实验三 叶绿体色素的提取
叶绿素的提纯实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解叶绿素的结构和性质。
2. 掌握叶绿素的提取和提纯方法。
3. 学习利用有机溶剂提取叶绿素，并通过色谱法进行分离和纯化。
二、实验原理叶绿素是绿色植物中进行光合作用的重要色素，主要由叶绿素a和叶绿素b组成。
叶绿素不溶于水，但可溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。
通过提取和提纯，可以得到高纯度的叶绿素，为进一步研究其性质和作用提供条件。
实验过程中，首先将植物叶片用有机溶剂提取叶绿素，然后通过层析法分离叶绿素和其他色素，最后收集纯化的叶绿素。
三、实验器材1. 新鲜植物叶片（如菠菜、青菜等）2. 研钵、研杵3. 乙醇、丙酮（分析纯）4. 层析柱、层析板5. 滤纸、脱脂棉6. 移液管、滴管7. 恒温水浴锅8. 显微镜9. 紫外-可见分光光度计四、实验步骤1. 提取叶绿素（1）取新鲜植物叶片，用剪刀剪碎，放入研钵中。
（2）加入适量乙醇和丙酮（体积比1:1），研磨至匀浆。
（3）将匀浆倒入分液漏斗，静置分层。
（4）收集有机层，用无水硫酸钠干燥。
（5）过滤，得到叶绿素提取液。
2. 分离叶绿素（1）将层析板放入层析柱中，在底部铺一层脱脂棉。
（2）取适量叶绿素提取液，用移液管滴加于层析板上，确保液面低于层析板边缘。
（3）选择合适的溶剂系统，如正己烷-乙酸乙酯（体积比4:1）。
（4）将溶剂滴加于层析板上，观察层析过程，直至溶剂前沿到达预定位置。
（5）取出层析板，用铅笔标记层析结果。
3. 收集纯化叶绿素（1）用移液管收集叶绿素层，倒入小烧杯中。
（2）加入少量乙醇，搅拌均匀。
（3）用滤纸过滤，收集滤液。
（4）将滤液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅蒸干。
（5）用少量乙醇溶解残留物，得到纯化叶绿素。
五、实验结果与分析1. 叶绿素提取：通过有机溶剂提取，可以得到绿色叶片提取物，表明叶绿素已从植物叶片中提取出来。
2. 叶绿素分离：通过层析法，可以将叶绿素与其他色素分离，证明叶绿素具有独特的性质。
3. 叶绿素纯化：通过蒸发和溶解，可以得到纯化的叶绿素，说明实验过程中叶绿素得到了有效的纯化。
实验三叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定.ppt
×100%
样品重量（mg）×1000
▪ 稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1
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实验报告
▪ 1.试述叶绿体色素的吸收光谱特点及生理意 义。
▪ 2.在皂化反应中加入乙醚有什么作用？
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理化性质测定
▪ 将上一个实验中提取的 叶绿体色素溶液适当稀 释后，进行以下实验：
▪ 1.荧光现象的观察。 ▪ 取l支试管加入浓的叶
绿体色素提取液，在直 射光下观察溶液的透射 光与反射光颜色有何不 同，可观察到反射出暗 红色的荧光。
▪ 2.氢和铜对叶绿素分子中镁 的取代作用
▪ 方法一；取两支试管。第 一支试管加叶绿体色素提取 液2mL，作为对照。第二支 试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇 匀，观察溶液颜色变化。当 溶液变竭后，再加入少量醋 酸铜粉末，微微加热，观察 记录溶液颜色变化情况，并 与对照试管相比较。解释其 颜色变化原因。
▪ 叶绿素中的镁可以被氢 离子所取代而成褐色的 去镁叶绿素。去镁叶绿 素遇铜则成为铜代叶绿 素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏，故常 用此法制作绿色多汁植 物的浸渍标本。
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实验步骤(1)
▪ 根据朗伯一比尔定律，某有 ▪ 今欲测定叶绿体色素混合
色溶液的吸光度D与其中溶 液浓度C和液层厚度L成正 比，即：
的水分）和流动相（有 的盐，产生的盐能溶
机推动剂）间具有不同 的分配系数，所以移动 速度不同，经过一定时 2021间/3/4后，可将各种色素分 开。
于水中，可用此法将 叶绿素与类胡萝卜素 分开。
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实验原理
▪ 叶绿素与类胡萝卜素都具有 光学活性，表现出一定的吸 收光谱，可用分光光度计精 确测定。叶绿素吸收光量子 而转变成激发态，激发态的 叶绿素分子很不稳定，当它 变回到基态时可发射出红光 量子，因而产生荧光。叶绿 素的化学性质很不稳定，容 易受强光的破坏，特别是当 叶绿素与蛋白质分离以后， 破坏更快，而类胡萝卜素则 较稳定。
实验三 叶绿体中色素的提取和分离
叶绿体中色素的提取和分离方案一【实验原理】（1）叶绿体中的色素能够溶解在有机溶剂丙酮中，所以，可以通过研磨法用丙酮提取叶绿体中的色素(若无丙酮亦可用酒精代替)。
（2）纸层析法：层析液（在60℃～90℃下分馏出来20份石油醚+ 2份丙酮+ 1份苯混合而成）是一种脂溶性很强的有机溶剂。
叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同(溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。
)这样，几分钟之后，叶绿体中的色素就在扩散过程中分解开来。
所以，可以用纸层析法分离出叶绿体中的色素。
【实验器材】新鲜的绿色菠菜叶片，干燥的定性滤纸，烧杯，研钵，小玻璃漏斗，脱脂棉，载玻片，剪刀，小试管，培养皿盖，药勺，量筒，天平。
丙酮，层析液，二氧化硅，碳酸钙。
【实验过程】（一）提取绿色叶片中的色素：1、用天平称取5g绿色的叶片，用剪刀剪碎，放入研钵中；2、向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，再加入5ml丙酮。
由于丙酮具有一定的毒性并且很容易挥发。
为了尽量少的吸入丙酮，可以将一片滤纸盖在研钵上，纸的中心穿一个洞，将杵棒套入洞口进行研磨。
※为什么要加入少许少许二氧化硅和碳酸钙？加入二氧化硅是为了研磨的更充分；加入少许碳酸钙是为了保护叶绿体中的色素，为是由于碳酸钙可以中和液泡破裂后释放出的有机酸，调节液体的PH，防止或避免色素被破坏。
※为什么要加入丙酮？丙酮是有机溶剂可以使色素溶解其中，作为色素的溶剂。
3、将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤（漏斗基部放一小团脱脂棉）。
将滤液收集到一个小试管中，及时用塞将试管口塞紧。
（以防止滤液中的丙酮挥发）※是否可以用滤纸来代替脱脂棉？不可以，滤纸对光合色素具有较强的吸附能力，使滤液的色素分子减少。
（二）制备滤纸条：取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm、宽1cm的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，并在距这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。
※在剪裁定性滤纸时，尽量注意双手不要接触纸面，以免手上的油脂或其他脏物污染滤纸，影响色素在纸条上的扩散。
叶绿体色素提取与分离实验
类胡萝卜素 50
叶绿素b 叶绿素a
0
波长
二、捕获光能的色素和结构
（一）捕获光能的色素
色素
叶绿素a （蓝绿色）
叶绿素 叶绿素b
（黄绿色） 含量约占3/4
类胡萝卜素
叶黄素 （黄色） 胡萝卜素 （橙黄色）
含量约占卜素主 要吸收蓝紫光
叶绿素主要吸收 红光和蓝紫光
课堂检测
1、在叶绿体色素的提取和分离实验中在滤纸条上扩散速度 最快的色素是（ ） A、叶绿素a B、叶绿素b C、胡萝卜素 D、叶黄素
4、在圆形滤纸的中央点上，对叶绿体的色素进行色素分析， 会得到近似，同心的四个色素环，排到在最里圈的色素是 （） A、橙黄色 B、蓝绿色 C、黄色 D、黄绿色
练习
1、在植物实验室的暗室内，为了尽可能地降
低植物光合作用的强度，最好安装（ B）
A、红光灯 B、绿光灯 C、白炽灯 D、蓝光灯
2、为提高大棚蔬菜的产量，哪项措施更有效
5、下图是叶绿体色素的提取与分离实验中所用的材料与用具。请回答： 分别在A、B、C三个研钵中加入2克菠菜，经研磨、提取得到三种颜色的溶液： 深绿色、黄绿色（或褐色）、几乎无色。注：“+”表示加，“—”表示不加。
处理 二氧化硅（少量） 碳酸钙（少量） 95%乙醇（10ml） 蒸馏水（10ml）
ABC +++ —+ + + —+ —+ —
（ D）
A、安装红色透光薄膜 B、安装蓝紫色透光薄膜
C、安装绿色透光薄膜 D、安装无色透光薄膜
练习
3．在圆形滤纸的中央点上粘叶绿体的色素滤液， 进行色素分析，会得到近似同心环状的四个色素圈，
排在外圈的色素呈 [ A]
实验3叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
实验3叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定实验三叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体⾊素⼜称光合⾊素，在⾼等植物中可分为叶绿素和类胡萝⼘素两⼤类，前者包括叶绿素a（蓝绿⾊）和叶绿素b（黄绿⾊），后们类囊体膜上的蛋者包括胡萝⼘素（橙⾊）和叶黄素（黄⾊），它与⽩质结合形成⾊素蛋⽩复合体，不溶于⽔，易溶于酯，因此可⽤丙酮、⼄醇、⽯油醚等有机溶剂进⾏提取。
叶绿体⾊素的分离有多种⽅法，本实验仅介绍纸层析法。
层析的基本原理：在分离过程中，由⼀种流动相（即⼀种液体或⽓体）带动着试样经过固定相（⼀种⽀持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当⽤适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过⼀定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合⾊素中各种⾊素分⼦的吸附程度不同，以及这些⾊素分⼦在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动⾊素分⼦向四周移动时，各种⾊素分⼦沿纸扩散的速度也就不同，使混合⾊素分离，出现不同颜⾊的环。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿⾊，在反射光下呈这现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红⾊，种发态，激发态的叶樱桃红⾊，是因为叶绿⾊分⼦吸收光能后处于激状绿素分⼦很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量⼦。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、⾼温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋⽩质分离以后，破坏更快，⽽类胡萝⼘素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代⽽成褐⾊的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）⼜被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐⾊转变成蓝绿⾊，铜代叶绿素很稳定，且⽐原来的绿⾊还要稳定些，在光下也不易被破坏。
设备试剂】【材料、与1. 材料新鲜的菠菜或⼩⽩菜等其他绿⾊植物叶⽚。
2. 设备电⼦天平、研钵、烧杯、量筒、培养⽫、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪⼑、圆形滤纸、⼩漏⽃等。
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质一、提取与分离1、实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。
如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。
流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤（1）色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。
加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。
Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。
实验三叶绿体色素的提取分离和性质分析
实验三叶绿体色素的提取分离和性质分析实验三是关于叶绿体色素的提取、分离和性质分析的实验。
下面将详细介绍该实验的步骤和结果。
一、实验目的：1.了解叶绿体色素的结构和功能。
2.学习叶绿体色素的提取、分离和性质分析方法。
二、实验步骤：1.叶绿体的提取：a.从植物叶片中剪取一小块，放入离心管中。
b.加入适量的提取缓冲液，如PBS缓冲液。
c.用离心机将离心管离心10分钟，以沉淀叶绿体。
d.轻轻将上清液倒掉，保留叶绿体。
2.叶绿体色素的分离：a.将提取得到的叶绿体放入离心管中。
b.加入适量的叶绿体破碎缓冲液，如酒精和醋酸的混合液。
c.用离心机将离心管离心10分钟，使叶绿体破碎。
d.轻轻将上清液倒掉，保留叶绿体破碎液。
3.叶绿体色素的性质分析：a.取另一只离心管，加入适量的乙醇。
b.将提取得到的叶绿体色素溶液加入离心管中。
c.用离心机将离心管离心5分钟，观察上层液体的颜色变化。
三、实验结果：通过以上实验步骤，成功提取和分离了叶绿体色素，并进行了性质分析。
叶绿体的提取过程中，使用了PBS缓冲液来帮助离心分离叶绿体。
离心过程中，叶绿体被沉淀到离心管底部，上清液中几乎没有叶绿体。
叶绿体色素的分离过程中，通过使用叶绿体破碎缓冲液使叶绿体破碎。
离心过程中，叶绿体破碎液中的叶绿体碎片被沉淀，上清液中几乎没有叶绿体。
叶绿体色素的性质分析过程中，将叶绿体色素溶液与乙醇混合。
经过离心后，观察到上层液体的颜色变化。
根据实验结果，上层液体变成了绿色，表明叶绿体色素成功被溶解在乙醇中。
四、实验结论：通过实验，我们成功提取、分离和性质分析了叶绿体色素。
实验结果表明，叶绿体色素能够在乙醇中溶解，并呈现出绿色。
这说明叶绿体色素在乙醇中具有良好的溶解性。
叶绿体色素对光吸收和光合作用起着重要的作用，它使植物可以进行光合作用，并将光能转化为化学能。
实验三的结果对进一步研究叶绿体色素的结构和功能，以及其在植物光合作用中的作用机制具有重要意义。
同时，实验的成功也验证了叶绿体提取、分离和性质分析的方法的可行性。
叶绿体色素的提取和分离(纸层析法)
叶绿体色素的提取和分离(纸层析法)叶绿体是植物细胞中重要的细胞质器之一，它们负责植物的光合作用，能够将光能转化为化学能，生产出有机物质和氧气。
叶绿体中含有多种色素，包括叶绿素、类胡萝卜素和花青素等，它们的色彩不同，吸收光的波长也不同，能够促进光合作用的进行。
叶绿体色素的提取和分离是一项重要的实验技术，科研工作者可以通过这种方法研究叶绿体的结构和功能，探究光合作用的机制，还可以进一步研究色素的生物活性和作用机理。
下面介绍纸层析法提取叶绿体色素的方法。
实验材料：1.醋酸丙酮乙酯2.正戊烷3.氯仿4.纯化水5.三氯乙酸6.薄层色谱板（取硅胶G板）7.深磁杯8.玻璃棒（或玻璃片)9.分离漏斗实验过程：1.取新鲜叶片，用纯化水冲洗干净后，将叶片用三氯乙酸溶液浸泡5-10分钟，轻轻搅拌，直至叶绿体脱离。
2.将叶绿体用分离漏斗过滤干净，加入少量的纯化水，制备得到含叶绿体的溶液。
3.将叶绿体溶液与醋酸丙酮乙酯混合，并加入一定量的正戊烷作为流动相，混合均匀后，取一片薄层色谱板，仔细涂抹硅胶G，然后放入深磁杯中。
4.将混合物用玻璃棒（或玻璃片)沿着涂有硅胶的色谱板上的一个角从上往下涂抹成一条线，使其长度大约为2.5cm左右，以保证在移液的过程中色素的有效分离。
5.将涂抹好的薄层色谱板置于流动相中，使其上升，当流动相向上液面到达约10mm处时，将其取出晾干，然后在烘箱中烘干5-10分钟，直至洁白无色，取出备用。
6.利用紫外线灯照射薄层色谱板，色素就会显示出来，然后用扫描器或者其它检测方法，对其中的不同颜色区域进行分离。
7.进行分离后，将薄层色谱板中各区域的色素用氯仿溶液洗净，然后加入适量的正戊烷，将其中的花青素、叶绿素和类胡萝卜素分别收集起来，称重、干燥，制备得到不同色素的提取物。
总结：。
叶绿体中色素的提取和分离实验中容易出现的问题和解决方法
叶绿体中色素的提取和分离实验中容易出现的问题和解决方法内容摘要：在高中生物实验中，“叶绿体中色素的提取和分离”是一个重要的实验,学生在做这个实验时容易出现以下几个问题：一是研磨植物叶片的时间过长，掌握不好加入二氧化硅的用量，往往是二氧化硅过量，致使滤液含有较多的二氧化硅，滤液颜色变浅，影响实验效果；二是毛细吸管易堵塞，色素线画得不够细、平、齐，使色素带重叠；三是层析液中含有苯，苯是一种毒性很强的有机物；四是在分离色素时，滤纸条上的滤液细线容易没及到层析液，使色素溶于层析液中，导致色素不清晰。
做这个实验，主要是让学生通过实验操作，学会提取分离叶绿体中色素的方法和技能，在探索、思考和主动实践中，吸取知识、应用知识、分析问题、解决问题，从而培养学生的科学素养、创新精神和实践能力。
在高中生物实验中，“叶绿体中色素的提取和分离”是一个重要的实验,学生在做这个实验时容易出现以下几个问题：一是研磨植物叶片的时间过长，掌握不好加入二氧化硅的用量，往往是二氧化硅过量，致使滤液含有较多的二氧化硅，滤液颜色变浅，影响实验效果；二是毛细吸管易堵塞，色素线画得不够细、平、齐，使色素带重叠；三是层析液中含有苯，苯是一种毒性很强的有机物；四是在分离色素时，滤纸条上的滤液细线容易没及到层析液，使色素溶于层析液中，导致色素不清晰。
做这个实验，主要是让学生通过实验操作，学会提取分离叶绿体中色素的方法和技能，在探索、思考和主动实践中，吸取知识、应用知识、分析问题、解决问题，从而培养学生的科学素养、创新精神和实践能力。
一、实验前的知识准备1、证明叶绿体中存在色素。
取一支干燥的白色粉笔，将其一端（约0.7cm）竖直浸入预做好的叶绿体色素提取液中，充分吸液后，使其稍微干燥，接着将该端竖于95%的乙醇中，片刻后，粉笔会出现四条不同颜色的色带。
2、实验原理：由于光合作用色素位于叶绿体中的类囊体膜上，要把它提取出来就必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎叶片后加入二氧化硅进行研磨，以便使色素被充分提取，又因为叶绿体中色素不溶于水，但可溶于有机溶剂，如酒精或丙酮，形成色素液，所以要加入丙酮使色素溶解来提取各种色素。
叶绿体色素实验
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定实验一、叶绿体色素的提取、分离1.实验名称叶绿体色素的提取、分离实验2.实验原理叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。
本实验采用酒精提取。
层析法原理： K=Cs/Cm。
3.实验试剂与材料新鲜菠菜叶体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1）天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸4.实验步骤1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，待干后再次划线，重复3,4次。
在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。
改好缸盖。
待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
5.实验结果与分析滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是：橙黄色胡萝卜素（最快）黄色叶黄素蓝绿色叶绿素a（最多）黄绿色叶绿素b（最慢）二.理化性质1.实验目的验证叶绿素的理化性质。
2.实验原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验-叶绿素的提取和分离
？
水
二、叶绿体色素
类囊体膜
色素
叶绿素a（蓝绿色） 叶绿素
叶绿素（橙黄色）
绿叶中色素的提取和分离
学习目标
1、知识目标 能概述绿叶中色素的提取与分离的原理和方法。 2、能力目标 能独立完成绿叶中色素的提取与分离 3、情感目标 通过本实验的探究与创新，提升自身的生物科学素养
2、封闭不严，操作过程中容易吸入过多层析 液，给身体带来危害。
实验操作
提取叶绿体色素
取2-3片菠菜叶，撕去叶脉，尽量剪碎，放入研钵。
向研钵中放入少量石英砂和碳酸钙，加入一滴管无 水乙醇，边加无水乙醇边研磨，进行充分地研磨至匀浆状态。
在玻璃漏斗上放入单层纱布，将研磨液倒入漏斗， 漏斗下端放置培养皿，过滤制备得到滤液。
实验原理
色素易溶于无水乙醇等有机溶剂中，可 以用无水乙醇提取绿叶中的色素。
纸层析法
不同色素在层析液中溶解度不同，溶解度高 的随层析液在滤纸条上扩散得快，反之则慢，从而 将各种色素分开。
实验步骤
实验的重难点
1、重点：绿叶中色素的提取与分离过程 2、难点：画滤液细线和色素的分离过程
实验的改进与创新 1、实验材料
【注】
加石英砂是为了使研磨充分 加碳酸钙是为了防止叶绿体色素被破坏 加入CaCO3和石英砂的量均很少，无水乙醇的量不应太少
分离叶绿体色素
将干燥的定性滤纸制成如右图 所示，用铅笔划线（已准备好）。
用盖玻片蘸取少量滤液，沿铅笔线均匀 压出细线。待滤液干后，重复画线3-4次。
【注】
画滤液线时尽量画直、画细、画浓 每次画完，要等滤液干时再重复画，以防滤液扩散开使滤液
❖这是怎么回事？
实验的改进与创新 2、画滤液细线
实验三 叶绿素含量的测定
实验三叶绿素含量的测定一．实验原理：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比。
叶绿素在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。
根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量。
二。
实验材料与实验器具：植物材料：女贞、海桐叶片实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉三。
操作步骤1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。
静置3～5min。
2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀。
4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。
以95％乙醇为空白，在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。
5. 计算公式：叶绿素的含量（mg/g）= [(O.D652/34.5)×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
Ca=13.95A663－6.88A645；Cb=24.96A645－7.32A663四．实验结果女贞：叶绿素的含量（mg/g）=0.932/34.5*10/0.119=2.270冬青: 叶绿素的含量（mg/g）=0.886/34.5*10/0.104=2.469。
实验3 叶绿体色素的提取、分离、性质
实验三叶绿体色素的提取、分离、性质及含量一、实验目的1、掌握叶绿体色素的提取方法；2、掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；3、掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验仪器及材料仪器及试剂：吹风机、定性滤纸、脱脂棉、火柴、碘钨灯、95%乙醇、汽油、醋酸铜、浓盐酸、CaCO3材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称菠菜叶子10g，加少许石英砂、CaCO3、乙醇研磨，研成匀浆，过滤，用乙醇定容至50ml，分装于5个试管内。
2、分离用滤纸条浸色素提取液（试管1），吹干，反复多次；将带色素的滤纸条卷成灯芯，将表面皿放在培养皿内，注上汽油，把灯芯浸在汽油内，加盖，色素层分清后，取下吹干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。
用铅笔标出各种色素的位置和名称。
3、叶绿体色素吸收光谱曲线取1ml提取液于比色杯中（试管2），加3ml95%乙醇。
实验三叶绿体色素的提取分离和性质分析
提取效率
通过比较不同提取时间、不同溶 剂浓度和不同提取温度对提取效 率的影响，发现最佳提取条件为 提取时间30分钟，溶剂浓度为
95%，提取温度为4°C。
提取物纯度
通过观察提取液的颜色和吸光度 ，可以初步判断提取物的纯度。 在最佳条件下，提取液颜色深且 吸光度较高，说明提取的叶绿体
色素纯度较高。
叶绿体色素的分离结果分析
将叶绿素标准品制作成标准曲线，根据标准曲线计算提 取液中各色素的浓度。
用分光光度计在400~700nm波长范围内扫描色素提取 液，记录各波长下的吸光度值。
根据各色素的浓度和吸光度值，计算各色素的吸收系数 和相对含量。
04
CATALOGUE
结果分析
叶绿体色素的提取结果分析
提取方法
采用研磨法从植物叶片中提取叶 绿体色素，该方法能够充分破碎 细胞壁，释放出叶绿体中的色素
实际应用
生态意义
了解叶绿体色素的组成和性质有助于 深入探究植物对光能的吸收和利用机 制，对于维护生态平衡和保护环境具 有重要意义。
实验结果可用于指导农业生产、园艺 和林业等领域，通过合理调节植物的 光合作用，提高作物的产量和品质。
对实验的反思和改进建议
反思
在实验过程中，需要注意操作的规范性和准确性，以避免误差和干扰因素对实验结果的影响。同时，需要充分考 虑实验的安全性和环保性。
工业应用
叶绿体色素在食品、化妆 品、染料等领域有广泛应 用，具有潜在的经济价值 。
02
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实验原理
叶绿体色素的组成和结构
叶绿体色素是由多种色素分子构成的 复合物，主要包含叶绿素a、叶绿素 b、叶黄素和胡萝卜素等。
叶绿素a和叶绿素b具有卟啉环结构， 是光合作用的主要色素分子，而叶黄 素和胡萝卜素则具有类胡萝卜素的结 构。
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实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
【实验原理】
叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色），它们与类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。
叶绿体色素的分离有多种方法，本实验仅介绍纸层析法。
层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动着试样经过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同，以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色的环。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，这种现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激发状态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量子。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。
【材料、设备与试剂】1. 材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。
2.设备电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。
3.试剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙等。
【方法与步骤】1. 叶绿体色素的提取1.1 取菠菜或其他植物新鲜叶片5?g，洗净，擦干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。
1.2 在研钵中加入少量碳酸钙和约3-5?mL 丙酮后，研磨成匀浆，研磨过程中根据情况加入一定量的丙酮以利于研磨，匀浆用多层纱布过滤到试管中。
1.3 在残渣中再加入3~5?mL 丙酮，研磨过滤，共得深绿色溶液近10?mL，其中含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质。
2. 叶绿体色素的分离2.1纸层析分离法纸层析装置如图8.1 所示。
具体操作为：2.1.1 先用滤纸条（2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。
2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径11?cm，略大于培养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约 1.5?cm（与培养皿盖高度同）。
2.1.3 把这个带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端7-10 滴。
注意：一定要在色素斑点稍风干后，再滴入另一滴，而且液滴不能污染滤纸。
2.1.4 向培养皿中倒入适量（约为培养皿高度的1/3 左右）四氯化碳，并加入一勺（适量）的无水硫酸钠，使纸芯下端浸入其中，并立即盖上培养皿。
此时，推动剂借毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，数分钟后，就可见到滤纸上出现四或五个颜色不同的同心环，并逐渐扩大。
2.1.5 当推动剂前沿接近滤纸边缘时（约30?min 左右），取出滤纸，即可看到分离的各种色素，用铅笔标出各种色素的位置和名称，并绘简图示之或拍摄图片。
3. 叶绿体色素的理化性质3.1荧光现象观察叶片丙酮提取液（稀释前的浓提取液）在反射光和透射光下的颜色有何不同并拍摄图片。
叶绿体色素溶液在反射光下呈樱桃红色，在透射光下呈绿色，说明原因。
3.2 光对叶绿素的破坏作用取叶绿体色素提取液少许，分装于2 支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸遮光）；另一支放在强光下（阳光直射），经0.5~1?h 后，观察2 支试管中溶液颜色有何不同并拍摄图片。
3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用 3.3.1 取 2 个试管，A 管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL，作为对照；在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入1~2具体操作为：2.1.1 先用滤纸条（2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。
2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径11?cm，略大于培养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约1.5?cm（与培养皿盖高度同）。
2.1.3 把这个带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端滴浓盐酸，摇匀，溶液变为褐色，拍摄图片，此时叶绿素中的镁（Mg2＋）被氢（H＋）取代而生成了去镁叶绿素。
3.3.2 从B 管中分出一半装人C 管，作为对照，在 B 管余下的溶液中加入一小粒醋酸铜结晶，将B 管和C 管都在酒精灯上慢慢加热，则B 管中的溶液又转变在蓝绿色，拍摄图片，这是因为其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素。
以叶绿素a为例，反应过程如下：
【注意事项】（1）研磨叶片要充分，否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显。
（2）纸层析时，纸芯一定要卷实，分离色素用的圆形滤纸在中心打的小圆孔周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。
（3）色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行，以防止光破坏色素，影响实验结果。
（4）实验用的有机溶剂较多，且都易挥发，取时动作要快、取后要随时加盖。
3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用3.3.1 取2 个试管，A 管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL，作为对照；在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入1~2
【思考题】（1）图示叶绿体色素纸层析结果，用铅笔分别标出叶绿素 a 和叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素。
（2）研磨提取叶绿体色素时加入CaCO3和石英砂各有什么作用？（3）根据Cu2＋在叶绿素分子中的替代作用，对制作绿色标本有何指导意义？
【作业】请写出电子版实验报告并上传至老师邮箱（需附图片；需回答上述 3 个问题）。
（由任课教师李仲芳摘编，仅供参考）。