成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
物品准备：
6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：
（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）
（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。