抗原热修复退色法在HE切片改做免疫组化染色中的探索_王兴波

［3］ 赵天如，江昌新，刘增辉，等． HE 染片退色后改作特殊染色 和免疫组化染色［J］． 诊断病理学杂志，2002，9（ 3） ： 186．
［4］ 王兴波，刘梦丽，孙凤媛，等． HE 染色涂片退色后原位免疫 染色在肿瘤病理诊断中的应用［J］． 中国误诊学杂志，2010， 10（ 21） ： 5072．
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 病例选择 选取河北省秦皇岛市第二医院病理科近 年存档的组织蜡块切成 40 张白片，原有 HE 切片 20 张。包 括： B 细胞淋巴瘤 1 块（ 原 HE 染片 3 张，切 6 片，染 CD20、 CD3、CD45RO） ，T 细胞淋巴瘤 1 块 （ 原 HE 染片 3 张，切 6 片，染 CD20、CD3、CD45RO） ，急性淋巴细胞白血病骨髓穿刺 1 块（ 原 HE 染片 1 张，切 2 片，染 TdT） ，乳腺浸润性导管癌 （ ER、PR、C-erbB-2 皆阳性） 组织蜡块 1 块［原 HE 染片 6 张， 切 12 片，染 C-erbB-2、ER、PR、EMA、SMA、CK（ Low-MW） ］， 乳腺小叶增生 1 块［原 HE 染片 2 张，切 4 片，染 SMA、CK （ Low-MW） ］，胃肠间质瘤 1 块（ 原 HE 染片 2 张，切 4 片，染 CD117、CD34） ，子宫内膜间质肉瘤 1 块（ 原 HE 染片 3 张，切 6 片，染 CD10、SMA、vimentin） 。有免疫组化染色对照片的鳞 癌和腺癌阳性涂片各 2 例［分别选取 HE 染片各 2 片，染 CK （ High-MW） ，CK（ Low-MW） ］。以上白片平均分成两组，实 验组 1 和对照组，将原 HE 染色的切片和涂片共 28 片归入 实验组 2。要求每例蜡块切成 4 μm 厚薄片，裱于防脱载玻 片上，在磨砂边处做好标记，60 ℃ 烤箱烤 2 h，二甲苯脱蜡至 水，冲洗干净直至无水珠附于玻片上，细胞涂片均使用防脱 片，潮干固定于 95% 乙醇液中 15 min，60 ℃ 烤箱烤 30 min， 水洗后进行 HE 染色。 1． 1． 2 器材与试剂 免疫组化抗原修复不锈钢高压锅 1 个 （ HPC-1001） ，现配柠檬酸抗原修复液（ pH 6. 0 ± 0. 1） ，EDTA
收稿日期： 2012 － 04 － 09 作者单位： 河北省秦皇岛市第二医院病理科，秦皇岛 066600 作者简介： 王兴波，男，副主任医师。E-mail： 2418957063@ qq． com
（ pH 9. 0） 按 1 ∶ 50 配置（ 1 份原液和 50 份蒸馏水混合） ，配 备耐高温染色架（ RAK-2001） ，电磁炉。抗体选择： CK（ HighMW） 、CK（ Low-MW） 、EMA、SMA、vimentin、C-erbB-2、ER、PR、 CD3、CD45RO、CD20、TdT、CD10、CD117、CD34，采用免疫 组 化 MaxVision 一步法染色，DAB 显色，所有器材与试剂均购 于福州迈新公司，抗体为同一批号即用型。 1． 2 方法 1． 2． 1 原 HE 染片的去胶处理 将实验组 2 的 HE 染片浸 泡于二甲苯中 3、4 天后，去除盖玻片和标签纸并做好标记， 再在二甲苯中继续浸泡 1 天，经无水乙醇 2 次，95% 乙醇 1 次流水冲洗［1］。 1． 2． 2 HE 染色 实验组 1 进行过重 HE 染色，即适当延长 常规 HE 染色在苏木精和水溶伊红染液中的停留时间。染 色完毕晾干。 1． 2． 3 退色 （ 1） 将经以上处理后的实验组 1、2 不需要 EDTA 修复的切片放入耐高温染色架上，将配置完毕的柠檬 酸液倒入高压锅适量，要求浸过染色架中的 HE 染片。放入 HE 染片之前按照免疫组化柠檬酸抗原修复操作规程，先将 柠檬酸加热至沸腾，移开高压锅后将有 HE 染片的染色架倒 入高压锅内，将高压锅盖盖好，再移至电磁炉上加热，至喷气 后 1 min（ 规定时间 1 ～ 1. 5 min） ，关闭电磁炉，自然冷却后取 出染片，用 PBS 液冲洗。（ 2） 将实验组 1、2 需 EDTA 修复的 染片放入耐高温染色架上，将配置完毕的 EDTA 倒入高压锅 内至足量并加入玻璃珠数枚，保障煮沸 20 min 后 EDTA 仍浸 过染色架中的 HE 染片。放入 HE 染片之前按照免疫组化 EDTA 抗原修复操作规程，先将高压锅内 EDTA 液加热至沸 腾，后将有 HE 染片的染色架倒放入沸腾后的高压锅内，选 择低档再将其加热沸腾 20 min，冷却后取出，用 PBS 冲洗。 1． 2． 4 观察修复后退色情况 在退色后的玻片下面衬一张 白纸进行肉眼观察，再在低倍显微镜暗视野条件下观察。结 果： 各染片上的组织和细胞涂层均未见脱落，高温高压柠檬 酸修复 1 min 可使苏木精和伊红完全退色，EDTA 煮沸 20 min，伊红完全退色，苏木精颜色明显变浅，肉眼观察无颜色， 仅镜下细胞核略呈浅灰色。 1． 2． 5 免疫组化染色 对照组切片按免疫组化要求进行抗 原修复，修复退色后的染片需其他处理的如胰酶消化，还需 进行相应处理。最后将修复退色后的染片和修复后的对照 组切片按免疫组化操作步骤进行免疫组化染色。
HE 染色与免疫组化染色在病理诊断中处于重要的地 位，是目前病理科较常用的常规方法。在实际病理诊断工作 中，经常遇到 HE 染色的会诊组织切片和细胞涂片，而无相 应的组织蜡块或多余的细胞涂片白片，为进一步明确诊断只 能在原 HE 染片上做免疫组化染色，此时需将 HE 染片退去 HE 染色，改做免疫组化染色。目前，采用抗原热修复法退色 尚未见文献报道，我们通过探索、实验及临床应用发现其效 果良好，现报道如下。
2 结果
实 验组1、2及对照组免疫组化染色每例对应的抗体表
临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2012 Oct; 28( 10)
·1177·
①A
①B
①C
②A
②B
③
图 1 A： 乳腺浸润性导管癌切片预先未经 HE 染色直接进行免疫组化染色示 C-erbB-2 胞膜强阳性； B： 乳腺浸润性导管癌新 HE 染色切片退色 后行免疫组化染色示 C-erbB-2 染色胞膜强阳性； C： 乳腺浸润性导管癌原 HE 染色切片退色后行免疫组化染色 C-erbB-2 染色胞膜强阳性，MaxVision 一步法 图 2 A： 骨髓切片预先未经 HE 染色，经 EDTA 修复示 TdT 胞核阳性； B： 骨髓原 HE 染色切片，经 EDTA 修复退色后 TdT 胞核 阳性，MaxVision 一步法 图 3 乳腺浸润性导管癌原 HE 染色切片高温柠檬酸退色后 vimentin 染色纤维性间质胞质阳性，癌细胞阴性，MaxVision 一步法
参考文献：
［1］ 瞿智玲，倪 娟，敖启林，等． 陈旧褪色病理教学 HE 切片颜色 恢复技术探讨［J］． 临床与实验病理学杂志，2011，27（ 4） ： 433．
［2］ 戴 芳，杨举伦，王 丽，等． 淋巴组织细针吸取细胞 HE 染 片褪色后作 免 疫 组 化 的 体 会［J］． 西 南 国 防 医 药，2010，20 （ 2） ： 178．

达强度及表达率基本一致，差异无显著性（ 图 1 ～ 3） 。证明 抗原热修复退色法在 HE 染片退色改做免疫组化染色中应 用的可行性。
3 讨论
HE 染色主要依靠离子键的结合起作用，所以染色和退 色也受到离子键结合力的影响，同时溶液浓度、pH 值、温度 及时间亦有一定的影响。高温可使离子运动速率加快，染色 时容易使细胞着色，退色时容易使染料离子弥散到染料浓度 低的溶液中，在退色过程中溶液 pH 值的影响较大，pH 值越 小越易使苏木精退色，pH 值越大越易使伊红退色，所以强酸 强碱是强退色剂，但也最容易破坏抗原成分。做免疫组化染 色时应保护抗原，采用缓冲液较合理，常温下使用缓冲液退 色，耗费时间较长，HE 染片在溶液中浸泡时间过长易导致脱 片，应尽 量 减 少 在 溶 液 中 的 浸 泡 时 间。有 文 献 报 道 采 用 0. 25% 高锰酸钾 － 0. 5% 草酸退色需要时间约 10 min［2］，赵 天如等［3］在完成 HE 染片脱胶后对于近期 HE 染片用 0. 5% 盐酸乙醇脱色（ 肉眼观察组织切片呈淡粉红色为止） ，再用 0. 5% 草酸溶液脱色（ 肉眼观察组织切片呈白色为止） ，较久 的 HE 染片依次再用 0. 25% 高锰酸钾溶液和 0. 5% 草酸溶液 脱色。作者曾采用 1% 盐酸乙醇-PBS 退色，需要时间约 10 min［4］。作者认为较佳退色方法为抗原热修复法，虽然柠檬 酸溶液显弱酸性，实验证明在退去苏木精的同时也退掉了伊 红，既起退色作用又完成抗原修复的作用，免去再单独退色 的步骤。EDTA 呈弱碱性，即退去伊红，又基本上退去苏木 精，后者主要是高温加速离子弥散作用使苏木精脱离细胞核
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临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2012 Oct; 28( 10)
抗原热修复退色法在 HE 切片改 做 免 疫 组 化 染 色中的探索
王兴波，任仕俊，陈怀敏，张杰锋
关键词： 抗原修复； 退色； 免疫组织化学； 苏木精-伊红染色 中图分类号： R 392-33 文献标志码： B 文章编号： 1001 － 7399（ 2012） 10 － 1176 － 02
从而使颜色明显变淡，肉眼观察其呈无色，仅镜下隐约见浅 灰色，通过免 疫 组 化 实 验 结 果 示 对 细 胞 核 的 着 色 无 明 显 影 响。实验组 1、2 与对照组细胞膜、细胞质、细胞核着色部位 一致，着色强度 及 表 达 率 基 本 一 致，差 异 无 显 著 性。免 疫 组 化染色抗原需 EDTA 修复的可以用 EDTA 热修复退色，对于 一些不需抗原修复的，通过对照试验可用高温高压柠檬酸退 色，但需要防止内源性生物素导致的非特异性背景着色，修 复退色后，需采用非生物素免疫试剂盒或对内源性生物素进 行滴加抗体前的封闭处理。实验结果表明，抗原热修复退色 对以上所选抗体的免疫组化染色无明显影响，是否对除此之 外的抗体免疫组化染色有影响有待进一步研究。实验中注 意事项： 试验中要防止涂片细胞及组织片脱落，并正确使用 高压锅。