光合色素实验方法

脯氨酸含量测定

在测定样品脯氨酸含量之前，以OD值为纵坐标，标准脯氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

一、脯氨酸标准曲线制作：

1、脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg.ml-1。再取此溶液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg.ml-1的脯氨酸标准液。

2、2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol.L磷酸以3：2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2-3天有效。

3、

二、样品测定

称取1.0g新鲜材料，加入80%乙醇10ml，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液定容至25ml，混匀，在80℃温水浴中提取20min；再加入0.5g人造沸石和0.2g活性炭，振荡0.5min，匀浆液在1000r．min-1下离心10min，上清液保存备用。

然后取上述上清液2.0ml，分别加入2.0ml冰醋酸、2.0ml酸性茚三酮试剂，于沸水中加热15min，冷却后在515nm波长处测OD值；试验重复3次。

由标准曲线查出测定液中脯氨酸的浓度，然后根据

脯氨酸[μg.g-1(鲜重)]=(C×V/α)/W

C:由标准曲线求得的脯氨酸浓度(μg) W：样品重(g)

V：提取液总体积(ml)α：测定时所吸取体积(ml)

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

氮蓝四唑（NBT）在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后发生光化还原反应生成蓝甲唑。后者在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制氮蓝四唑发生光化还原反应，其抑制强度和酶活性在一定范围内成正比。测定参照Giannopiolitis［68］等方法进行，以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%作为一个酶单位（U），酶活性以U. mg-1蛋白表示。

方法：选取透明度好，大小形状一致的5ml试管5支，3支为测定管，一支为空白对照管，另一支为最大光还原管。按下表顺序加入下列试剂。混匀后，空白管不照光，其他各管同时置于4000Lux光下，反应20min。要求各管照光情况一致，反应温度控制在25-30℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间。

反应结束后，以空白管为对照，560nm比色。从最大管开始。

最大光还原管：用缓冲液代替酶液，即加PBS2.3 ml，置于4000Lux光下，20min。

空白管：用缓冲液代替酶液和NBT，即加PBS2.5 ml，黑暗放置。

计算：以抑制NBT光化还原50%作为一个酶单位（U）,酶活性以U. mg-1蛋白表示。U=(ODmax-OD560)/(ODmax/2)

酶液的提取

取0.5g鲜重的去叶脉叶片，剪碎，在预冷的研钵中，加1ml预冷的提取液（0.15 mol/l 磷酸缓冲液，内含0.3%PVP 、PH 7.0），在冰浴上研磨成匀浆，加提取液最终体积为10ml。在4℃条件下15000 r/min离心10min，上清液用于酶活性测定。（参162页）

丙二醛（MDA）含量的测定

MDA在酸性环境及高温条件下，发生异硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红色的三甲基复合物，该物质在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为155[mmol/(L.cm)]。

测定时取1.0ml上清液，加入1.0ml磷酸缓冲液（62.5mmol/L pH 7.8）， 2.0ml 10%三氯乙酸（含0.5%TBA（硫代巴比妥酸）），煮沸15min后于冰水中快速冷却，4000rpm离心20min，以10% 三氯乙酸（含0.5%TBA）为参比，在532、600和450nm波长下测定OD值。试验重复3次，求平均值。按赵世杰［66］等方法计算MDA含量，单位为μmol.g-1.FW。

蛋白质含量的测定

按考马斯亮蓝G-250染色法Bradford (1976) ［72］定蛋白质含量，考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式-红色和蓝色，和蛋白质结合后由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm转变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

标准曲线绘制

牛血清蛋白(BSA): 1mg/ml,100 μg/ml。10mg BSA定容至10ml。取1ml 1mg/ml 标准液，定容至10ml，为100 μg/ml。

考马斯亮蓝G-250: 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇，待完全溶解后再加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水定容至1000ml。常温下可以放置一个月。

0~100 μg/ml标准曲线

准确吸取上述各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，绘制标准曲线。

0~1000 μg/ml标准曲线

准确吸取上述各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，绘制标准曲线。

B)样品中蛋白质含量的测定

准确吸取样品提取液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中（设两个重复），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反复混合数次，放置2min后，用1cm光径比色杯在595nm比色，查标准曲线得到蛋白质含量。

C）计算

样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=蛋白质含量（mg/ml）⨯提取液总体积（ml）⨯稀释倍数/取样量（g鲜重）

1.4.3 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收原理,利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量.

测定方法参照Arnon ［64］和朱光廉［65］。取样0.2g浸入25 mL 80%丙酮提取液中，密封，避光浸提至叶片无色时测定。用UV-1601紫外分光光度计分别在663、646、470nm波长处检测OD值，按下列公式计算：

叶绿素a（Chl a）=（12.21A663-2.81A646）*V/1000W

叶绿素b（Chl b）=（20.13A646-5.03A663）*V/1000W

类胡萝卜素（Car）=（4.4A470-0.01* Chl a-0.45* Chl b）*V/1000W