小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
热休克对小鼠胚胎成纤维细胞CaM mRNA和HSF活性的影响
００ ） ．１ ，但与 ４ 处理 组相 比 ，４ ０ｑ Ｃ ２℃处理组细胞 的 Ｃ Ｍ ｍ Ｎ ａ Ｒ Ａ表达量略 有下 降。通过 凝胶 阻滞 分析检测 Ｈ Ｆ与 Ｓ
Ｄ Ａ 的 结合 活性 ，发 现 与 对 照 组 相 比 ，３ 、 ４ Ｎ ８ Ｏ和 ４ ２℃热 休 克 处 理 明 显 增 加 了 Ｈ Ｆ活 性 。 Ｓ
Ｌ Ｊ ｂ ， Ｈ Ｇ Ｘａ ＴＡ ｎｕ Ｃ Ｏ Ｒ ｎ ｆｎ ， Ａ ｈ ｎ ｏ ｇ Ｚ Ａ Ｇ Ｇ ｉ Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｉ ｉ ｏ Ｚ ＡＮ ｉ， ＩＮ Ｗｅ ｒ， Ａ ｏ ｇｅ ｇ Ｇ Ｏ Ｓ ａ ｓ ｎ ， Ｈ Ｎ ｕｌ ｎ ｉ ｏｌ ｅ ｏ ｎ（ ｅ
Ａｎｍ ａ ｉ ｌ ｃｅ ｃ ａ ｄ Ｓ ｉｎ ｅ ｎ Ｖｅｅ ｉａ ｙ ｔ ｒ ｏ ｇ ｉ ｌ ａ ｃ ｕ Ｕｎｖ ｒｉ ， Ｑｉｇ ａ Ｓｈ ｎ ｏ ｇ ｉ ｓｔ ｅ ｙ ｎｄｏ ａ ｄ ｎ
Ｈ Ｆ ｂ ｓ ｇｔｅｍｅｈ ｄ ｆ Ｔ Ｐ Ｒ ａ ｄ Ｇ ｌ ｂｉ ｈ ｓａ （ＭＳ ） ｆ ｒｈ ｒ ｒ ｃ ｌ ｒｄ Ｓ ｙｕ ｉ ｔｏ ｓｏ — Ｃ ｎ ｅ ｍｏ ｉｙｓ ｉ ａ ｓｙ Ｅ Ａ ａ ｅ ｅ ｐｉ ｙ ｕ ｕｅ ｎ ｈ Ｒ ｌ ｔ ｔ ｆ ｔ ｔ ｍａ ｔ
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
⼈类⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法Primary human/mouse lung fibroblast isolation⼈类/⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法参考⽂献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)Materials:材料：1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,2.5mg/ml (HBSS);b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）2. Nylon filters 40/70 µm3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)4. Knife (disposable)5. Syringe6. PBSDigestion solution:Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)步骤：1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =1:4:5, 100ul/10g weight;称重⼩⿏后⿇醉2. Inject and wait 10min till the mouse sleep腹腔注射后等待10分钟3. Open abdomen and cut the artery of the kidney打开腹腔切断肾动脉4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white注射器灌注15ml PBS后插⼊⼼脏冲洗⾄肺部变⽩5. Take out the lung and heart in the tube with ice将⼼脏和肺取出置于冰盒中保存6. Wash with 80% ethanol in 10s在80%酒精中漂洗10秒7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)PBS洗3次，每次10分钟（⽼⿏），每次30分钟（⼈），清洗时保存于冰盒中8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1hours (shake vigorously every 15min)使⽤⼀次性⽆菌⼑⽚将组织切成⼩块，并加⼊消化液在37度⽔浴锅中静置1⼩时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm使⽤70微⽶过滤器过滤标本10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm使⽤40微⽶过滤器过滤标本12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching aconfluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使⽤为4-9代。
原代培养中成纤维细胞的抑制
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
细胞工程实验
二、实验方法与步骤
2.接种并进行原代培养 （1）细胞计数，按照1*105个/ml接种于培养瓶中 （2）48小时换液，4-5天后传代 3.传代培养 （1）传3-5代，并长满瓶底部，并换液备用于第 二天处理 4.丝裂霉素C处理细胞 （1）用20mg/L和10 mg/L以及空白组的丝裂霉 素C处理2.5-3.5小时 （2）弃去含有丝裂霉素C培养液
3、橡皮器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗
5%NaOH煮10 ′ ～20′ 水洗 4%盐酸煮10 ′ ～20′ 水洗8~10次 单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用
4、金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟
水洗 95%酒精纱布擦干
包装灭菌
5、细胞的消化传代方法
二、实验方法与步骤
1.MEF的获取：
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF）
二、实验原理
由于细胞的全能性，在合适的 生长条件下，一定浓度的细胞分裂 素和生长素配比可以诱导植物的外 植体脱分化产生愈伤组织，为进一 步再分化创造条件。
植物细胞全能性
三、实验材料与器具
高压灭菌锅、普通及精密天平、 玻璃器皿（烧杯、1000、500mL容量
瓶、移液管、试剂瓶、1000、500、
吸除或倒掉旧培养液 加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液） 肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟 显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立 即终止消化
MEF冻存液冻存液
3.消化细胞行细胞计数
3.1.按2.1～2.6，消化细胞。 3.2.用吸管将细胞悬液吹吸混匀。 3.3.用移液器吸取10μl细胞悬液加到计数器。 3.4.10×物镜观察4个方格。
4. 细胞计数
4.1.计数4个方格的细胞数 4.2.平均细胞数=所数方格的总细胞数/所数方格 数 4.3.每ml细胞数=平均细胞数×稀释倍数/10-4 ml 4.4.细胞总数=每ml细胞数×细胞悬液总体积 4.5.铺6孔板所需的细胞数=0.75×105/ml×2.5ml/ 孔×6孔×6孔板个数 4.6.需要取出的细胞悬液量=细胞数/每ml细胞数
1.解冻MEF
1.7.缓慢加入5ml MEF培养基，轻轻混匀。 1.8.200g×5分钟离心，去掉冻存液。 1.9.弃掉上清。 1.10.加入25ml MEF培养基重悬细胞。 1.11.将细胞悬液转移至T175培养瓶(未经明胶包 被)。 1.12.置于培养箱中培养，每天观察细胞密度。
2பைடு நூலகம் MEF传代
6. MEF的收集和冻存
6.6.收集所有细胞悬液至一50ml离心管， 6.7.让组织块自然沉降，吸取上层细胞悬 液至另一50ml离心管。 6.8.200g×5分钟，离心。 6.9.用新鲜MEF培养基重悬细胞。 所需MEF培养基的数量=T175培养瓶 的个数×3/2
6. MEF的收集和冻存
6.10.加等量的冻存液(2 ×)混合均匀。 6.11.每支1.5ml 冻存管中加入1ml细胞悬液，拧 紧盖子，置于异丙醇程序降温盒中。 6.12.迅速将程序降温盒放入-80℃冰箱，过夜。 6.13.将冻存管转至液氮罐。
第二部分
MEF传代培养与饲养层制备
1.解冻MEF
1.1.从液氮罐中取出一支MEF。 1.2.用手来回搓冻存管10-15秒。 1.3.将冻存管置于37℃水浴锅水浴，轻轻晃动， 注意：不要让水淹过瓶盖。 1.4.当只有小块冰团存在时停止水浴。 1.5.用95%乙醇擦拭冻存管，晾干。 1.6.吸出细胞。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
培养动物细胞
转化后的细胞可能具有恶性 性质，也可能仅有不死性而 无恶性。
永久细胞系的特征
细胞形态已发生变化，比如细胞 变小，附性减少，具有较高的 核质比；
生长速率增加，倍增时间缩短； 对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低； 细胞异倍体和非整倍体增加，细
主要作用于赖氨酸或精氨酸 相连接的肽键，使细胞间 质中的蛋白水解而使细胞分 散开来。
适用于细胞间质较少的软组 织。
胰 酶 浓 度 一 般 为 0.125% 和 0.25% ， pH 为 8.0 ， 最 适 温 度37℃。
胶原酶消化法
对胶原有很强的消化作用 只对细胞间质有较好的消化 作
用，而对细胞本身影响不大. 适用于消化分离纤维性组织、 结
细胞培养用液
细胞培养用液
水 平衡盐溶液：主要由无机盐和葡萄糖组成
消化液：胰蛋白酶液、Na2-EDTA液、胶原蛋白酶液 消化液抑制液：血清、大豆胰酶抑制剂 pH调整液:NaHCO3溶液和羟乙基哌嗪乙磺酸液 抗生素液:常常青霉素和链霉素结合使用 谷 氨酰胺补充液:很不稳定，需要单独配制
5.4 原代培养技术
上皮型细胞
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角 上皮型细胞
形，中间有圆形核。 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层
—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群 而单个活动。 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。
在开放培养时，一般把细胞置于 95%空气和5%二氧化碳的混合气体 环境中进行培养。
二氧化碳培养箱
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
31
动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
28
动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
29
动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
30
动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
27
动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
一、实验材料
1．主要仪器设备
倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）
2．试剂
RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶
3．实验动物
孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤
1. 获取小鼠胚胎
(1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上
(2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的
皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。
(3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整
个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。
将子宫置于无菌滤纸
上去除血迹。
(4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。
(5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带
有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。
(6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和
内脏，得鼠胚躯干。
(7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血
色。
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）
(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成
约1 mm3以下的碎块。
(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底
离心管中。
(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。
(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可
见组织块变得较为粘稠）。
(5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织
碎块沉淀。
(6) 每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培
养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。
(7) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，
5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。
(8) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，
周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有
的是呈圆形的上皮细胞。