小鼠尾尖成纤维细胞的分离与培养

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MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。

当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。

用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。

将子宫角移到10cm的皿里。

用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。

将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。

再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。

此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。

将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。

每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。

一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。

这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离_扩增和抑制

2002年8月第12卷　第4期中国实验动物学杂志CHINESE J OUR NAL OF LABOR ATORY ANIMAL SCIEN CE Augus t ,2002Vol .12　No .4研究报告小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制刘民　李柏青(蚌埠医学院,蚌埠市　233003) 【摘要】　目的　建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于分离和克隆胚胎干细胞研究。

方法　取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞,观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响,以及丝裂霉素C 对细胞增殖的抑制作用;细胞增殖的数量用MTT 法测定。

结果　分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12.5～14.5d ;20℃～25℃时,用0.25%胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min ;可在培养3～6d 后进行传代。

细胞冻存于-80℃3～4个月,复苏后能正常传代。

丝裂霉素C 抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg 105细胞,作用2～4h ,可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d 内不增殖也不死亡。

结论　在合适条件下,小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养,并能多次传代和冻存;经丝裂霉素C 处理后增殖受抑制,可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。

【关键词】　小鼠;胚胎;成纤维细胞;胚胎干细胞【中图分类号】Q952 【文献标识码】A 【文章编号】1002-1485(2002)04-0215-05Study on the Proliferation and Inhibition of Mouse Embryonic FibroblastsLIU Min ,LI Baiqing(Bengbu M edical College ,Bengbu 233003,China )【Abstract 】　Objective To establish mouse fibroblast cells as feeder cells in order to isolate and clone mouse embryonic stem cells in vitro .Methods The mouse primary embryonic fibroblasts were isolated from mouse fetus of different gestational ag -es ,under different separation and culture conditions .The proliferation of fibroblasts and in hibition of mytomycin C were observed by measuring cell numbers using MTT assay .Results The optimal gestational age for isolation of mouse embryonic fibroblasts was from on 12.5to 14.5day .At the temperature of 20to 25℃,the optimal ti me for digestion of fetus tissue to obtain fibroblasts was 3min with digestion solution containing 0.25%of trypsin .The optimal concentration of mytomycin c to inhibit proliferation of fi -broblasts was 20μg 105cells for 2to 4hours ,at that condition of treatment of mytomycin C the fibroblasts were alive for 9days without proliferation .Conclusion In this study the mouse embryonic fibroblasts were successfully established for growth of mouse embryonic stem cells .【Key words 】　Mice ;Embryo ;Fibroblasts ;Embryo stem cells[作者简介]刘民,男(1963-),高级实验师。

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。

以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。

- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。

- 取下小鼠/大鼠的皮肤。

使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。

3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。

- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。

- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。

- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。

定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。

4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。

- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。

一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。

- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。

这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。

通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。

小鼠肾成纤维细胞鉴定 vimentin-概述说明以及解释

小鼠肾成纤维细胞鉴定vimentin-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容主要是对小鼠肾成纤维细胞的研究背景和意义进行简要介绍。

可以根据以下内容进行编写：概述小鼠肾成纤维细胞是一类重要的细胞类型，广泛存在于小鼠肾脏组织中，并在多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。

这些细胞具有独特的表型和功能，可以通过特定的鉴定方法来准确识别。

近年来，随着生物学研究和生物医学领域的发展，对小鼠肾成纤维细胞的鉴定与研究引起了广泛的关注和研究兴趣。

通过对小鼠肾成纤维细胞的鉴定，我们可以深入了解其表型和功能特点。

首先，可以通过特定的细胞标记物如vimentin进行免疫细胞化学染色，从而确认其在组织中的定位和分布情况。

其次，通过研究小鼠肾成纤维细胞的特征和功能，可以了解其参与肾脏发育、维持肾脏结构和功能稳定的调节机制。

此外，小鼠肾成纤维细胞在肾脏疾病的发生和发展过程中也扮演着重要角色，其异常激活可能引起肾脏纤维化等病理变化。

深入研究小鼠肾成纤维细胞的重要性不仅可以加深对肾脏生物学过程的理解，也有助于揭示相关疾病的发生机制。

此外，对小鼠肾成纤维细胞进行进一步的应用和研究，也有助于发展针对肾脏疾病的新疗法和药物靶点。

本文将重点介绍小鼠肾成纤维细胞的鉴定方法、特征和功能，以及其在相关研究中的重要性和应用。

我们希望通过本文的撰写和阐述，能够促进对小鼠肾成纤维细胞的深入认识，进一步推动相关领域的研究发展，并为未来的研究方向提供重要参考。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以涉及以下几个方面：文章结构部分介绍了整篇文章的组织框架，主要包括引言、正文和结论三个部分。

引言部分是整篇文章的开篇，用来引入研究主题和背景，概述小鼠肾成纤维细胞的鉴定以及其重要性和应用。

接下来，文章会详细介绍小鼠肾成纤维细胞的鉴定方法、特征和功能，以及其在相关研究中的重要性和应用。

正文部分是本文的核心内容，主要分为2.1、2.2和2.3三个小节。

2.1 鉴定小鼠肾成纤维细胞：这一小节会详细介绍如何进行小鼠肾成纤维细胞的鉴定过程，介绍鉴定所使用的标志物和实验方法，以及鉴定结果的分析和解释。

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。

2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。

3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。

以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较DNA是生物体的基本遗传物质。

基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。

因此•学习、掌握DNA提取方法并对其迸行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。

国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法［2-7］，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法逬行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法［8-15］。

目前，传统的SDS法和CTAB 法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。

随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多［16-19］。

基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。

本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2试剂dNTP 'DNA Marker 高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司‘引物于Invitrogen北京分公司合成» CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。

小鼠MEF细胞分离方法

小鼠MEF细胞分离方法小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast，MEF）是从小鼠胚胎中分离并培养的一种成纤维细胞。

MEF细胞被广泛应用于细胞生物学实验中，例如：-作为体外培养基质，用于维持和扩增干细胞的生长。

以下是一种常见的小鼠MEF细胞分离方法：1.实验前准备：-将小鼠配对交配，取得受胎小鼠。

-受胎12.5天后，将受胎小鼠人道处死。

-用70%乙醇消毒显微镊子和剪刀。

-准备PBS缓冲液：将1×PBS固体溶解于去离子水中，加小量NaOH 调节pH至7.4，使用0.45μm滤器过滤并常温保存备用。

2.细胞分离：-将受胎小鼠置于消毒好的培养皿中。

-用显微镊子和剪刀剖开小鼠腹部，暴露子宫。

-将子宫取出并转移到新的培养皿中，用PBS缓冲液冲洗干净。

-使用显微镊子将子宫剪成小块，用PBS缓冲液冲洗掉残留的脂肪和血液。

-将子宫块转移到预先消化好的胶原酶溶液中，37°C孵育30分钟。

-用10mL预热的培养基密封试管，将胶原酶溶液过滤并收集上清液。

-加入培养基并轻轻振摇，使细胞均匀分散。

-将细胞转移到新的预热培养皿中，放入孵箱中培养。

3.细胞培养：-使用常规培养基（如DMEM/F-12）加10%FBS，将细胞培养至80-90%的传代。

-每3-4天更换培养基，以保持细胞的正常生长。

-在细胞达到足够密度时，可以使用三胎小鼠MEF细胞进行细胞冻存或进一步的实验。

MEF细胞的培养温度通常为37°C，使用5% CO2的培养箱进行培养，细胞密度在15,000-40,000细胞/cm²之间。

另外，为确保实验的成功，应注意以下几点：-所有实验仪器和试剂要经过严格的消毒和清洁，以防止细胞污染。

-在进行分离和培养过程中，避免细胞接触空气时间过长，以减少细胞受到氧化应激的影响。

-注意培养基的配制和使用，避免细胞受到菌落或受到培养基变质的影响。

新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定

度分别为１．３３３％和９８，ＮＨ３３细胞波形蛋白阳性率和平均荧光密度分别为２．１．９而ＩＴ８１％和１．６４１。结论：分离培养的细胞具有成纤维细胞的形态学特征，表达成纤维细胞的特征分子波形蛋白。并以组织块直接培养法成功自新生小
鼠皮肤分离培养成纤维细胞，建立肿瘤体外模拟微环境提供实验材料和研究基础。为
【键词１生小鼠；纤维细胞；外培养；形蛋白关新成体波
【中图分类号１３２１９．Ｒ【文献标识码】Ａ【章编号】１３７１２１）０（一０ — ４
１ＤｐｒｎｆＲｅｐｒｔｒｄｃｎ，ｔｅＦｒｔＡｆｉｔｄＨｏｐｔｌｏｉｍｅｎｖｒｉ，ＦｊｎＰｏｉｃ，Ｘｉｍｎ．ｅａｔｔｏｓｉｏｙＭｅｉｉｅｈｉｆｌｅｓｉｆＸａｎＵｉｅｔｕｉｒｖｎｅｍｅａｓｉａａｓｙａａｅ３１０，ｈｎ；．ｐｒｎｆＩｍｕｏｏｙＢｓｄｃｅＳｉｃｎｔｅＭｅｉａＣｌｇｆｉｍｅｎｖｒｉ，ｕｉ６０３Ｃｉａ２Ｄｅａｔｔｍｅｏｍｎｌｇ，ａｉＭｅｉｉｃｎｅｉｄｃｌｏｅｅｏａｎＵｉｅｔＦｊｎｃｎｅｈｌＸｓｙａ
Ｍｅｈｏ：Ｆｒｔｙｋｎｗａａｅｒｍｅｏｌｂｃｍｉｅａｄｍａｅｉｔｔｄｓｉｓ，ｓｉｓｔｋｎｆｏｎｗｂｒＢａ／ｃｎｄｎｏ１ｍｍｔｓｕｓｗｉｃｓｏｓｓｅｉｌ．ｅｏｄｙｌｎｉｓｅｔｓｉｓｒｔｒｌｙＳｃｎｌ，ｈｅ

小鼠成纤维细胞原代培养

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。

2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。

3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。

二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。

现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。

细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。

如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。

细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。

依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。

1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。

但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。

组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。

组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。

消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。

分离和培养MEF细胞

分离和培养MEF细胞主要实验步骤：（冰上操作）1）处死：首先，将怀孕13.5-14.5天的小鼠拿到一个饭盒中，采用脱颈椎的方法将小鼠处死，将小鼠浸泡在酒精中2-3min。

2）取胎鼠：将已处死的孕鼠拿到超净台上的大培养皿的盖子中，用一对剪刀和镊子剪开小鼠的腹部，取出胎鼠，边取边用剪刀将脐带剪开。

3）取胚胎：将取出的胎鼠转移至大培养皿中（装有预冷的1×PBS），用剪刀将外面包裹的两层膜剪开（外面一层膜稍厚，里面一层膜稍薄，两层膜中间是羊水），取出胚胎。

（冰上操作）4）去四肢和骨骼：将胚胎转移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用一对镊子轻轻的将头、四肢及躯干骨骼剔除，仅留肉（主要是躯干上的嫩肉），特别注意去尽血（血长得快，会对MEF造成很大影响）。

（冰上操作）5）消化：将组织块移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用小剪刀剪碎（小于1 mm 3的组织块，取5倍体积（可以多一点点）胶原酶IV（5mg/ml in surm-free DMEM，0.22um抽滤），反复吹散组织块，并用巴氏管将组织悬液转移至15 mL 离心管中，37℃水浴锅中消化30-60 min。

加入等体积的PBS终止。

6）过滤：将200目筛网置于一个新的培养皿中，将细胞悬液滴至筛网上过滤（如果比较粘稠滤不下去，可以再加一些PBS反复吹吸），过滤完后可用1mL培养基再冲洗一次。

7）离心：将滤液转移至一个新的15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

8）多聚赖氨酸处理培养皿：1ug/ml多聚赖氨酸（用水配成2mg/ml贮存液，用时用PBS稀释成工作浓度）润洗培养瓶，吸走多余的多聚赖氨酸，再用PBS洗一遍培养瓶。

9）接种：弃上清，向沉淀中加1 mL培养基，用枪将其吹打成细胞悬液。

血球计数板计数，并按照一定密度接种于处理过的培养瓶。

T75培养瓶可接种1×106细胞。

用含有10% FBS, 1% P/S的DMEM培养。

10）换液：4小时后换新鲜培养基。

细胞分离与培养技术

流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。
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细胞分离技术
二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：
人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹
过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
优缺点：
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。
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具体步骤：
单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3） ×107/ml的细胞悬液。
先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。
3.中性蛋白酶(Dispase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次
加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
在37℃孵育20分钟到几个小时。
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细胞分离技术
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase

成纤维细胞原代分离

成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离是指从组织中分离出成纤维细胞并进行初次培养的过程。

成纤维细胞广泛存在于各种组织中，如皮肤、肌肉、内脏器官等，它们在生理和病理过程中具有重要作用。

原代分离成纤维细胞有助于研究其生物学特性、功能及在疾病发生发展中的作用。

成纤维细胞原代分离的具体步骤如下：
1.选择实验动物或组织来源：根据研究需要，选择合适的实验动物或组织来源。

例如，研究心脏成纤维细胞，可以选择新生小鼠心脏作为组织来源。

2.取材：从实验动物或组织中获取成纤维细胞所在的部分，如心脏、皮肤等。

3.酶消化：使用适当的酶（如胶原酶、胰蛋白酶等）分解组织，以暴露成纤维细胞。

酶消化过程中，需要控制温度、时间和酶的浓度，以保证细胞充分分离。

4.分离细胞：将酶消化后的组织悬液通过离心、过滤等方法，分离出成纤维细胞。

此过程中，应注意保持细胞活力，避免过度剪切和机械损伤。

5.培养：将分离出的成纤维细胞接种到培养皿或培养瓶中，加入适当的培养基，置于适当的培养条件（如温度、湿度、气体环境等）下进行原代培养。

此时，成纤维细胞会开始生长、繁殖。

6.观察与检测：在培养过程中，通过倒置显微镜观察细胞形态、数量、生长速度等，以评估分离效果和细胞活力。

此外，还可以采用特定方法（如免疫细胞化学、细胞计数等）对细胞进行鉴定和功能研究。

成纤维细胞原代分离的成功与否取决于实验设计、操作技巧和细胞生物学知识。

为了获得高活力的成纤维细胞，需要在实验过程中严格控制条件，并熟练掌握相关技术。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养、实验材料1. 主要仪器设备(1) 倒置显微镜( Olympus，Japan)(2) CO2 培养箱( BB16HF，上海力申科学仪器有限公司)(3) 100ml 的玻璃培养瓶(江苏海门市大路塑料实验仪器厂)(4) 6 孔培养板( COSTA，R 每孔直径为3.5cm)(5) Eppendroff 管(6) 1ml,2ml,5ml 的玻璃滴管各30 支；10ml 尖底离心管和直径为8cm的平皿(7) 离心机(8) 5ml 冻存管(9) 两套小鼠用解剖器械(包括眼科剪和眼科镊)2. 主要试剂配制(1) MEF(mouse embryo fibroblast ，小鼠胚胎成纤维细胞) 培养液——低糖DMEM母液1) 用一个1000ml 的大烧杯加入1000ml 无菌无内毒素的超纯水(购自福州新北生化工业有限公司)；2) 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034) 全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4) 搅拌直至完全溶解。

5) 用1NHCl 或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3 ，调好PH后，将容器密封(在该实验中用1NHCl调PH至7.3 )。

6) 立即用0.22um 的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4 ℃保(1存个月内用完) 。

——MEF培养液取100ml 上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU 青霉素钠( 6.25mg )和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3 ，经0.22um 的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml 分装好的新生牛血清( Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL, 需56℃，30min 灭活过)，4℃保存至使用。

(2) PBS在500ml 超纯水中依次溶入NaCl 4.0gKCl 0.1gNa2HPO4.12HO2 1.445gKH2PO4 0.1g于121℃高压灭菌30min 或经0.22um 的滤器过滤除菌再分装入100ml 洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定_代阳

第21卷第1期天津农学院学报 V ol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March ，2014收稿日期：2013-12-19基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs 的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600）作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。

E-mail: aq19881209@。

文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定代阳1，王轶敏1，2，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬1，通信作者（1. 天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学生物工程研究所，陕西杨凌 712100）摘要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化，并利用RT -PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。

结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT -PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。

本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。

关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定中图分类号：Q813.1 文献标识码：AIsolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite CellsDAI Yang 1, WANG Yi-min 1,2, LIU Xin-feng 1, F AN Han-lu 1, LI Ji-xia 1,GUO Hong 1, DING Xiang-bin 1,Corresponding Author(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute ofBioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaa n xi Province, China )Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD ). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG ) and myosin heavy chain (MHC )showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated.Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1]，在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞。

小鼠基因组提取

小鼠基因组提取1.从小鼠尾巴尖位置减取约0.5cm小鼠尾巴2. 1.5mlEP管中加600μl Tail buffer（+蛋白酶K 20mg/ml）(蛋白酶K: Tail buffer=1:200)65℃2hr以上（消化干净即可）。

期间上下颠倒混匀几次。

3.加400μl体积比为25:24:1的酚：氯仿：异戊醇，漩涡震荡或者剧烈颠倒混匀，直至混合液呈现白色混浊状4.12000rpm 离心5min5.将EP管小心自离心机中取出，吸取400μl上清于一新管中6.加1ml无水乙醇，温和上下颠倒几次7.12000rpm 离心5min，弃上清。

8.12000rpm 再离心5min9.移液器吸取上清，沉淀干燥10.用100μlTE buffer 溶解沉淀Tail buffer1M Tris (PH=8.0) 5ml5M Nacl 7.5 ml0.5 M EDTA 25ml10% SDS 50mlddH2O up to 500 mlGneotyping PCR反应体系如下：小鼠基因组模板 2.8μl10×PCR buffer 2μldNTP(10μl) 1μlForward primer 1μlReverse primer 1μlTaq E 0.2μlddH2O up to 20μlGneotyping PCR反应程序如下：1.95℃2min2.95℃15s3.退火温度30s4.72℃1Kb/min2-4 35 cycles5.72℃3min6.16℃∞延伸时间和目的基因的片段长度和Taq E 的延伸效率有关，本实验室所用Taq E的延伸效率是1Kb/min。