TALENs的靶向基因修饰技术易懂版
基因编辑技术中的TALENs技术介绍
基因编辑技术中的TALENs技术介绍TALENs技术是一种先进的基因组编辑技术，全称为转录激活因子样效应物核酸酶技术(TranSCriPtion Activator-Like Effector Nucleases) o TALENs技术利用一种由植物细菌分泌的天然蛋白——TAL效应子，来识别和结合特异性DNA碱基对。
通过将TAL效应子与核酸酶结合,TALENs 技术可以实现对特定DNA序列的定向剪切，从而达到基因组编辑的目的。
TALENs技术的应用非常广泛，它可以用于治疗遗传性疾病、改良作物、病毒抵抗等多个领域。
在医学领域，TALENs技术可以用于治疗一些遗传性疾病，例如囊性纤维化、血友病和杜氏肌营养不良症等。
通过修改患者体内导致疾病的基因，TALENs技术可以治愈这些疾病。
此外，TALENS 技术还可以用于癌症治疗、病毒抵抗等领域。
相比其他基因组编辑技术，TALENs技术具有更高的特异性和精准度，能够实现高效、精确的基因组编辑。
同时，TALENs技术的设计原理相对简单，能够广泛应用于不同领域的研究中。
然而，TALENS技术也存在一些挑战和风险。
首先，TALENS技术的操作过程比较复杂，需要设计和构建大量的TALEN质粒，这使得其实施成本较高。
其次，TALENs技术仍然存在脱靶效应和免疫反应等风险，需要进一步研究和改进。
总的来说，TALENs技术是一种非常有前途的基因组编辑技术，具有广泛的应用前景和潜力。
虽然存在一些挑战和风险，但随着技术的不断进步和应用领域的拓展，相信这些问题也将逐渐得到解决。
同时，我们也需要认真思考和解决基因编辑技术所涉及的伦理和社会问题，以确保其合理和负责任的应用和发展。
TALEN和CRISPER基因靶向技术
The sgRNA is a 102-nt-long chimeric noncoding RNA, consisting of a 2025nt target-specific complementary region, a 42-nt Cas9-binding RNA structure and a 40-nt transcription terminator derived from S. pyogenes. The PAM sequence, consisting of a 2- to 5-bp recognition site that varies depending on the CRISPR system and the host organism, is a key motif that is recognized by the CRISPR machinery for spacer acquisition and subsequent NGG tar -get interference. 42nt
TALEN核酸酶
DNA 识别域 TALE
A T T C T G C T A A C T C A T A C
DNA剪切域 FokI NI C’ HD NG NN → → → → A C T G
N’
LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
TALE domain: DNA 识别域
CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列 (spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。
TALENs的靶向基因修饰技术
对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序
列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更 好的活性。
TALENs的靶向基因修饰技术 TALENs--transcription activator-like effectors nucleases
简介
基因组靶向修饰
诱变技术
转基因技 术
转录激活子样效应因子 生物应用模型构
核酸酶技术（TALENs）
建
RNAi技术
锌指核酸酶 技术
反义吗啡 林技术
RNAi技术
RNAi: 与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录 后基因沉默的现象
其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降 解，产生干扰小的RNA（siRNA),这些siRNA与 同源的靶RNA互补结合，特异性降解靶RNA从而 抑制或者下调基因的表达。
转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生 物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体 的性状的可遗传修饰。
反义吗啡林技术：反义寡核苷酸抑制特定的信使 RNA对蛋白质的翻译来控制基因的表达。
简介
TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ） 转录激活子பைடு நூலகம்效应因子核酸酶
TALENs 的靶向基因修饰技术是一种崭新的分子生物学方法，现已应用 于植物、哺乳动物细胞、人类细胞、线虫、酵母、斑马鱼及大鼠等各类 研究对象。
TALENs的作用机制
TALEN的应用(重要!!)
PCR产物送测序
比对测序结果，初步确认 TALEN活性
钟洁
2014.11.7
28
续上
PCR产物TA克隆、单克隆测 序确定打靶效率
大于53%（每100个细胞中有 53个细胞发生碱基突变）
钟洁
2014.11.7
29
部分单细胞克隆测序结果：
续上
消化细胞呈单细胞，接种于 96孔板中，待单细胞克隆长 大后，同上进行鉴定
16
2.2 TALENs表达质粒构建
TALENs靶点识别模块构建
TALENs表达质粒构建
TALENs质粒对共转入细胞
目标基因敲除突变体筛选
钟洁
2014.11.7
17
2.3 TALEN质粒对共转入细胞
TALENs靶点识别模块构建
TALENs表达质粒构建
TALENs质粒对共转入细胞后，其表达的融合 蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结 合。此时，两个TALENs融合蛋白中的FokI功能域 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶 位点之间打断目标基因。诱发DNA损伤修复机制， 主要有非同源末端连接（NHEJ）和同源直接修复 （HDR）。在此修过程中形成一定的插入或缺失突 变，即形成目标基因敲除突变体。
钟洁
2014.11.7
21
ZFNs
锌指核酸酶：
锌指蛋白 识别区域
+
Fokl 酶切区域
钟洁
2014.11.7
22
3.1 锌指蛋白
锌指蛋白是真核生物中普遍存在的基因转 录调控因子, 在细胞分化、胚胎发育等方面 起重要作用。
锌指结构是由多个半胱氨酸和/ 或组氨酸 与锌离子螯合组成四面体结构。其中, Zn2+ 离子是保持锌指结构和功能的必不可少的因 素, 它能促使肽段折叠成稳定的锌指结构并 使其能与特异核酸位点结合。
TALENS技术
TALENs的靶向基因修饰技术
12级生技本一
小组成员：宋海林 王钦 余文凡 邓林炜 朱翔
TALENs--transcription activator-like effectors nucleases
《科学》杂志：2012年度10大科学突破
基因组的精密工程 TALENs
通 常，人们无法确定对高级生物的DNA进行修改和 删除的最终结果。然而，在2012年，名为“转录激 活子样效应因子核酸酶”（TALENs）的工具赋予 研究 人员改变或关闭斑马鱼、蟾蜍、牲畜及其他动 物甚至病人的细胞中特定基因的能力。这种技术以 及其他新兴的技术与已有的基因靶向技术一样廉价 和有效，同时它能 让研究人员在健康人和病人中确 认基因及变异的特定作用。
TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒 定的对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况 少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基 因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN 相等或更好的活性。
那什么是talens呢？
TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向 修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天 然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有 的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。 TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导 入新的遗传物质。
实际应用 基于TALE的基因组编辑技术已经被广泛作用于基因敲除、敲入、 转录激活等。GeneCopoeia公司提供TALEN以及最新基因修饰 技术CRISPR/Cas9的设计、载体构建、功能验证等服务。
TALENS技术.
实际应用 基于TALE的基因组编辑技术已经被广泛作用于基因敲除、敲入、 转录激活等。GeneCopoeia公司提供TALEN以及最新基因修饰 技术CRISPR/Cas9的设计、载体构建、功能验证等服务。
2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组依托于一种自主研发的 TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。 2010年至今，TALEN技术已被全球范围内各实验室使用。服务公司更如雨后 春笋般大量涌现，如GeneCopoeia等。
那什么是talens呢？
TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向 修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天 然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有 的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。 TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导 入新的遗传物质。
TALENs
TALENs的靶向基因修饰技术
12级生技本一
小组成员：宋海林 王钦 余文凡 邓林炜 朱翔
TALENs--transcription activator-like effectors nucleases
《科学》杂志：2012年度10大科学突破
基因组的精密工程 TALENs
通 常，人们无法确定对高级生物的DNA进行修改和 删除的最终结果。然而，在2012年，名为“转录激 活子样效应因子核酸酶”（TALENs）的工具赋予 研究 人员改变或关闭斑马鱼、蟾蜍、牲畜及其他动
王祖喜20144616009TALEN技术汇报
四、结束语
由于知识水平有限，因此，学生对靶 向基因修饰新技术的分析和汇报不对的地 方，愿老师、同学谅解!
汇报人：王祖喜
谢谢各位聆听！
剪切结构域（Fokl）：Fokl则可通过二聚化产生核酸内切酶活性，
在该序列附近造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。
2.1、TALEN技术的结构—TALE蛋白
TALE蛋白是由12-30个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧
的N-末端及C-末端序列组成；
每个“蛋白模块”包含33-35个氨基酸，第12和13位残基是靶向识
基因靶向修饰新技术
——"TALEN技术"简介
姓名：王 祖 喜 学号：20144616009
内容目录
一、基因靶向修饰技术
简介、技术发展、主要事件 和新技术优势
二、TALEN 技术
简介、结构特点、切割与修复、 应用和展望
三、主要参考文献 四、结束语
一、基因靶向修饰技术
1、简介
基因靶向修饰技术，又称为“基因敲除”技术。
别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基位点（Repeat Variant Di-residue, RVD） 。
不同蛋白模块上RVDs对应识别一个不同碱基。
2.2 、TALEN技术的结构—Fokl核酸内切酶
Fokl酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必须设计 一对TALENs，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 13-22个碱基，一般选择15/17个碱基）的靶序列分别进行TALE识 别模块构建。
优势：对物种没有选择性，效率高、经济、操作方便等。
二、TALEN 技术
1、简介
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种 转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位 点的核酸序列有较恒定的对应关系；
TALEN靶向基因操作技术
TALEN靶向基因操作技术TALE 技术（Transcription activator–like effectors）是一种崭新的分子生物学工具。
科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas sp.的T AL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。
利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。
目前TALE技术主要有两种应用：1）TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因D NA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。
它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。
2）TALEA（transcription activator-like (TAL) effector activator）技术，针对基因启动子上游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cDNA。
TALE技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。
1.无基因序列、细胞、物种限制。
2.TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
实验设计简单准确、实验周期短、成本低。
3.成功率几乎可达100%。
4.毒性低、脱靶情况少。
5.克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。
1.TALE靶点识别模块构建TAL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。
TALEN靶向基因敲除技术
TALEN靶向基因敲除TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)，中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于一种由植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的天然蛋白即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。
人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就生成了TALENs。
TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。
相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。
但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。
TALEN 靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。
研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。
研究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。
成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。
技术特点：·无基因序列、细胞、物种限制。
·实验周期短。
·整个实验简单准确，成本低。
·成功率可达90%以上。
·毒性低、脱靶情况少。
·TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
·靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。
]talen技术
![]talen技术](https://img.taocdn.com/s3/m/9f636377168884868762d68c.png)
克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受 上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性
GeneCopoeia
复能基因 FulenGen
TM GeneCopoeia Expressway to Discovery
Precision genome engineering based on
TALE基于TALE的靶来自基因修饰技术2013-11-21
www.
GeneCopoeia
复能基因 FulenGen
Mammalian cell based plasmid cleavage validation
Surrogate reporter validation (HDR Assay) Chormosal level validation (mismatch cleavage)
GeneCopoeia
GeneCopoeia
复能基因 FulenGen
TALENs 靶向基因修饰的原理
GeneCopoeia
复能基因 FulenGen
基于TALEN的基因修饰
gene knock-out gene knock-in
nucleotide substitution protein truncation
GeneCopoeia
复能基因 FulenGen
Selection and Enrichment of TALEN Modified Cells
Single cell culture and PCR analysis to identify modified cells
王祖喜 20144616009 基因靶向修饰新技术-“TALEN技术”
汇报题目：基因靶向修饰新技术-“TALEN技术”简介科目：生物学基础与前沿专题姓名：王祖喜学号：20144616009专业：学科教学（生物）基因靶向修饰新技术-“TALEN技术”简介生命科学与技术学院学科教学（生物）王祖喜（20144616009）摘要：本文从基因靶向修饰技术的简介、技术研究与发展和传统技术与新技术的比较三方面进行了简单介绍，随后着重介绍了TALEN技术相关内容，如本文介绍了该技术的简介、TALEN的结构、识别机制、切割和修复原理及TALEN技术的应用，最后又对TALEN技术的发展做了一个简单的评述，也对靶向修饰新技术的快速发展持一定的担忧态度。
主要目的是为读者，就靶向基因修饰新技术-TALEN技术的发展，提供较全面的介绍。
关键词：基因靶向修饰技术;TALEN技术自“基因敲除”(knock—out)出现以来，该技术无论对于生物学基础研究还是临床治疗都具有极大的吸引力。
然而遗憾的是在随后的20多年间，仅在极少数的模式生物如小鼠、果蝇等中实现“基因敲除”或“基因敲入”。
可喜的是，近年来，人工核酸内切酶(EEN)技术和RNA引导性基因编辑技术的出现已使得该技术得到了快速惊人的发展。
1基因靶向修饰技术1.1简介基因靶向修饰技术是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，有些学者将其也称为“基因敲出”技术[1]。
该技术主要是应用DNA同源重组的原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
1.2技术研究与发展基因靶向修饰技术最初是基于最基本的基因同源重组进行“基因敲除”，但成功率低下、操作周期长、盲目性仍较为突出等缺点仍然是不可回避的问题。
虽然在人工核酸酶出现之前，该技术也取得了可喜的发展，该时期主要出现了：1994年的条件性基因敲除法，1996年的诱导性基因敲除法，1997年的基因捕获法和1998年的RNAi引起的基因敲除法等，本文将其划分为“传统的基因靶向修饰技术”或称为“传统的基因打靶技术”[2]。
靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR
靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR20世纪80年代初，科学家用显微注射的方法将外源DNA片段导入小鼠受精卵的原核中，构建出了世界上第一个转基因小鼠，然而该方法只能将外源DNA片段导入动物基因组中，无法对体内基因组的特定序列进行特定的修饰。
80年代后期，基于小鼠胚胎干细胞(ES细胞)及同源重组技术的发展而催生的基因打靶技术使得科学家可以对小鼠的任何基因序列进行随意的修饰。
基因打靶技术的发展使生命科学的研究发生了革命性的改变，但用此技术制备基因工程动物模型过程较长和花费较大，且由于基因的修饰是在ES细胞中进行，目前的基因打靶技术还只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。
前些年，科学家发现，两种人工改造过的核酸酶，锌指核酸酶(Zinc-finger Nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后，细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
ZFN和TALEN技术结合了原核注射的制备周期短和基因打靶技术的定点修饰的特点，可以应用到除小鼠和大鼠之外的其他生物。
但其脱靶效应(off target)，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
近年来，一种新型基因组修饰的技术——规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)受到人们的高度重视。
CRISPR是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。
科学家利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割和修饰。
与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作、效率更高和更易得到纯合子突变体，且可在不同的位点同时引入多个突变。
类转录激活因子效应物核酸酶介导的基因组定点修饰技术
类转录激活因子效应物核酸酶介导的基因组定点修饰技术一、本文概述随着基因编辑技术的快速发展，定点修饰基因组已成为生物学和医学领域的研究热点。
类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）介导的基因组定点修饰技术以其高度的特异性和灵活性，受到了广泛关注。
本文将对TALENs介导的基因组定点修饰技术进行详细介绍，包括其基本原理、构建方法、应用领域以及未来展望等方面，以期为该领域的研究者提供有益的参考和启示。
二、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）的基本原理类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，简称TALENs）是一种人工合成的定点基因编辑工具，它基于自然界中存在的转录激活因子效应物（Transcription Activator-Like Effectors，简称TALEs）而构建。
TALEs是某些植物病原菌黄单胞菌属（anthomonas）分泌的蛋白质，能够特异性地结合并激活植物基因组中的目标基因。
TALENs的设计原理是将TALEs的DNA结合域与核酸酶（通常是FokI核酸酶）的切割域相融合，从而实现对特定DNA序列的定点切割。
识别目标DNA序列：需要确定目标基因中需要修饰的特定DNA序列。
这个序列通常是基因中的某个功能区域，如启动子、编码区或调控元件等。
设计TALENs：根据目标DNA序列，定制TALENs分子。
这涉及到识别目标序列中的特定核苷酸序列（通常是12-18碱基对），并构建与之相匹配的TALEs。
每个TALE单体识别一个特定的核苷酸，因此通过串联不同的TALE单体，可以构建出能够识别特定DNA序列的TALENs。
组装TALENs：将设计好的TALEs与核酸酶（如FokI）的切割域进行融合，形成一个完整的TALENs分子。
基因工程 比较TALEN技术与ZFN技术
基因工程比较TALEN技术与ZFN技术基因工程：比较TALEN技术与ZFN技术引言：基因工程是一门利用生物学技术对生物体的基因进行修改和调控的学科。
在基因工程领域，TALEN（转录活性效应核酸酶）技术和ZFN（锌指核酸酶）技术是两种常见的基因编辑工具。
本文将详细比较这两种技术的原理、应用、优势和局限性，以帮助读者更好地理解和选择适合自己研究需求的基因编辑技术。
一、TALEN技术1. 原理：TALEN技术是一种利用人工合成的转录活性效应核酸酶（TALEN）靶向特定DNA序列进行基因编辑的方法。
TALEN由两个功能域组成：DNA结合域和转录活性效应域。
DNA结合域通过识别特定DNA序列，而转录活性效应域则通过结合与DNA结合域靶向的DNA序列相邻的DNA酶切酶，实现DNA的切割和修复。
2. 应用：TALEN技术在基因工程领域具有广泛的应用。
它可以用于基因敲除、基因敲入、基因修饰等多种基因编辑操作。
例如，科研人员可以利用TALEN技术研究特定基因的功能，或者通过敲入外源基因来实现特定基因的表达。
3. 优势：TALEN技术相比其他基因编辑技术具有以下优势：- 高度特异性：TALEN可以精确识别和结合特定的DNA序列，从而实现精确的基因编辑。
- 高效性：TALEN技术可以在较短的时间内实现基因编辑，提高实验效率。
- 灵活性：TALEN技术可以用于不同生物体的基因编辑，包括人类细胞、动物和植物细胞等。
4. 局限性：虽然TALEN技术具有许多优势，但也存在一些局限性：- 设计复杂：TALEN的设计需要合成两个相应的DNA结合域，这增加了实验的复杂性。
- 成本较高：合成TALEN所需的材料和技术较为昂贵，限制了其在一些实验室的应用。
- 潜在的细胞毒性：TALEN技术可能对细胞产生毒性作用，限制了其在体内的应用。
二、ZFN技术1. 原理：ZFN技术是一种利用人工合成的锌指蛋白（ZFP）靶向特定DNA序列进行基因编辑的方法。
TALEN靶向基因修饰新技术研究进展_靳玉珠
chilling injury in banana fruit[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2012,92:2624-2629.[11]Wan C Y,Wilkin T A.A modified hot borate methodsignificantly enhances the yield of high quality RNA from cotton(Gossypium hirsutum L.)[J].Anal Biochem,1994,223:7-12.[12]Puhakainen T,Pihakaski-Maunsbach K,Widell S,et al.Coldacclimation enhances the activity of plasma membrane Ca2+-ATPase in winter rye leaves[J].Plant Physiology and Biochemistry, 1999,37:231-239.[13]郑姗姗,李丹,蒋欣梅,等.渐降低温胁迫对黄瓜幼苗叶绿体膜相关指标的影响[J].浙江大学学报(理学版),2012,39(5):582-586. [14]刘悦萍.高温锻炼和水杨酸诱导葡萄幼苗耐热性的细胞学机制研究[D].北京:中国农业大学,2003:18-32.ＴＡＬＥＮ靶向基因修饰新技术研究进展靳玉珠1,2，王世山1，向华2，王晓虎2（1．焦作市畜产品质量安全检测中心，河南焦作454002；2．广东省农科院动物卫生研究所，广东广州510640）摘要：靶向基因敲除基因修饰TALEN(Transcription Activator-Like(TAL)Effector Nucleases)，是一种崭新的分子生物学工具，被《Science》选为2012年年度十大科学突破的新技术。
该技术通过构建与核酸内切酶的融合蛋白，在特异位点打断目标基因DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作，如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或基因修饰等。
基因打靶TALEN技术-百替生物-文档资料
Group 1: validated via experiment
“With TAL effectors it’s really amazing. If I see the amino acid sequence of the TAL repeat, and know the variable amino acid residues, I can predict what sequence it will bind. Conversely, seeing a DNA sequence, with few exceptions, we can design a TAL effector that recognizes this sequence.”
TALE Protein Domain Structure
(Scholze H and Boch J, 2011)
Potential applications of TALE factors
(Mahfouz MM and Li L, 2011)
TALEN(TALE Nuclease)
(Mahfouz MM and Li L, 2011)
Methods for TALE Repeat Construction
De novo synthesis
Golden gate assembly (Type IIs restriction enzyme)
Golden Gate Shuffling
Based on Type IIs restriction enzymes, Cutting outside of their recognition site
TALE：Transcription Activator-Like Effector
TALEN靶向基因操作技术
TALEN靶向基因操作技术(2013-09-15 15:04:15)转载▼分类：转载TALEN (transcription activator-like effector nucleases)靶向基因操作技术是一种崭新的分子生物学工具。
可以构建并表达可以识别任意DNA 序列的重组核酸酶，实现目的基因的特异编辑，如knock-out，knock-in，碱基突变……TALEN技术2011年被《Nature methods》评为“年度实验室技术”。
2011年7-8月，Nature Biotechnology上发表了用TALEN技术进行基因敲除的4篇研究文章，及一篇综述“Move over ZFN”。
Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. 2011 Jul 7;29(8):731-4.Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. 2011 Aug5;29(8):695-6.Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.2011 Aug 5;29(8):697-8.Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. 2011 Aug5;29(8):699-700.Move over ZFN. Volume: 29, Pages: 681–684继自杀质粒，RNA干扰、ZFN之后，TALEN技术已经成为生物技术发展史中新的里程碑！与ZFN技术相比，TALEN技术的优势明显。
∙适用范围广：几乎可敲除任何基因，无基因序列、细胞、物种限制；∙设计准确：TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系，设计简单准确；∙成功率高：成功率高达100%；∙脱靶率低：毒性低、脱靶情况少。
talens基因修饰技术
新技术介绍
汇报人：李新 时间：2012年10月26日
1 TALENs技术
2009 年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白 TALE（transcription activator-like effectors）与寄主靶基因 DNA特异性识别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈 现出新的曙光。 2011年8月来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研 究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究， 并成功敲出了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。两 篇研究论文发表在同一期的《Nature Biotechnology》杂志上。 这一技术也为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技 术带来了新希望。
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1 TALENs技术
TALENs靶向基因修饰技术是基于TALE核酸酶（TALENs）的 一种崭新的分子生物学工具。
TALENs是TALE蛋白和Fokl核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌 合融合蛋白, 其中TALE蛋白结构域负责识别靶位点，Fokl核酸内 切酶负责切割DNA双链, 从而造成双链断裂(DSB)，诱发DNA损伤 修复机制，形成基因敲除突变体。
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4 TALENs技术的应用
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4 TALENs技术的应用
基因敲除
基因表达水平调控
TALENs
基因修复 基因定点插入
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致谢
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基因敲除的技术基础
胚胎干细胞 （ES）分离 体外培养技 术
基因敲除
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除 的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一 步的发展和完善。
基因敲除的技术基础
基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用 设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到 基因敲除的目的。
TALENs结构的构建
TALE是由12和13以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及 C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位双连氨基 酸残基 (RVDs)是靶向识别的关键位点，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱 基,这样就产生了一连串的识别序列。
TALENs结构的构建
TALENs结构的构建
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen 质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达 载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构 域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目 标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实 际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱 基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识 别模块构建。
TALENs基因靶向修饰技术的应用
①建立生物模型。 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基 因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从 而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动 植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等 的基因敲除模型也常见于报道。 ②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体 的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶 目标都有重大的意义。
人们可以对基因组的 特定位点进行各种遗 传操作, 包括基因打 靶、基因定点插入、 基因修复等, 从而能 够方便快捷地对基因 组实现靶向遗传修饰 。
TALEN基因敲除技术
应用
TALENs
作用机制
结构及其构建
TALEN基因敲除技术
TALENs结构
TALE蛋白的DNA结合结合域
Fok I 核酸酶的切割结构域
TALENs的靶向基因修饰技术 TALENs--transcription activator-like effectors nucleases
简介
基因组靶向修饰
Cas9
转基因技 术
（TALENs）
生物应用模型构 建
普通的基 因敲除
锌指核酸酶 技术 (ZFN) RNAi技术
什么是基因敲除？
是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水 平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近 基因取代，然后从整体观察实验动物（表型），推 测相应基因的功能。 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分 子生物学技术。
交叉互换
利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤
构建重组 载体 获得ES细 胞
同源重组
表型研究
Hale Waihona Puke 鉴定筛选阳性 细胞选择纯合 子
TALEN基因敲除技术
TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ） 转录激活子样效应因子核酸酶,, 科学家发现天然的TALENs最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它 应用于基因修饰方面，使它成为了一种崭新的分子生物学方法.
TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应 关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列 ，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的 活性。
TALE蛋白能识别并结合特异的 DNA 序列， Fok I 则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性, 从而在 特定的位点切断DNA序列，造成 DNA 的双链断裂 (Double-stand break, DSB)。
TALENs结构的构建
TALE模块识别DNA的机制在于不同的双连氨基酸残基 （ＲVD）能够特异地分别识别A、T、C、G 4 种碱基 中的一种。 通过对天然TALE 的研究发现，有20多种不同的ＲVD 可以特异性的识别碱基，其中 Asn /Ile( NI)识别 碱基A; His /Asp( HD)识别碱基C; Asn/Gly(NG)识 别碱基T; Asn /Asn( NN)识别碱基G/A。 ＲVD 的第1 位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定 ＲVD 的作用; 第2 位氨基酸则直接与DNA 的碱基特 异识别
TALEN基因敲除技术
技术原理
每周
TALENs可识别并结 合特定的 DNA 序列 , 并通过切割这一序 列的特定位点造成 DNA的双链断裂 (DSB)
细胞利用天然的DNA 修复过程非同源末端 结合（NHEJ）导致 DNA断裂处碱基的变 异，造成翻译蛋白的 移码突变，从而不能 产生正确的蛋白质， 即最终实现基因敲除。
TALENs的作用机制
将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后， 表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的 FokI临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪 切DNA， 形成DSB（Double-Strand Breaks），诱发DNA损伤修复机制。细 胞可以通过非同源末端结合（NHEJ）修复DNA， 在此修过程中或多或少地删 除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。