人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。
以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。
- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。
- 取下小鼠/大鼠的皮肤。
使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。
3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。
- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。
- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。
- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。
定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。
4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。
- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。
一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。
- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。
这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。
通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
小鼠肺组织单细胞解离方案
小鼠肺组织单细胞解离方案一、引言小鼠肺组织单细胞解离是研究肺部细胞组成和功能的重要步骤。
通过将肺组织分解为单个细胞，可以进行细胞类型的鉴定、基因表达分析以及细胞功能研究等。
本文将介绍一种常用的小鼠肺组织单细胞解离方案。
二、材料与方法1. 实验动物选取特定小鼠品系，如C57BL/6小鼠。
2. 麻醉与灭活使用适量的麻醉剂对小鼠进行麻醉，如异氟醚。
随后，通过颈部脱臼或心脏穿刺等方式将小鼠灭活。
3. 肺组织采集将小鼠固定在手术台上，用消毒棉球将胸腔口封住，然后用剪刀剪开小鼠的胸膛，快速取出肺组织，并放入含有冷平衡盐液的离心管中。
4. 组织分解将肺组织放入离心管中的冷平衡盐液中，用剪刀剪碎组织，使组织均匀悬浮在液体中。
5. 细胞解离酶处理加入适量的细胞解离酶，如胰蛋白酶、DNase I等，对组织进行酶解。
根据实验需要，可以控制酶解的时间和酶解液的浓度。
6. 细胞过滤将酶解后的细胞悬液通过0.45μm或0.22μm的滤网进行过滤，去除大块组织碎片和其他杂质。
7. 细胞计数用细胞计数板对细胞进行计数，确定细胞的浓度和活力。
8. 细胞沉积将细胞悬液进行离心，以沉积细胞。
根据实验需要，可以调整离心的转速和时间。
9. 细胞重悬将沉积的细胞用含有细胞培养基的离心管重悬，使细胞均匀分散在培养基中。
10. 细胞培养将细胞培养在适宜的细胞培养条件下，如37℃恒温培养箱中，5% CO2含量的培养箱中，培养基可以根据实验需要进行选择和添加不同的培养因子。
三、结果与讨论通过以上步骤，我们成功地获得了小鼠肺组织的单细胞悬液。
这些细胞可以被用于各种下游实验，如单细胞转录组测序、流式细胞术、免疫组化等。
同时，这个方法也可以用于其他动物的肺组织单细胞解离。
需要注意的是，在进行肺组织解离时要尽量迅速以减少细胞的损伤。
同时，选择合适的酶解液浓度和酶解时间也是十分重要的，以充分酶解组织同时不过度消化细胞。
此外，细胞的过滤和计数也需要细心操作，以确保获得高质量的单细胞悬液。
鼠肺细胞的分离纯化及原代培养
［ ｂｔａｔ ｏｂｅｔ ｅ ｏｄｖｌ ｅａｒｌｂｅｍｅ ｏ ｏ ｏ ｔｎ ｕ ｆａｏ ｎ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ Ａ ｓ ｃ］ ｒ ｊｃｉ ：Ｔ ｅｅ ｐ ｅｉ ｌ ｔ ｄｆｒｓｌｉ ，ｐ ｒ ｃｔ ｎａｄｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｖ ｏ ａ ｈ ｉ ａｏ ｉ ｉ ｉ ｉ ｕ
ｌｎ ｂｏ ｌ ｔ Ｌ ｕ ｇｆ ｒｂａ （ Ｆ）ａ ｄ ｐ ｌ ｏ ａｙ ａ ｅｌ ａｒｐ ａ ｅ Ａ ｉ ｓ ｎ ｕｍ ｎｒ ｌ ｏ ｒｍ ｃｏｈ ｇ （ Ｍ）ｆ ｍ ｒｔｆｒｓ ｄｅ ｎ ｐｔｏｅｅｉ ａ ｄ ｖ ａ ｒ ａ ｏ ｔ ｉ ｏ ａ ｇｎ ｓ ｎ ｏ ｕ ｓ ｈ ｓ
第 １ 第 １期 ８卷
２０ ０ ８年 １ 月
江 苏 大 学 学 报（ 学 版） 医 Ｊｕ ａ ｏ Ｊ ｎｓ ｎｖｒ ｔ（ ｄｃｎ ｄｔ ｎ ｏｒ ｌ ｆ ｉ ｇｕ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｍｅｉ ｅＥ ｉｏ ） ｎ ａ ｅｉ ｉ ｉΒιβλιοθήκη Ｖｏ ＿ ８ Ｎｏ． ｌ１ １
Ｊｎ ０ ８ ａ ．２ ０
法 。方法 ： 采用胰 酶消化 出生后 ２ｄＳ Ｄ大 鼠肺组织 块及 Ｓ Ｄ大 鼠肺泡灌洗液 ， 差时贴壁法 ， 离 、 经 分 纯化红皮 鼠肺成 纤维细胞 （ｕｇｆ ｒｂ ｓ， Ｆ 和 ｓ １ｎ ｂｏｌ ｔ Ｌ ） Ｄ大鼠肺 泡巨噬细胞 （ ｕｍ ｎｒ ｌ ｏａ ｍ ｃｏｈｇ ， Ｍ） 并进 行原代培 养。用波 ｉ ａ ｐ ｌ ｏａｙａ ｅｌ ａｒｐａｅ Ａ ， ｖ ｒ 形蛋 白（ ｉ ｎｉ） Ｃ １ Ｖｍｅｔ 、 Ｄ ４细胞免疫荧光染 色 、 白质 印迹 和电镜 对所分离的细胞进行鉴定 。结果 ：所得细胞产量大 、 ｎ 蛋
纯 度 高 。细 胞 免 疫 荧 光 染 色 Ｌ Ｆ细 胞 波 形 蛋 白染 色 阳性 而 Ｃ １ 色 阴 性 ； Ｍ 细 胞 则 相 反 。 扫 描 电镜 观 察 可 见 肺 成 Ｄ ４染 Ａ
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
·1216·
中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
⼈类⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法Primary human/mouse lung fibroblast isolation⼈类/⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法参考⽂献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)Materials:材料：1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,2.5mg/ml (HBSS);b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）2. Nylon filters 40/70 µm3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)4. Knife (disposable)5. Syringe6. PBSDigestion solution:Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)步骤：1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =1:4:5, 100ul/10g weight;称重⼩⿏后⿇醉2. Inject and wait 10min till the mouse sleep腹腔注射后等待10分钟3. Open abdomen and cut the artery of the kidney打开腹腔切断肾动脉4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white注射器灌注15ml PBS后插⼊⼼脏冲洗⾄肺部变⽩5. Take out the lung and heart in the tube with ice将⼼脏和肺取出置于冰盒中保存6. Wash with 80% ethanol in 10s在80%酒精中漂洗10秒7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)PBS洗3次，每次10分钟（⽼⿏），每次30分钟（⼈），清洗时保存于冰盒中8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1hours (shake vigorously every 15min)使⽤⼀次性⽆菌⼑⽚将组织切成⼩块，并加⼊消化液在37度⽔浴锅中静置1⼩时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm使⽤70微⽶过滤器过滤标本10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm使⽤40微⽶过滤器过滤标本12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching aconfluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使⽤为4-9代。
小鼠原代kupffer细胞分离
1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。
腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。
灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。
放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。
待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。
待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。
用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。
然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。
Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。
先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。
离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。
原代细胞分离方法
原代细胞分离方法
原代细胞分离主要有两种方法：机械分散法和消化分离法。
机械分散法适用于纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织等。
具体步骤如下：
1. 将组织剪碎至1mm3的组织块。
2. 用PBS清洗两次，然后用吸管吹打分散组织细胞，或把已充分剪碎分散
的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
3. 收集细胞转入离心管中，以1000rpm/分钟离心5分钟。
4. 去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
消化分离法适用于细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
具体步骤如下：
1. 用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
2. 加入%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
次日再用Hanks液洗涤，弃去
上清，共洗2-3次。
3. 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
以上是原代细胞分离的两种主要方法，可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法进行操作。
小鼠MEF细胞分离方法
小鼠MEF细胞分离方法小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast，MEF）是从小鼠胚胎中分离并培养的一种成纤维细胞。
MEF细胞被广泛应用于细胞生物学实验中，例如：-作为体外培养基质，用于维持和扩增干细胞的生长。
以下是一种常见的小鼠MEF细胞分离方法：1.实验前准备：-将小鼠配对交配，取得受胎小鼠。
-受胎12.5天后，将受胎小鼠人道处死。
-用70%乙醇消毒显微镊子和剪刀。
-准备PBS缓冲液：将1×PBS固体溶解于去离子水中，加小量NaOH 调节pH至7.4，使用0.45μm滤器过滤并常温保存备用。
2.细胞分离：-将受胎小鼠置于消毒好的培养皿中。
-用显微镊子和剪刀剖开小鼠腹部，暴露子宫。
-将子宫取出并转移到新的培养皿中，用PBS缓冲液冲洗干净。
-使用显微镊子将子宫剪成小块，用PBS缓冲液冲洗掉残留的脂肪和血液。
-将子宫块转移到预先消化好的胶原酶溶液中，37°C孵育30分钟。
-用10mL预热的培养基密封试管，将胶原酶溶液过滤并收集上清液。
-加入培养基并轻轻振摇，使细胞均匀分散。
-将细胞转移到新的预热培养皿中，放入孵箱中培养。
3.细胞培养：-使用常规培养基（如DMEM/F-12）加10%FBS，将细胞培养至80-90%的传代。
-每3-4天更换培养基，以保持细胞的正常生长。
-在细胞达到足够密度时，可以使用三胎小鼠MEF细胞进行细胞冻存或进一步的实验。
MEF细胞的培养温度通常为37°C，使用5% CO2的培养箱进行培养，细胞密度在15,000-40,000细胞/cm²之间。
另外，为确保实验的成功，应注意以下几点：-所有实验仪器和试剂要经过严格的消毒和清洁，以防止细胞污染。
-在进行分离和培养过程中，避免细胞接触空气时间过长，以减少细胞受到氧化应激的影响。
-注意培养基的配制和使用，避免细胞受到菌落或受到培养基变质的影响。
肺成纤维细胞原代培养基本步骤
肺成纤维细胞原代培养基本步骤一、引言肺成纤维细胞是肺组织中的主要细胞类型之一，它们在肺部的结构和功能维持中起着关键作用。
原代培养是研究肺成纤维细胞生物学特性的重要手段之一。
本文将介绍肺成纤维细胞原代培养的基本步骤。
二、实验材料1. 无菌工具：无菌操作台、无菌吸管、无菌离心管等2. 细胞培养基：DMEM/F12（含10% FBS）、Penicillin/Streptomycin3. 消化液：Trypsin/EDTA4. 细胞收获液：PBS（含1% P/S）三、实验步骤1. 准备培养皿和培养液将DMEM/F12培养液加入到6孔板中，每孔加入2ml。
然后将板放入37℃恒温箱中预热。
2. 收集组织样本从小鼠或人体组织中收集需要的肺组织样本，并迅速转移到含有PBS （含1% P/S）的离心管中。
3. 组织消化将组织样本切碎成小块，然后加入2ml的Trypsin/EDTA消化液，放置于37℃恒温箱中消化30分钟。
4. 细胞分离将消化后的组织样本转移到无菌离心管中，用DMEM/F12培养液洗涤2次。
然后加入2ml的DMEM/F12培养液，在37℃恒温箱中振荡5分钟，使细胞分散均匀。
5. 细胞计数和接种用细胞计数板计数细胞数量，并将细胞接种到预热好的6孔板中。
每孔接种1×10^4个细胞。
6. 培养和观察将6孔板放入37℃恒温箱中培养，每天更换一次DMEM/F12培养液。
观察细胞生长情况，并在需要时进行下一步实验操作。
四、实验注意事项1. 手术器械、培养皿和培养液必须严格无菌。
2. 组织样本必须迅速转移至含有PBS（含1% P/S）的离心管中。
3. 消化时间不能过长，否则会对细胞产生不良影响。
4. 细胞接种密度要适当，过高或过低都会影响细胞生长。
5. 培养液必须每天更换一次，以保证细胞正常生长。
五、总结肺成纤维细胞原代培养是研究肺部生物学特性的重要手段。
本文介绍了肺成纤维细胞原代培养的基本步骤，包括准备培养皿和培养液、收集组织样本、组织消化、细胞分离、细胞计数和接种以及培养和观察等步骤。
原代细胞提取
原代细胞提取将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
原代细胞培养的步骤一般是：取材→分离→培养和维持，今天我们重点介绍原代细胞的取材和分离方法。
原代细胞是通过一定的方法如酶法或机械法或生长法使细胞从人体和动物的母体器官、组织或液体中分离出来，并在受控环境条件下分离的细胞在体外或其他人体和动物体内生长。
原代细胞的提取方法详细步骤：1.整个操作要在洁净通风的超净台下进行，所有的器材要高压消毒。
2.根据BALB/c小鼠的体重，将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内，这一步不仅可以消毒，也可以让小鼠体毛浸湿，后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。
3.用镊子轻轻挑起小鼠的心脏，装有PBS的注射器插入心尖，同时在右心耳处剪开一个小口，缓慢推动注射器，随着心脏的跳动，将体内的血液冲洗出来。
4.取出小鼠的肺部组织，将肺组织切成小米粒样的大小，置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。
5.将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中（培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面，4度过夜，小鼠处理前，将培养瓶放置培养箱中，使其温度恢复至37度），置于培养箱37度的环境下，消化4个小时。
6.消化4小时后，加入培养基（添加培养基，可以是正常培养时的2倍量），继续培养24小时（继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整）。
7.24小时后，取出肺组织，镜下观察细胞状态，换液。
8.原代细胞的提取和培养是很慢的过程，一般需等到24小时后，才能在镜下看到些许细胞群，一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。
9.原代细胞2-3天换液一次，因为内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。
所以，内皮细胞生长接近单层时就可以传代了，不要等到长得非常满。
人成纤维细胞提取方法
人成纤维细胞提取方法
人成纤维细胞的提取通常涉及以下几个步骤：
1. 组织取材：从健康的人体皮肤（通常是真皮层）中获取组织样本。
临床标本需要经过彻底清洗以避免污染，并且将真皮层尽可能剪碎，这有利于成纤维细胞的迁出。
2. 组织消化：使用适当的消化酶（如胶原酶）处理剪碎的组织，以帮助释放成纤维细胞。
新生儿真皮组织包含更多细胞和更少的细胞外基质，因此可以从新生儿组织中分离出细胞。
如果从成人皮肤中分离，可能需要使用更大量的起始组织并提高胶原酶浓度。
3. 细胞培养：将消化后释放出的细胞接种到培养皿中，并在适宜的培养条件下进行培养。
培养条件通常包括非动物源性或含血清的培养基，以及恒温恒湿的培养环境。
4. 细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要进行传代培养，以确保细胞的持续生长和扩增。
5. 细胞鉴定：通过形态学观察和特定的免疫化学标记来鉴定所提取的细胞是否为成纤维细胞。
成纤维细胞在形态上通常呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
总的来说，在进行人成纤维细胞的提取和培养时，需要在无菌条件下操作，使用二级生物安全柜，并采取适当的个人防护措施，如佩戴双层手套、护目镜和实验服。
同时，处理人体组织时应采取通用预防措施，并妥善处置受污染的材料。
原代细胞提取步骤
原代细胞提取步骤1.确定实验目的：首先需要明确实验目的，例如提取和培养肿瘤细胞、蛙卵或小鼠胚胎。
2.选取适当的生物材料：确定需要提取细胞的生物体，选择适当的生物材料，如动物组织、器官或细胞系。
3.准备培养基和试剂：根据实验目的，准备适当的培养基，如DMEM、RPMI-1640或F12培养基，以及所需的试剂和溶液，如胰酶和胆汁盐、PBS缓冲液、抗生素和抗菌剂。
4.杀死生物体并取出组织或器官：采取适当的方法杀死生物体，如禁食、麻醉或使用麻醉剂和杀菌剂。
然后，使用消毒的手术器械，如手术刀或剪刀，将组织或器官剖开。
5.分离组织或器官：将组织或器官从生物体中分离出来。
这可能需要研磨、离心或过滤等方法。
在这一步骤中要注意避免外部因素的污染，如尘埃、细菌和其他细胞。
6.细胞培养：将分离出的组织或器官放入含有预先准备好的培养基的培养皿或培养板中。
培养基中通常含有生长因子、维生素和其他必需的营养物质。
7.组织或器官的细胞释放：如果需要提取的是组织或器官中的细胞，可以使用胰酶和胆汁盐等消化酶，使组织或器官中的细胞分离。
这些消化酶可使细胞表面分子解离，从而使细胞更容易分离。
8.细胞的筛选和分离：将培养皿或培养板中的细胞进行筛选和分离，以获取所需的细胞。
可以使用免疫磁珠、细胞排序、细胞分选仪或显微操作等方法。
9. 细胞存活性检测：可以通过尝试性培养或使用染色剂如Trypan蓝来检测分离出的细胞的存活性。
存活的细胞可以进一步培养或进行其他实验。
10.细胞的培养和扩增：将分离出的细胞放入新的培养皿或培养板中，供其在培养基中继续生长和扩增。
根据需要，可以提供适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度。
11.细胞的保存和冻存：如果需要保存或冻存细胞，可以使用冷冻保存液如DMSO（二甲基亚砜），将细胞储存于低温环境中。
总结起来，原代细胞提取涉及到生物体杀死、组织或器官分离、细胞培养和细胞分离等步骤。
这些步骤需要精确、细致地操作，以确保提取到的细胞是纯净和活力良好的。
成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离成纤维细胞（Fibroblasts）是一类广泛存在于动、植物体内的间质组织细胞，其具有多种功能。
成纤维细胞的主要生物学行为包括：孕育、修复与再生实体组织，并参与各种组织间质损伤的修复过程。
现有许多方法可以分离成纤维细胞，而细胞培养和原代培养是常用工具。
成纤维细胞原代分离通常通过培养肌肉、皮肤、肺、肝和腎等动物组织、器官或细胞，以获得原代成纤维细胞的无纯化晶亚群体。
以下是关于成纤维细胞原代分离的一种标准方法：1. 实验设计首先，确定实验的目标以及需要使用的活体组织类型。
比如，我们可以选择人体皮肤组织来原代分离成纤维细胞。
2. 组织采集准备好适当的工具和材料，如无菌外科器械、无菌离心管和培养皿等。
使用外科刀片或剪刀，从患者的皮肤组织中取得小块组织，确保采样器械和工作区域的无菌性。
3. 组织预处理将取得的组织块用生理盐水或适当的缓冲液洗涤，去除表面的血液、分泌物和其他污染。
然后，将组织切成小块，通常为2-3毫米的大小。
4. 组织消化将组织块转移到含有胶原酶或胰酶的消化液中。
消化液的配方取决于实验设计和细胞类型。
将组织块放入消化液中，以便细胞在适当的温度和时间内进行消化，并将成纤维细胞释放到溶液中。
5. 细胞离心将消化后的细胞悬液通过离心的方法分离成纤维细胞和其他细胞类型。
通常，离心液会使较重的细胞落入沉淀层中，而较轻的细胞则悬浮在上层液体中。
6. 细胞培养将上层液体中的细胞取出，移至预先准备好的培养皿中。
加入细胞培养基，通常为DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
培养基中还可加入适量的青霉素和链霉素等抗生素，以防止污染。
将培养皿放入恒温培养箱中，在适宜的温度、湿度和气体环境下进行培养。
7. 细胞传代当细胞培养至80%～90%的密度时，使用胰酶或胰蛋白酶等消化酶将细胞分离，并移至新的培养皿中。
根据需要，可以重复传代过程来扩大细胞培养的数量。
成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离是指从组织中分离出成纤维细胞并进行初次培养的过程。
成纤维细胞广泛存在于各种组织中，如皮肤、肌肉、内脏器官等，它们在生理和病理过程中具有重要作用。
原代分离成纤维细胞有助于研究其生物学特性、功能及在疾病发生发展中的作用。
成纤维细胞原代分离的具体步骤如下：
1.选择实验动物或组织来源：根据研究需要，选择合适的实验动物或组织来源。
例如，研究心脏成纤维细胞，可以选择新生小鼠心脏作为组织来源。
2.取材：从实验动物或组织中获取成纤维细胞所在的部分，如心脏、皮肤等。
3.酶消化：使用适当的酶（如胶原酶、胰蛋白酶等）分解组织，以暴露成纤维细胞。
酶消化过程中，需要控制温度、时间和酶的浓度，以保证细胞充分分离。
4.分离细胞：将酶消化后的组织悬液通过离心、过滤等方法，分离出成纤维细胞。
此过程中，应注意保持细胞活力，避免过度剪切和机械损伤。
5.培养：将分离出的成纤维细胞接种到培养皿或培养瓶中，加入适当的培养基，置于适当的培养条件（如温度、湿度、气体环境等）下进行原代培养。
此时，成纤维细胞会开始生长、繁殖。
6.观察与检测：在培养过程中，通过倒置显微镜观察细胞形态、数量、生长速度等，以评估分离效果和细胞活力。
此外，还可以采用特定方法（如免疫细胞化学、细胞计数等）对细胞进行鉴定和功能研究。
成纤维细胞原代分离的成功与否取决于实验设计、操作技巧和细胞生物学知识。
为了获得高活力的成纤维细胞，需要在实验过程中严格控制条件，并熟练掌握相关技术。
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Primary human/mouse lung fibroblast isolation
人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)
Materials:
材料：
1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,
2.5mg/ml (HBSS);
b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)
消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）
b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）
2. Nylon filters 40/70 µm
3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%
Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)
4. Knife (disposable)
5. Syringe
6. PBS
Digestion solution:
Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)
步骤：
1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =
1:4:5, 100ul/10g weight;
称重小鼠后麻醉
2. Inject and wait 10min till the mouse sleep
腹腔注射后等待10分钟
3. Open abdomen and cut the artery of the kidney
打开腹腔切断肾动脉
4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white
注射器灌注15ml PBS后插入心脏冲洗至肺部变白
5. Take out the lung and heart in the tube with ice
将心脏和肺取出置于冰盒中保存
6. Wash with 80% ethanol in 10s
在80%酒精中漂洗10秒
7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)
PBS洗3次，每次10分钟（老鼠），每次30分钟（人），清洗时保存于冰盒中
8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1
hours (shake vigorously every 15min)
使用一次性无菌刀片将组织切成小块，并加入消化液在37度水浴锅中静置1小时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）
9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm
使用70微米过滤器过滤标本
10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium
400 g, 4°C, 离心5分钟，离心后加入完全培养基重悬
11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm
使用40微米过滤器过滤标本
12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium
400 g, 4°C, 离心5分钟，离心后加入完全培养基重悬
13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching a
confluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.
2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使用为4-9代。