淋巴细胞的分离方法
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
小鼠脾脏中分离淋巴细
胞
Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。
无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。
个人用1500转/分钟，20分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。
４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。
一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。
得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。
但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
详细的淋巴细胞的分离计数图文教程
注意事项
稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
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细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
用Hank’s液洗、离 心 (1000rpm，5min) 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与单 核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
.
本实验：淋巴细胞
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实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
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实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
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实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×10 (稀释倍数）
2
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞百分率 =
活细胞数
细胞总数
.
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
淋巴细胞 分离方法
淋巴细胞分离方法淋巴细胞是免疫系统中的一类重要细胞，它们在保护机体免受病原体和其他外部侵袭物的侵害中起着重要作用。
为了研究和理解淋巴细胞的功能和特性，需要从体内样本中分离出淋巴细胞。
本文将介绍几种分离淋巴细胞的常用方法。
1. 密度梯度离心法密度梯度离心法是最常用的分离淋巴细胞的方法之一。
该方法基于淋巴细胞与其他细胞（如红细胞和中性粒细胞）在离心过程中在不同密度梯度下沉降速度的不同。
一种常用的密度梯度离心介质是Ficoll-Hypaque，它是一种高渗透压溶液。
将全血或其他样本与Ficoll-Hypaque混合后离心，淋巴细胞会沉积在密度梯度下层，其他细胞则沉积在上层或底层。
通过取得下层液体，可分离得到富含淋巴细胞的悬浮液。
2. 黏附法黏附法是一种常用的非离心方法。
它基于淋巴细胞与塑料或玻璃表面的亲和性差异。
将样本与普通培养皿等容器接触，淋巴细胞会黏附在容器表面，而其他细胞则较少或不黏附。
在培养过程中，淋巴细胞会逐渐扩增，并可以通过洗涤等步骤分离得到。
3. 磁珠法磁珠法是一种利用磁性特性分离淋巴细胞的方法。
通过将淋巴细胞表面标记上磁珠特异抗体，使其与抗体携带的磁珠结合，然后通过磁场使磁珠和与其结合的淋巴细胞沉降在一侧，从而分离出淋巴细胞。
这种方法可以非常精确地分离出特定类型的淋巴细胞。
4. 细胞排序法细胞排序法是一种高级的分离淋巴细胞的方法，它基于流式细胞术或荧光激光共聚焦显微镜等技术。
这种方法通过在淋巴细胞表面标记上荧光染料或抗体，然后使用器械和设备进行精确的细胞分选。
这种方法可以快速准确地分离出不同类型的淋巴细胞，并可以进一步进行功能和表型分析。
尽管以上方法在分离淋巴细胞中非常有效，但每种方法都有其局限性。
例如，密度梯度离心法在操作过程中可能会对淋巴细胞产生一定的损伤；黏附法可能对特定类型的淋巴细胞选择性较差；磁珠法和细胞排序法则需要较为复杂的设备和技术。
因此，在具体选择方法时需要综合考虑研究的目的、操作难度和资源条件等因素。
淋巴细胞分离的实验方法
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是机体中重要的免疫细胞，其培养方法对于研究免疫功能、疾病发生机制以及药物筛选具有重要意义。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，帮助研究者进行淋巴细胞的体外培养。
一、材料和试剂准备1. 血液样品：采集新鲜、无菌的血液样品，尽量避免使用已保存的血液。
2. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
3. 补充物：培养基中可添加的补充物包括胎牛血清(FBS)、人血清(HS)、重组细胞因子等。
4. 抗生素：培养过程中可添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素等，以抑制细菌和真菌的污染。
二、淋巴细胞分离1. 密度梯度离心法：将新鲜血液样品稀释后，加入离心管中，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，离心后淋巴细胞会沉积在离心管底部，可用无菌移液器吸取上清液。
2. 磁珠分离法：利用磁珠表面特异性抗体与淋巴细胞表面标志物结合，通过磁力将淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞培养1. 细胞计数和调整：将分离得到的淋巴细胞进行细胞计数，根据需要调整细胞密度，通常为1-2×10^6个细胞/mL。
2. 培养基配置：根据实验需要配置相应的培养基，通常包括培养基、补充物和抗生素。
3. 培养条件：将淋巴细胞悬浮液均匀地加入含有培养基的培养皿中，置于37℃恒温培养箱中，通常采用5% CO2气氛。
4. 细胞增殖：培养过程中，淋巴细胞会进行增殖，可根据需要进行细胞传代。
5. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养液，以保持培养环境的稳定。
6. 实验操作：在培养过程中，可根据具体实验需要进行细胞刺激、药物处理等，以模拟体内环境或研究特定的生物学功能。
四、细胞检测和分析1. 细胞活力检测：使用细胞活力试剂盒等方法，对培养的淋巴细胞进行细胞活力检测，评估其生存状态和增殖情况。
2. 免疫分析：可使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等方法，对培养的淋巴细胞进行免疫表型分析、细胞因子检测等。
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验报告
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验报告1、实验目的掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞2、实验原理红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。
3、实验试剂和器材Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。
4、实验步骤1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。
2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。
去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。
3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。
4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。
用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。
剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。
5、实验结果1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。
2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。
6、实验分析及讨论（一）实验讨论1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。
2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。
3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。
淋巴细胞及其亚群的分离
淋巴细胞及其亚群的分离为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。
一、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。
（一）粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。
因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。
（二）吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。
此法简单易行，对细胞极少损害。
（三）磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。
二、淋巴细胞亚群的分离分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。
其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。
常用以下几种方法：（一）E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。
浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
（二）尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B 细胞分开。
操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。
人淋巴细胞分离液
人淋巴细胞分离液
人淋巴细胞来源于人外周血，可根据不同实验目的可选择密度梯度离心法、吸附分离法或其它特殊分离方法。
Böyum在密度梯度离心法的基础上提出通过使用Ficoll®甲泛影钠溶液离心快速分离的方法，操作更方便、更快速。
稀释的血液在Ficoll®甲泛影钠溶液中通过短时间的低速离心即可分层，红细胞和粒细胞沉降至管底、淋巴细胞和血小板在中间形成2个分层。
MP Bio生产的LSM，成功地用泛影酸钠代替了甲泛影酸钠，是一种灭菌过滤溶液，每100毫升包含6.2克聚蔗糖和9.4克泛影酸钠。
密度是1.0770-1.0800克/毫升20℃。
使用说明：
1.轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合
2.无菌转移3mlLSM到15ml离心管中。
3.混合2ml除纤维蛋白血液或肝素处理血液和2ml生理盐水
4.仔细的将稀释血液加入3mlLSM（室温）于15ml离心管中，在血液和LSM 中形成一个明显的分层。
不要将稀释血液混合入LSM中。
5.室温下400g离心15-30分钟，离心可以沉淀红细胞和多核白细胞同时可以在LSM上形成一层单核淋巴细胞。
6.吸出淋巴细胞上方2-3mm的血浆。
7.吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM和转移到另外的一个离心管。
加入等体积的平衡盐缓冲液至淋巴细胞离心管中，室温离心10分钟，离心速度设定在既不损伤细胞又能沉淀细胞即刻，例如160–260x g（去除LSM和降低血小板的百分比）。
8.用平衡盐缓冲液清洗细胞，用适当的培养基重悬细胞。
提取结肠固有层淋巴细胞的过程
提取结肠固有层淋巴细胞的过程提取结肠固有层淋巴细胞是一项常见的实验操作，用于研究肠道免疫系统和疾病发生机制等。
以下是提取结肠固有层淋巴细胞的基本步骤：
1.动物准备：选择合适的实验动物（如小鼠、大鼠等），按照实验需要进行处理和麻醉。
2.结肠解剖：使用手术刀具将动物的腹部剖开，暴露出结肠。
将结肠取出并置于含有冷生理盐水或其他细胞培养液的培养皿中。
3.清洗结肠：用冷生理盐水或其他适当的缓冲液冲洗结肠，去除结肠表面的粪便和其他杂质，以减少后续实验的干扰。
4.切割结肠：使用细剪刀或刀片，将结肠切成小块，并转移到含有适当酶解液（如胰蛋白酶、DNA酶等）的培养皿中。
5.酶解结肠：将切割好的结肠组织在酶解液中进行酶解，通常需要在37摄氏度下恒温孵育数十分钟至数小时，以便将结肠组织中的细胞释放出来。
6.过筛过滤：将酶解后的结肠组织经过细孔过滤器（如70μm 的过滤网）过滤，以去除残余的组织碎片和大块细胞，得到较为纯净的细胞悬液。
7.离心分离：将过滤后的细胞悬液离心，通常采用低速离心（如1000rpm，5分钟），以沉淀细胞。
8.去除上清液：将上清液倒掉，保留沉淀的细胞沉淀。
9.淋巴细胞分离：采用密度梯度离心法（如离心上清液于50%离心液和75%离心液的密度梯度上）或磁珠分离法等方法，分离出
结肠固有层淋巴细胞。
10.细胞计数：使用显微镜和血细胞计数板等设备，对分离得到的淋巴细胞进行计数。
11.存储或应用：将分离得到的淋巴细胞用于后续的实验操作，如细胞培养、流式细胞术、免疫组织化学等。
以上是提取结肠固有层淋巴细胞的基本步骤，具体操作中需根据实验目的和动物模型的特点进行调整和优化。
免疫磁珠法分离淋巴细胞亚群的原理
免疫磁珠法分离淋巴细胞亚群的原理
免疫磁珠法分离淋巴细胞亚群的原理是通过利用特定抗体与目标细胞表面的特定抗原结合的特性，将目标细胞靶向地标记上磁珠，然后利用磁力将标记了目标细胞的磁珠选择性地分离出来。
具体步骤如下：
1. 抗体偶联磁珠：将特异性抗体与磁珠结合，形成用于标记目标细胞的磁珠-抗体复合物。
抗体可以是针对目标细胞亚群特
异性表面抗原的单克隆或多克隆抗体。
2. 标记目标细胞：将磁珠-抗体复合物加入待分离细胞混悬液中，复合物通过特异性结合与目标细胞的表面抗原相互作用，实现目标细胞的特异性标记。
3. 磁力分离：在磁力作用下，磁珠与目标细胞形成复合物，可以通过磁场或磁力分离器将带有目标细胞的磁珠复合物沉积在容器壁或磁力分离器上，分离出目标细胞。
4. 分离后处理：将分离得到的目标细胞亚群从磁珠上解离下来，可以通过适当条件（如改变溶液温度、离心等）解除磁力作用，从而得到纯净的目标细胞亚群。
这种方法可以实现对淋巴细胞亚群的分离，提供纯净的细胞种群用于后续的细胞功能和表型分析，研究淋巴细胞功能、免疫调控等生物学过程。
分离纯化的淋巴细胞亚群的原则是
分离纯化的淋巴细胞亚群的原则是
1、利用分子间的化学特征（如粘附性，亲和性，穿透性等）：通过利用不同细胞间分子间的化学特征来分离不同的淋巴细胞亚群。
2、利用细胞内特征：通过利用细胞内的蛋白质和RNA来分离不同的淋巴细胞亚群。
3、利用细胞表面抗原及免疫细胞：利用抗原抗体和免疫细胞结合，以区分细胞。
4、利用分流和密度梯度离心：分流和密度梯度离心用于分离不同浓度的淋巴细胞。
5、中和血清：中和血清（如佐副宁）可以用于分离抗原性高的淋巴细胞。
6、杂交：通过利用不同种类的细胞组合来进行分离。
7、利用黏附性：通过利用细胞的黏附性，可以用于分离不同的淋巴细胞亚群。
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淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
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1、淋巴细胞的来源：
人淋巴细胞的方便来源是外周血
分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。
根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
2、密度梯度离心法：
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
3、实验方法：
1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）
2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）
3、20℃，1500r/min，离心30min
从上一次至下
稀释的血浆、血小板
PBMC
Ficoll
红细胞、粒细胞
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。
6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。
7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95%
淋巴细胞约占90%～95%
4、淋巴细胞高纯度化
(一)红细胞的去除
一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。
(二)血小板的去除
将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。
在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。
（三）单核细胞和粒细胞的去除
1．粘附去除法
原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。
采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。
优点：简便易行，对细胞损伤极少。
缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。
该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
2．羰基铁粉吞噬法
原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。
方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。
方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。
3．苯丙氨酸甲酯去除法
原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。
用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。
该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
5、淋巴细胞亚群的分离
原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
常用方法：
（1）E花环分离法
（2）尼龙纤维分离法
（3）流式细胞术
（4）磁珠分离术
（5）亲和板结合分离法。