小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

一、实验材料

1．主要仪器设备

倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）

2．试剂

RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶

3．实验动物

孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。

二、实验步骤

1. 获取小鼠胚胎

(1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上

(2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的

皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。

(3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整

个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸

上去除血迹。

(4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。

(5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带

有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

(6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和

内脏，得鼠胚躯干。

(7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血

色。

2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）

(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成

约1 mm3以下的碎块。

(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底

离心管中。

(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。

(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可

见组织块变得较为粘稠）。

(5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织

碎块沉淀。

(6) 每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培

养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。

(7) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，

5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。

(8) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，

周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有

的是呈圆形的上皮细胞。