弃上清，加入4 ml无水乙醇振荡摇匀后，4 ℃冰箱保存24 h，5000 r/min离心15 min，取上清液测定665 nm和649 nm 处的OD值，根据公式计算叶绿素浓度[12]：叶绿素浓度(mg/L)=13.70OD665-5.76OD649注：公式中的系数单位为mg/L。

1.2.5 类胡萝卜素浓度的测定 取藻液30 mL，过滤，将藻丝重新悬浮于20 mL蒸馏水中，反复冻融三次使藻细胞完全破碎。

将藻液加蒸馏水定容至25 mL，混匀。

取2.5 mL液体，置于50 mL离心管中，加入22.5 mL无水丙酮，加塞，避光放置30 min以提取色素。

溶液经滤纸过滤，滤液即为光合色素提取液，测定其在440 nm、644 nm和662 nm处的OD值，根据公式计算类胡萝卜素浓度[13]：类胡萝卜素浓度(mg/L)=4.7×OD440-(1.38×OD662+5.48×OD644)注：公式中的系数单位为mg/L。

1.2.6 藻胆蛋白浓度的测定 取藻液30 ml，经1500目筛绢过滤，用20 ml磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH6.8）冲洗藻丝使其重悬浮，-20 ℃冷冻1 h后置于43 ℃水浴锅中10 min，反复冻融三次使细胞完全破碎，经超声波细胞粉碎机破碎5 min ，室温下6000 r/min 离心5 min ，取上清液测量其在652 nm 和615 nm 处的OD 值，根据公式计算藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的浓度[13-14]：藻蓝蛋白浓度(mg/L)=(OD 615-0.208OD 652)/5.34别藻蓝蛋白浓度(mg/L)=(OD 652-0.208OD 615)/5.09注：公式中的系数单位为mg/L 。

1.2.7 数据处理 应用SPSS16.0软件进行ANOV A 方差分析。

2 结果与讨论2.1 Ca 2+浓度对细胞形态的影响表1为节旋藻在不同浓度的Ca 2+条件下的细胞宽度、螺径及螺距记录表。

从表中可以看出，当Ca 2+浓度低于0.04 g/L 时，节旋藻的细胞宽度、螺径和螺距均随Ca 2+浓度的增加而增加；当Ca 2+浓度在0.04~0.06 g/L 时，随着Ca 2+浓度的升高，三者有所下降；当Ca 2+浓度在0.06~0.08 g/L 时，螺径和螺距均呈上升趋势，而细胞宽度略微下降；当Ca 2+浓度在0.08~0.10 g/L 时，螺径和螺距略微减小，但细胞宽度增加；当Ca 2+浓度在0.10~0.12 g/L 时，藻细胞宽度减小，而螺径和螺距增加；当Ca 2+浓度超过0.12 g/L 时，螺径和螺距随Ca 2+浓度的增加而持续下降。

对于藻细胞宽度，当Ca 2+浓度在0.12~0.16 g/L 时，细胞宽度增加；而当Ca 2+浓度在0.16~0.20 g/L 时，细胞宽度减小。

三者的方差分析均为显著。

总体来说，节旋藻螺径和螺距的变化趋势相同，二者同细胞宽度的变化趋势略有不同。

钙作为节旋藻生长过程中所需的营养素，是构成细胞的重要物质。

另外，Ca 2+会使细胞膜厚度变薄。

因此当Ca 2+浓度低于0.04 g/L 时，满足节旋藻的生长需要，细胞宽度增加；而超过所需浓度后对细胞膜造成伤害，细胞壁也不稳定，所以藻细胞宽度变小；随着细胞外Ca 2+浓度的增加，通过胞内钙信号系统感受浓度变化，从而调节Ca 2+浓度回到正常水平，此时细胞宽度再次增加，超过某一范围时钙信号系统发挥调节作用。

另外，节旋藻的形态特征与环境因子和光照辐射有关系。

低浓度Ca 2+(<0.04 g/L)范围内，随着Ca 2+浓度增加，藻体生长，螺径和螺距增加；当Ca 2+浓度继续增加，藻体生长受到抑制，所占空间体积缩小，此时螺径和螺距明显缩短。

随着抑制的解除，藻体再次生长，螺径和螺距随之增加，到达一定量时，由于藻体之间互相产生遮挡，影响对营养物质和光照的吸收，所以生物量降低，而节旋藻的螺径和螺距也在下降。

而Ca 2+浓度超过0.12 g/L 时，没有出现再次上升的现象。

由于节旋藻螺旋结构的变化与诸多因素有关，也可能通过光合作用而影响形态特征，具体的原因需要进一步的实验验证。

表1 Ca 2+浓度对细胞形态的影响(μm)Table 1 Effect of concentrations of Ca 2+ on cell morphology(μm)注：图中标注不同字母(a 、b 、c 等)的均值间差异显著(p <0.05)。

Ca 2+浓度(g/L)0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 细胞宽度 3.68±0.03f 4.60±0.02c4.11±0.02d 3.50±0.02g5.52±0.01a 4.16±0.06d 4.55±0.00c 4.73±0.04b 4.16±0.04d 3.90±0.02e 螺径 9.92±0.10e 12.15±0.11a9.03±0.12h 10.50±0.15d 9.75±0.10f 11.37±0.11b 11.05±0.11c 10.09±0.12e 9.24±0.08g 8.55±0.12i 螺距 31.11±0.01c31.69±0.02b 19.29±0.01h 26.45±0.02e 26.14±0.03f 33.55±0.02a 28.79±0.02d 26.55±0.02e 21.84±0.02g 17.09±0.02i2.2 不同浓度钙离子对节旋藻生物量的影响不同Ca 2+浓度条件下节旋藻在560 nm 处的吸光值见图1。