光合色素实验方法
光合色素的提取和分离
光合色素的提取和分离一、光合色素提取分离1.1原理光合色素是植物体内的生物有机分子，它们具有很强的光吸收和可以转化光能的功能。
这些具有生物性和光吸收特性的分子在提取时能将其从其他植物体中有效分离出来，从而达到提取和分离的目的。
1.2方法光合色素的提取分离方法多种多样。
常见的提取方法有溶剂提取法、单一微量提取法、离子交换柱提取法、激光印记技术等。
(1) 溶剂提取法：溶剂提取法是将植物体内的溶剂放入，然后进行离心提取实验，最终用比梯度可以将光合色素从其他植体中分离出来。
(2) 单一微量提取法：单一微量提取方法是只提取当前需要的物质，对于特定的一种物质进行精确的测定。
(3) 离子交换柱提取法：离子交换柱提取方法是根据光合色素的特征来分离和检测光合色素，它采用了柱状模式的分离，使用离子交换材料作为吸附剂，利用原料的流动重力来把需要的物质吸附在离子交换柱上，从而得到光合色素。
(4) 激光印记技术：激光印记技术是通过激光束来缩小生物物质的体积，来达到将能够准确的分离和检测到光合色素的目的。
二、光合色素的应用2.1 生物能源及环境应用光合色素是能够吸收太阳光，进行光化学反应，释放出多种生物能源以用于生物体内能量代谢等过程的一种生物有机分子。
此外，由于光合色素具有丰富的抗氧化效果，所以在环境保护方面也有着重要作用。
如使用光合色素处理废水，用于抑制大气污染物的释放等。
2.2 作物研究光合色素不仅可以作为生物能源，更可以利用其强的光敏能力来影响作物的生长。
近年来，研究人员深入研究光合色素功能，以及光合色素对生物体内其他生物反应的影响，为科学研究和科技发展提供了有力支持。
光合作用中的光合色素定量分析方法
光合作用中的光合色素定量分析方法光合作用是生命中极为重要的化学反应过程之一。
它是在光合体内某些色素的协同作用下完成的。
光合色素在光合作用过程中承担着非常重要的角色。
测量和分析光合体内的光合色素含量对于深入理解光合作用机制和其对环境变化的响应具有重要意义。
光合色素的定量分析方法可以分为三种：光度法、荧光法和高效液相色谱法。
下面分别分析一下各种方法的原理和优缺点。
一、光度法光度法是一种通过比较待测样品与标准溶液的吸光度来确定光合色素浓度的方法。
常用的光度计有紫外分光光度计和分光比色计。
在紫外区域，因为光合色素具有特征性的吸收谱，因此可以用紫外分光光度计直接测量吸光度。
而在可见光区域，由于光合色素种类增多，吸收谱互相混叠，因此需要用分光比色计对不同波长下的吸光度进行测定。
优点：此方法操作简单，对于大量样品的测定方法较为便利。
缺点：光度法需要标准品，标准品制备和保管质量对稳定分析结果影响较大，且无法分析光合色素种类。
二、荧光法荧光法是利用叶绿素的荧光性质进行测定。
由于荧光与激发荧光的波长、激发光强度、荧光素浓度等因素之间有确定的关系，因此可以通过荧光特性分析荧光强度，进而分析样品中荧光素浓度。
优点：荧光法具有灵敏度高、选择性强、操作简便的特点，可同时测定多种光合色素种类，并且不需要标准曲线。
缺点：此法对荧光素的浓度变化较为敏感，在某些实验条件下易受干扰，如样品中其他物质造成的荧光波长重叠。
三、高效液相色谱法高效液相色谱法是目前最为常用的光合色素定量方法。
该方法利用高效液相色谱仪分离不同种类的光合色素，并通过紫外检测器对色素进行定量分析。
优点：高效液相色谱法可以分离已知和未知的光合色素种类，准确分析各种光合色素含量，并可以消除样品中其他物质在分析中产生的干扰。
缺点：此方法操作复杂，需要较高的仪器设备和技术要求，并且需要使用贵重的试剂和色谱柱。
综上所述，各种光合色素定量分析方法各有优劣。
实验者应根据自己的具体需求和实验条件选择合适的方法。
光合色素纸层析法原理
光合色素纸层析法原理光合色素纸层析法（Paper Chromatography）是一种分离和分析化合物的实验技术，一般用于快速检测一组样品中的有机或无机及药物等复杂物质是否有有机化学关系。
它是利用不溶性溶剂称为拖曳剂（溶剂通常由多种有机溶剂如石油醚，乙醇，氯仿等组成）与水溶液或固态反应物的分子电荷，加以不同的作用而产生的溶液的可萃取性的分离的结果。
光合色素纸层析法的基本原理是分子的电性，分子在拖曳剂的溶液中会受到力的作用，从拖曳剂萃取到纸上，称作拖曳运动（Chromatographic Movement）。
它的优点在于可以快速分离复杂的介质，检测时不必用极少量的试剂，避免了反应时释放有毒气体，而且结果可以快速可靠地评估。
一、光合色素纸层析法基本原理：1、溶剂力和电荷力：利用不溶性拖曳剂与水溶液中的分子电荷，受到不同的作用而形成的溶液的可萃取性的分离称作拖曳运动。
2、电荷性：分子电荷规律可分为极性、非极性和共价物质。
根据电荷性，分子受到拖曳剂形成不同程度的电荷力，从拖曳剂萃取到纸，由此实现对化合物的分离步骤。
3、化合物扩散：样品经由溶剂力和电荷作用后，最终进入分子扩散状态，以不同速度落下到层析纸上，形成一条线。
二、光合色素纸层析法设备：1、拖曳剂容器：用于装拖曳剂的容器，一般为透明的玻璃容器或塑料容器。
2、层析纸和激光纸：用于层析分离的膜，一般会选择具有亮度接近拖曳剂的激光纸，以此使色带更容易观察和识别物质。
3、吸收紫外线台：用于吸收层析纸上的紫外线辐射，以防止太大的蒸发。
三、光合色素纸层析法实验步骤：1、把层析纸覆盖在拖曳剂容器上，将所需要分离的物质滴在纸上。
2、将层析纸放置于拖曳剂容器中拖曳，让拖曳剂穿过纸面。
3、将层析纸取出，按照拖曳剂前进的方向，用尺子游标测量出分子在层析纸上的分离距离，评估反应时的拖曳速度。
4、将层析纸放在一盏电灯的边上，近距离观察出色带，以此来进行比较及鉴定。
光合作用(光合色素的提取与分离实验讲解)教案
微格教学教案设计表
学科：高中生物执教者：xxx 年级：高二日期：xx.xx.xx 教学课题必修一 3.4光合作用(光合色素的提取与分离实验讲解）
教学目标1、讲解光合色素分离与提取的原理
2、分析实验的步骤
技能目标1、通过实验学会提取和分离光和色素的方法，加深光和色素在光合作用中的所起的地位和作用
教师行为学生行为
导入（30s）：在前面的课程当中我们
已经知道了，绿色植物利用光合色素，
在叶绿体中进行光合作用，那么这些
光合色素到底有哪些种类呢？今天我
们通过一个实验，把这些色素提取并
且分离出来，对它们进行区分了解。
板书标题：一、光合色素的提取与分离
（一）、提取(6min)
选材
有机溶剂
研磨SiO2 （石英砂）
CaCO3
过滤
叶绿体中的色素是脂溶性色素，不溶于水，
我们用有机溶剂来溶解色素。
为了研磨充分，我们用粗糙的石英砂颗粒，
帮助研磨。
由于在淹没过程中，会使中央液泡破裂，其
中的有机酸会释放，分解色素，加入碳酸钙，
中和有机酸，保护色素不被分解。
我们只需要溶有色素的乙醇溶液，为了出去。
实验：光合色素的提取与分离
过滤：将研磨后的液体过滤，除去残渣
浓缩：将滤液用旋转蒸发仪进行浓缩，即可得到光合色素的提 取液
光合色素的分离原理
添加项标题
纸层析法：利用不同色素在层析液中溶解度不同，随着层析液在 滤纸上的扩散速度不同而分离色素
添加项标题
在农业生产中，实验结论可以指导育种工作，通过改良植物的光合色素组成以 提高作物的产量和品质。
实验结论还可以应用于环境保护领域，通过研究植物光合色素的特性，为植物 修复重金属污染和水体富营养化等环境问题提供理论依据和实践指导。
THANK YOU
汇报人：XX
原理：混合色素在层析液中的溶解度不同，随层析液在滤纸上扩 散速度不同，从而将不同色素分离
添加项标题
分离过程：将研磨液点在滤纸上，用毛细管吸取层析液，沿滤纸 边缘画出一条滤液细线，待滤液干后，再重复操作数次
添加项标题
结果：不同色素在层析液中溶解度不同，扩散速度不同，从而在 滤纸上分离出不同的色素带
实验试剂：无水乙醇、层 析液等
其他辅助材料：量筒、烧 杯等
实验材料的处理
新鲜菠菜叶的采集和保存 研磨前对叶片进行清洗和整理 研磨过程中加入适量石英砂和碳酸钙 过滤后得到的滤液进行离心分离
实验材料的保存
新鲜叶片清洁，确保无 残留物
滤纸：存放在 干燥通风处， 避免受潮
光合色素的作用
光合色素能够吸收光能，将能量转化为活跃的化学能 光合色素能够将水分解为氧气和活跃的氢，同时将二氧化碳还原为糖 光合色素能够将光能转化为化学能，并储存在有机物中 光合色素能够将光能转化为化学能，为植物的生长和发育提供能量
03
实验材料
实验：光合色素的提取与分离
04
结果分析
实验结果展示
1 | 0.32mg/g | 0.28mg/g |
绿叶样品编号 | 实验组 | 对 照组 |
实验结果表格
01
03 02
实验结果展示
2 | 0.35mg/g | 0.31mg/g |
平均值 | 0.33mg/g | 0.30mg/g |
3 | 0.31mg/g | 0.29mg/g |
实验改进与拓展
改进二：分离技术的升级
1
2
引入高效液相层析（HPLC）技术，实现光合色 素的高效分离。
3
HPLC技术具有更高的分辨率和分离效果，适用 于复杂样品的分析。
实验改进与拓展
01
02
03
拓展一：应用领域的探 索
光合色素的提取与分离 技术在农业、食品、医 药等领域具有广泛的应
用前景。
可进一步研究光合色素 在各领域中的具体应用 ，为相关行业提供技术
等待一段时间，观察各光 合色素在滤纸上的扩散情
况。
结果观察与记录
观察各光合色素在滤纸上的扩 散轨迹，记录各色素的位置和
形状。
用标记笔在滤纸上标出各色素 的名称和位置，以便后续分析
。
比较不同光合色素在扩散过程 中的速度和扩散半径，分析各 色素的性质和特征。
将实验结果与理论预测进行比 较，评估实验的准确性和可靠 性。
实验：光合色素的提取与 分离
• 实验简介 • 材料与试剂 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论与讨论
01
实验简介
实验目的
提取和分离光合色素
探究光合色素的作用
通过实验掌握从植物中提取和分离光 合色素的方法，了解光合色素的组成。
通过实验，探究光合色素在光合作用 中的重要作用及其对植物生长的影响。
生物教学光合色素的提取与分离改进实验
三、实验改进之处1．光合色素提取的改进——酒精隔水加热提取色素ﻭ将原实验中的研磨法改为酒精隔水加热法。
直接将菠菜叶片的绿叶剪碎加入无水乙醇，进行隔水加热，所得的溶液就是色素溶液，省去了添加二氧化硅和碳酸钙、过滤的步骤，操作简单，也能使学生明确色素不溶于水,极易溶于有机溶剂的知识点。
2．画滤液细线方法的改进ﻭ将教材实验中画滤液细线工具毛细吸管改为自制画线器,如，笔帽、大号移液头等空心圆柱材料,直接在装有色素溶液的培养皿中蘸取，印上滤纸圆心处即可，这样操作更为便利。
ﻭ3.光合色素分离的改进——灯芯法分离色素将教材中的滤纸条分离改为用圆形滤纸分离,以酒精灯灯芯作为介质，将层析液引导至圆形滤纸片上，得到的层析结果是同心圆色素带,直接而美观，避免了滤液细线触及层析液的易错步骤。
ﻭ四、实验器材新鲜的菠菜绿叶,无水乙醇、层析液、天平、剪刀、培养皿、镊子、玻璃棒,烧杯、试管、试管夹、三脚架、石棉网、酒精灯、火柴、大号移液头、干燥的定性滤纸、量筒、酒精灯芯。
五、实验原理ﻭ光合色素不溶于水，极易溶于有机溶剂,故可用无水乙醇来提取色素,且高温能破坏叶肉细胞的生物膜，使叶绿体中色素释放出来，因此，可以通过酒精隔水加热法提取光合色素。
光合色素在层析液中的溶解度不同：溶解度高的层析液在滤纸上扩散得快；反之则慢.因此，可用层析液来分离色素。
ﻭ六、实验过程ﻭ1.提取绿叶中的色素取5g菠菜叶叶片剪碎,装入试管中，加入5mｌ无水乙醇，在沸水浴中加热３～5分钟，即可得到深绿色的色素溶液,用橡皮塞塞好稍冷备用。
ﻭ2。
制备圆形滤纸片取一干燥的圆形定性滤纸，圆心打一小孔（可用镊子或剪刀操作），取酒精灯灯芯约5cm,一端打结,沿刚打的滤纸片圆心孔穿入，打结一端留在滤纸上方,制备好后备用。
ﻭ３.画色素细线ﻭ将步骤1所得到的色素溶液倒入培养皿中，用大号移液头的圆形开口在培养皿蘸取色素溶液，印在制备好的滤纸片圆心处，待稍干后再进行２~３次。
4。
色素的分离ﻭ将适量层析液倒入培养皿中，用刚才经过画线的滤纸片盖在培养皿上，将打结的一面（画色素细线一面）朝上，层析5~10分钟。
光合色素测定实验报告计算过程
光合色素测定实验报告计算过程实验目的：本实验旨在通过测定叶绿素a和叶绿素b的吸收光谱，计算出叶绿素a/b的比值，从而了解叶绿素的组成和光合作用的效率。
实验原理：光合作用是植物通过吸收光能转化为化学能的重要过程。
光合色素是参与光合作用的关键物质，其中叶绿素是最主要的光合色素。
叶绿素可分为叶绿素a和叶绿素b两种类型，它们在吸收光的波长范围上略有差异。
实验步骤：1. 提取叶绿素溶液：取新鲜的植物叶片，用酒精和醋酸乙酯的混合溶液将叶绿素溶解出来，制备成一定浓度的叶绿素溶液。
2. 测定吸收光谱：使用分光光度计，将叶绿素溶液放入光池中，扫描波长范围为400-700nm，记录每个波长下的吸光度值。
3. 计算叶绿素a/b的比值：根据吸光度值计算叶绿素a和叶绿素b 的吸收峰值，并计算它们的比值。
计算过程：1. 根据测定的吸光度值绘制吸收光谱曲线。
2. 在吸收光谱曲线上找到叶绿素a和叶绿素b的吸收峰值所对应的波长。
3. 记录叶绿素a的吸光度值为Aa，叶绿素b的吸光度值为Ab。
4. 计算叶绿素a/b的比值：a/b = (Aa / 12.7) / (Ab / 21.5)。
实验结果和讨论：根据实验测得的数据，计算得到叶绿素a/b的比值。
该比值反映了叶绿素a和叶绿素b的相对含量，可以反映植物光合作用的效率。
通常情况下，叶绿素a/b的比值在1.5-3.5之间，数值越大表示叶绿素a的相对含量越高，说明植物对光的吸收更为高效。
然而，需要注意的是，叶绿素a/b的比值并不能完全代表植物的光合作用效率。
因为光合作用的效率还受到其他因素的影响，如光照强度、温度等。
因此，只通过叶绿素a/b的比值来评估光合作用的效率是不全面的，还需要综合考虑其他因素。
实验中提取叶绿素溶液的过程需要注意保持环境的暗处和低温，以避免叶绿素的降解和光敏化反应的发生。
实验中使用的溶剂也要保持纯净，以免对实验结果产生干扰。
结论：通过光合色素测定实验，我们可以得到叶绿素a/b的比值，从而了解植物叶绿素的组成和光合作用的效率。
13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定
13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定专业：应用生物科学班级：13应生姓名：张寿丽学号：134120258实验二、光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定一、实验目的：1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。
2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。
3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。
二、实验原理：1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。
2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。
3、离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。
4、叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。
5、叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。
6、不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。
7、叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。
8、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。
Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。
叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程Ca = 12.7 A663 –2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A6459、A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。
10、k——比吸收系数。
即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。
实验室提取光合色素的操作简述
实验室提取光合色素的操作简述光合色素是植物和一些原核生物中的一种生化分子，通过吸收光能将其转化为化学能。
光合色素主要存在于叶片细胞的叶绿体中。
光合色素的提取是实验室中常见的实验操作之一，本文将对光合色素的提取操作进行详细介绍。
实验步骤：1.材料准备实验所需材料包括：植物组织样品（如菠菜叶片）、酒精、乙醚、丙酮、磷酸盐缓冲液、色谱纸、移液管、离心管、离心机等。
2.组织样品的制备取新鲜的菠菜叶片作为实验样品，将其洗净后用灯光照射一段时间，以提高叶片中光合色素的含量。
然后将叶片切碎并将其置于磷酸盐缓冲液中。
3.溶剂提取将切碎的叶片放入搅拌器中，加入适量的酒精和乙醚。
搅拌混合物并过滤，得到含有光合色素的溶液。
4.萃取和分离将得到的溶液转移到离心管中，加入丙酮并轻轻摇匀。
然后进行离心，将上层的溶液转移至另一个离心管中。
重复该步骤直至上层液体不再呈现绿色。
5.测定光合色素含量将提取得到的光合色素溶液加入色谱纸中，用移液管将不同成分移至纸上不同位置。
然后用特定的显色剂处理色谱纸，根据显色结果可以初步测定不同光合色素的含量和种类。
6.数据分析根据显色纸的结果以及对照样品进行比对，可以得出光合色素的含量和种类。
根据实验结果进行数据分析和统计。
光合色素的提取实验可以帮助学生深入了解光合作用的基本原理以及色素分子的结构和功能。
同时，通过该实验，学生还可以了解溶剂提取、色谱纸层析等实验操作技术，增强实验技能。
实验注意事项：1.实验室操作时要穿戴好防护用具，避免酒精和丙酮的接触，避免产生火灾和爆炸等危险。
2.实验操作时需要注意实验仪器的使用方法，避免损坏实验设备。
3.严格按照实验步骤进行操作，避免因操作不当而导致实验失败或结果不准确。
总结：光合色素的提取实验是一项实验室中常见的生物化学实验操作，在教学实验中具有重要的意义。
通过该实验，学生可以深入了解光合作用和光合色素的基本原理，掌握溶剂提取、色谱层析等实验操作技术，增强实验操作能力和数据分析能力。
光合色素纸层析法结果
光合色素纸层析法结果好吧，咱们今天来聊聊一个非常有趣的实验——光合色素纸层析法，别看这名字长得有点吓人，其实呢，说起来也就是那种通过纸片分离不同色素的技术，简单来说，能让我们看到植物是如何通过光合作用来“吸取养分”的。
如果你喜欢科学，喜欢小实验，或者只是想看看植物的“秘密武器”长什么样，那就继续往下看吧。
咱们得知道，植物在进行光合作用时，会有一些色素在起作用。
这些色素可不是随便哪种色素，它们可是帮助植物吸收阳光的“专家”，比如叶绿素啦，胡萝卜素啦，这些都是其中的代表。
想象一下，植物就像一个小小的太阳能电池板，而这些色素就是它的“吸能器”，每天都忙着“充电”。
你看，绿色的叶子，就是被叶绿素给“染”成这个样子的。
而如果你仔细观察下植物叶片，你会发现其实它不止绿色，还有黄色、橙色等各种色彩。
所以，通过纸层析法，我们就可以把这些不同的色素分开，看看植物究竟是靠什么色素在“工作”的。
好啦，讲到这里，你一定好奇了，光合色素纸层析法到底怎么操作呢？其实非常简单，第一步呢，我们得先把叶片撕下（别撕太多，植物要留着呼吸的），然后将叶片捣碎，最好用些酒精，这样可以把里面的色素给溶解出来。
溶解完后，你会得到一小滴颜色很浓的液体，就像是草莓汁一样，红通通的。
把这滴液体小心地滴到一张滤纸上，拿出一杯水，纸条站在水里，水面要刚好摸到纸条的底部，不能浸泡进去。
然后，静静地等着，水就会慢慢沿着纸条往上升，啊，神奇的事情就发生了——水带着液体中的色素一层一层地往上移动，而不同的色素因为各自的特性，会以不同的速度向上跑，最终在纸上留下了一条条不同颜色的带子。
这些带子就是各个色素的身影，一目了然。
到这儿，嘿嘿，你就可以看到不同的色素分开了。
你会看到那些绿色的叶绿素大大方方地展现出来，可能还有些黄色的、橙色的带子。
这就是植物为了适应环境，进化出来的“配色方案”。
每个色素都有自己的独特任务，有的帮助吸收光，有的帮助植物进行其他化学反应。
光合色素提取实验-概念解析以及定义
光合色素提取实验-概述说明以及解释1.引言1.1 概述光合色素是一类生物分子，它们在光合作用中起着至关重要的作用，能够吸收光能并将其转化为化学能以供植物生长和发育所需。
因此，提取光合色素并对其进行实验研究具有重要意义。
本文旨在介绍光合色素提取实验的步骤和结果，并对实验过程中遇到的问题及其解决方法进行讨论。
通过本实验，我们可以更深入地了解光合作用的机理，并进一步探讨光合色素在植物生长中的意义与展望。
1.2 文章结构文章结构部分旨在介绍本文的整体结构安排，让读者对全文有一个整体的把握。
本篇文章主要包括引言、正文和结论三个部分。
1. 引言部分主要包括概述、文章结构和目的三个小节。
在概述中，将简要介绍光合色素提取实验的背景和意义；文章结构部分将介绍整篇文章的结构安排，方便读者快速了解文章的内容概要；目的部分将明确指出本文的写作目的和意义。
2. 正文部分主要包括光合色素的概念、光合色素提取实验步骤和实验结果与讨论三个小节。
光合色素的概念部分将介绍光合色素的基本概念和作用；光合色素提取实验步骤部分将详细介绍实验的步骤和操作方法；实验结果与讨论部分将对实验结果进行分析和讨论。
3. 结论部分主要包括总结提取光合色素的实验过程、实验中遇到的问题与解决方法、实验的意义与展望三个小节。
在总结提取光合色素的实验过程部分，将对实验过程进行总结和归纳；实验中遇到的问题与解决方法部分将介绍在实验过程中可能遇到的问题并给出解决方法；实验的意义与展望部分将探讨实验结果的意义和可能的未来应用方向。
1.3 目的本实验旨在通过提取光合色素的实验，深入了解光合作用的过程和原理。
通过实验过程中的操作，掌握光合色素的提取方法，并对提取结果进行分析与讨论，从而加深对光合作用的理解。
同时，通过实验中遇到的问题及解决方法，总结实验操作中的注意事项，为今后相关实验提供参考。
最终，通过本次实验，希望能够进一步挖掘光合色素的应用价值，为相关领域的研究提供知识支持与实验经验。
光合色素的提取与理化性质实验流程
光合色素的提取与理化性质实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定
13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定专业：应用生物科学班级：13应生姓名：张寿丽学号：134120258实验二、光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定一、实验目的：1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。
2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。
3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。
二、实验原理：1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。
2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。
3、离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。
4、叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。
5、叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。
6、不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。
7、叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。
8、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。
Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。
叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程Ca = 12.7 A663 –2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A6459、A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。
10、k——比吸收系数。
即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。
光合作用色素含量测定
• 实验步骤： 实验步骤： • 1、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并 剪成碎块，称取0.5 g放入研钵中加纯丙酮5 mL， 加适量石英砂及少许碳酸钙，研磨成匀浆，再加 80％丙酮5 mL，将匀浆转入离心管，并用适量80 ％丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉 淀，上清液用80％丙酮定容至20 mL。 • 2、测定光密度：取上述色素提取液1 mL，加80 ％丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80％丙酮为 对照，分别测定663 nm、645 nm处的光密度值。 • 3、按公式计算叶绿素a，b及总叶绿素含量。再 根据喜事倍数分别计算每克鲜重叶片中色素含量。
?实验步骤?1色素的提取取新鲜叶片剪去粗大的叶脉并剪成碎块称取05g放入研钵中加纯丙酮5ml加适量石英砂及少许碳酸钙研磨成匀浆再加80丙酮5ml将匀浆转入离心管并用适量80丙酮洗涤研钵一并转入离心管离心后弃沉淀上清液用80丙酮定容至20ml
叶绿素含量测定
• 实验目的：掌握未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿 实验目的：掌握 素a，b含量的方法及其计算。 • 试验原理：混合液中两种组分存在时，可通过测定吸光 试验原理： 度，根据Lambert－Beer定律计算二者含量。叶绿素a 的最大吸收峰在663 nm，叶绿素b最大吸收峰在645 nm。根据Lambert－Beer定律，两种组分的混合液，二 组分的浓度C与光密度OD之间的关系如下： • OD663＝Ca·Ka663＋Cb·Kb663 • OD645=Ca·Ka645+Cb·Kb645 • 从文献中查得Ka663为82.04，Kb663为9.27；Ka645为 16.75，Kb645为45.60. • 通过代数推算，得 • Ca＝12.7·OD663－2.69·OD645 • Cb＝22.9·OD645－4.68·OD663 • CT＝Ca＋Cb＝8.02·OD663＋20.21·OD645 • 式中单位为mg L－1。
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脯氨酸含量测定
在测定样品脯氨酸含量之前，以OD值为纵坐标，标准脯氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
一、脯氨酸标准曲线制作：
1、脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg.ml-1。
再取此溶液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg.ml-1的脯氨酸标准液。
2、2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol.L磷酸以3：2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2-3天有效。
3、
二、样品测定
称取1.0g新鲜材料，加入80%乙醇10ml，于研钵中研磨成匀浆。
匀浆液定容至25ml，混匀，在80℃温水浴中提取20min；再加入0.5g人造沸石和0.2g活性炭，振荡0.5min，匀浆液在1000r．min-1下离心10min，上清液保存备用。
然后取上述上清液2.0ml，分别加入2.0ml冰醋酸、2.0ml酸性茚三酮试剂，于沸水中加热15min，冷却后在515nm波长处测OD值；试验重复3次。
由标准曲线查出测定液中脯氨酸的浓度，然后根据
脯氨酸[μg.g-1(鲜重)]=(C×V/α)/W
C:由标准曲线求得的脯氨酸浓度(μg) W：样品重(g)
V：提取液总体积(ml)α：测定时所吸取体积(ml)
超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
氮蓝四唑（NBT）在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后发生光化还原反应生成蓝甲唑。
后者在560nm处有最大光吸收。
SOD能抑制氮蓝四唑发生光化还原反应，其抑制强度和酶活性在一定范围内成正比。
测定参照Giannopiolitis［68］等方法进行，以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%作为一个酶单位（U），酶活性以U. mg-1蛋白表示。
方法：选取透明度好，大小形状一致的5ml试管5支，3支为测定管，一支为空白对照管，另一支为最大光还原管。
按下表顺序加入下列试剂。
混匀后，空白管不照光，其他各管同时置于4000Lux光下，反应20min。
要求各管照光情况一致，反应温度控制在25-30℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间。
反应结束后，以空白管为对照，560nm比色。
从最大管开始。
最大光还原管：用缓冲液代替酶液，即加PBS2.3 ml，置于4000Lux光下，20min。
空白管：用缓冲液代替酶液和NBT，即加PBS2.5 ml，黑暗放置。
计算：以抑制NBT光化还原50%作为一个酶单位（U）,酶活性以U. mg-1蛋白表示。
U=(ODmax-OD560)/(ODmax/2)
酶液的提取
取0.5g鲜重的去叶脉叶片，剪碎，在预冷的研钵中，加1ml预冷的提取液（0.15 mol/l 磷酸缓冲液，内含0.3%PVP 、PH 7.0），在冰浴上研磨成匀浆，加提取液最终体积为10ml。
在4℃条件下15000 r/min离心10min，上清液用于酶活性测定。
（参162页）
丙二醛（MDA）含量的测定
MDA在酸性环境及高温条件下，发生异硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红色的三甲基复合物，该物质在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为155[mmol/(L.cm)]。
测定时取1.0ml上清液，加入1.0ml磷酸缓冲液（62.5mmol/L pH 7.8）， 2.0ml 10%三氯乙酸（含0.5%TBA（硫代巴比妥酸）），煮沸15min后于冰水中快速冷却，4000rpm离心20min，以10% 三氯乙酸（含0.5%TBA）为参比，在532、600和450nm波长下测定OD值。
试验重复3次，求平均值。
按赵世杰［66］等方法计算MDA含量，单位为μmol.g-1.FW。
蛋白质含量的测定
按考马斯亮蓝G-250染色法Bradford (1976) ［72］定蛋白质含量，考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式-红色和蓝色，和蛋白质结合后由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm转变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
标准曲线绘制
牛血清蛋白(BSA): 1mg/ml,100 μg/ml。
10mg BSA定容至10ml。
取1ml 1mg/ml 标准液，定容至10ml，为100 μg/ml。
考马斯亮蓝G-250: 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇，待完全溶解后再加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水定容至1000ml。
常温下可以放置一个月。
0~100 μg/ml标准曲线
准确吸取上述各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，绘制标准曲线。
0~1000 μg/ml标准曲线
准确吸取上述各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，绘制标准曲线。
B)样品中蛋白质含量的测定
准确吸取样品提取液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中（设两个重复），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，查标准曲线得到蛋白质含量。
C）计算
样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=蛋白质含量（mg/ml）⨯提取液总体积（ml）⨯稀释倍数/取样量（g鲜重）
1.4.3 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收原理,利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量.
测定方法参照Arnon ［64］和朱光廉［65］。
取样0.2g浸入25 mL 80%丙酮提取液中，密封，避光浸提至叶片无色时测定。
用UV-1601紫外分光光度计分别在663、646、470nm波长处检测OD值，按下列公式计算：
叶绿素a（Chl a）=（12.21A663-2.81A646）*V/1000W
叶绿素b（Chl b）=（20.13A646-5.03A663）*V/1000W
类胡萝卜素（Car）=（4.4A470-0.01* Chl a-0.45* Chl b）*V/1000W
式中，A为吸光值，*代表乘号，V为提取液总体积（ml），W为叶片鲜重（g），并计算Chl= Chl a + Chl b ，重复3次。
荷格伦特（Hoagland）营养液的配方如下：
（1）.大量元素每升1mol/L培养液中加入的毫升数
KH2PO4 1
KNO3 5
Ca(NO3)2 5
MgSO4 2
（2）.微量元素每升培养液中加入量（mg）
H3BO3 2.86
MnCl2·4H2O 1.81
ZnSO4·7H2O0.22
CuSO4·5H2O0.08
H2MoO4·H2O0.02
（3）.每升培养液中加入1 mL FeEDTA溶液(即乙二胺四乙酸铁盐溶液)。
Hoagland’s（霍格兰氏）营养液配方：
硝酸钙945mg/L
硝酸钾607mg/L
磷酸铵115mg/L
硫酸镁493mg/L
铁盐溶液2.5ml/L
微量元素5ml/L
pH=6.0
改良霍格兰配方：
四水硝酸钙945mg/L
硝酸钾506mg/L
硝酸铵80mg/L
磷酸二氢钾136mg/L
硫酸镁493mg/L
铁盐溶液 2.5ml
微量元素液5ml
pH=6.0
铁盐溶液：七水硫酸亚铁 2.78g
乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na） 3.73g
蒸馏水500ml
pH=5.5
微量元素液：碘化钾0.83mg/l
硼酸6.2mg/L
硫酸锰22.3mg/L
硫酸锌8.6mg/L
钼酸钠0.25mg/L
硫酸铜0.025mg/L
氯化钴0.025mg/L
若作为复合肥使用，可以采用天然水配制，省略微量元素液。
若作为无土栽培营养液需用人工软水配制，如蒸馏水，微量元素液必须加入。
经常将上述营养液配成10倍或20倍浓度，用时稀释即可。
注意用前调整pH。