分子生物学实验问答题答案中文名称

.中文名称：重组DNA技术。

英文名称：recombinant DNA technique;recombinant DNA technology定义1：用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。

包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。

重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。

这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。

因此它不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。

2.列出分子生物学常用仪器的名称，用途。

答：①恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。

注意要依据不同的用途设置不同的参数。

②超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。

注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。

③低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。

使用时不能随便移动离心机或打开盖子；离心机运行时要处于锁定状态；离心管的放置要处于平衡状态。

④微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。

操作时注意避免枪头的污染；调节刻度时不宜超过最大量程；使用完后将刻度调到最大收藏。

⑤电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。

操作时不可把导线极性接反；当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行；若使用时出现异常，要立刻切断电源。

⑥PCR仪：用于扩增DNA片断。

操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。

⑦高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。

使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。

3. 如何正确使用微量移液器。

一、标准操作适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。

1)按到第一档，垂直进入液面几毫米。

2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少。

3)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。

二、黏稠或易挥发液体的移取在移取黏稠或易挥发的液体时，很容易导致体积误差较大。

为了提高移液准确性，建议采取以下方法：1)移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出液体时最好多停留几秒。

尤其对于移取体积大的液体(如1000~1)，建议将吸头预湿后再移取。

2)采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。

三、常见的错误操作1)吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。

2)装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸头)。

3)平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。

4)用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。

5)直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。

6)使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作)。

1.感受态细胞在生理上与普通细胞有何差异？（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。

（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）.（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。

（4）受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。

（5）不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞2.振荡是为了让氧气充分溶于液体，振荡利于大肠杆菌繁殖3.防止不受水气之类影响,保持培养基干燥，防止外物掉在培养基上4.（1）如何计算转换率，转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×涂板前离心管中菌液体积／涂板时所用菌液体积转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数（2）影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。

DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是 5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净。

迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；7．一定范围内，转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；（3）细胞生长状态和密度、质粒的质量和密度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染5.电转化的原理是？为何转换率高于氯化钙法？原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

转化效率为109～1010 转化子/μg DNA；??????1.碱法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？及其注意事项？答：各溶液的作用如下：溶液Ⅰ：葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase 的活性。

这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ：0.2M NaOH / 1% SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

溶液Ⅲ：3M 醋酸钾/ 2M 醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。

注意事项1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。

其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。

如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。

所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。

所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。

5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。

经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。

6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。

7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。

因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。

2.描述质粒DNA的电泳图谱，并解释可能产生的现象及原因？质粒DNA电泳会有三条带（最前面跑最快的是超螺旋，中间的是开环质粒，最后是质粒的复制中间体）。

最远的是线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子；中间的是开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋这是由于在质粒提取过程中，机械力、酸碱度、试剂等的原因，使质粒DNA链发生断裂。

1.DNA在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素？答：DNA在电泳过程中的迁移率取决于DNA分子特性和电泳条件。

⑴DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

⑵DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。

常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

⑶不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。

不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。

所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

⑷溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。

当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。

这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。

因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。

⑸电场强度⑹电泳缓冲液2.琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。

蛋白质电泳（一般指SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。

所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。

而且这两个电泳体系可以互相交换使用。

进行大分子蛋白质电泳时，可以考虑换用琼脂糖凝胶，因为该体系孔径大。

相反，如果需要精确到各位数碱基的DNA电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统，因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。

不同点首先是样品不同。

这个就不用多说了。

其次是结果的观察方法不同。

DNA电泳普遍使用EB做染料，在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色，还需要经过脱色步骤，不过观察起来比较简单。

还有就是胶体系的差别，DNA电泳通常是一胶跑到底，而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。

电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。

但是，区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数，是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。