叶绿体色素含量的测定

叶绿体色素含量的测定

----分光光度法

中文摘要：

本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。

英文摘要：

In this experiment , we used spinach leaves as raw material and used 80% of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment. 实验原理：

利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。

根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。

实验目的：

掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。

实验器材和试剂：

1、材料：菠菜叶片

2、用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等

3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙

实验步骤：

1.叶绿体色素的提取

取新鲜菠菜叶片0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。

2.吸光度的测定

取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。

3.结果计算

依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。

计算公式

80%丙酮提取液中色素浓度的计算

Ca （叶绿素a ）=12.2A663-2.81A646

Cb （叶绿素b ）=20.13A646-5.03A663

CT （叶绿素）=Ca+Cb=17.32A646+7.18A663

Cx.c （类胡萝卜素）=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229

叶绿体色素含量=

Ca （叶绿素a ）=12.2×0.817-2.81×0.420=8.7872mg/L

Cb （叶绿素b ）=20.13×0.420-5.03×0.817=4.3451mg/L

CT （叶绿素）=Ca+Cb=13.1323mg/L

Cx.c （类胡萝卜素）=(1000×0.840-3.27×8.7872-104×4.3451)/229=1.5693mg/L

Ca （叶绿素a ）含量=8.7872mg/L ×0.05L ×1/0.5g=0.8787=87.87mg/g

Cb （叶绿素b ）含量=4.3451mg/L ×0.05L ×1/0.5g=0.4345=43.45mg/g

Cx.c （类胡萝卜素）含量=1.5693mg/L ×0.05L ×1/0.5g=0.1569=15.69mg/g

实验讨论：

1. 叶绿素a 、b 在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？

定量分析的吸收峰必须要稳定，还要有强的吸收。另外，还需要考虑干扰的问题。光合色素除了叶绿素外还有类胡萝卜素，类胡萝卜素主要吸收蓝光，为了排除干扰，要选用红光。

2．为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？

在植物缺水时，植物体中的叶绿素含量会降低。干材料与新鲜材料相比水分含量较少，用无水丙酮提取不如80%丙酮下提取效果好。

）或积，样品鲜重（或干重、面稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（21.m g L L mg ⨯⨯-

叶绿素的提取除了丙酮也可以用其他的提取试剂，石油醚—乙醇、乙醚—乙醇、乙醚。

从菠菜叶中提取叶绿体色素时，用丙酮研磨法提取叶绿素的效率比石油醚．乙醇萃取法高，乙醚研磨法提取叶绿素的效果明显不如丙酮，用石油醚研磨法的效果最次，这表明最佳的提取剂为丙酮，其次为石油醚一乙醇。但用混合溶剂提取的叶绿素的纯度要比用单一溶剂提取的高，生产中可根据实际需求进行合理选用。

不同有机溶剂用直接浸提法和Arnon法从菠菜叶片中提取叶绿素的效率不同。有人做过此类提取实验，结果表明,用丙酮、乙醇浸提法提取叶绿素的效率比丙酮、乙醇Arnon法高,甲醇、乙醚浸提法提取叶绿素的效果明显不如丙酮-乙醇,而丙酮与乙醇等摩尔混合液浸提又比丙酮-乙醇液单独浸提的效率略高。

参考文献：

张素霞.菠菜叶中叶绿素提取工艺研究. 中国食物与营养

洪法水魏正贵赵贵文.菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应.应用化学