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实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
RT-PCR实验原理与步骤
RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。
【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。
4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。
延伸时间因目的序列长度不同而不同。
cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。
2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。
3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR 操作步骤（20 ul反应体系）一、试剂准备1 RNA提取试剂：Trizol1.1 氯仿1.2 异丙醇1.3 无水乙醇1.4 0.1%DEPC水2 第一链cDNA合成试剂盒3 PCR：荧光定量试剂盒3.1 目的基因引物3.2 内参基因引物二、仪器、耗材离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液枪、离心管盒。
三、操作步骤1 总RNA的提取1.1 均质化组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆1.2 相分离转入一新EP管中（1.5ml），室温孵育5min；加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈15s），室温孵育2~3min；4℃ 10000 g离心15min（下层红色，中间相，上层无色水相）；注：RNA存在于水相中，水相体积约为均质液60%。
1.3 RNA沉淀转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温孵育10min；4℃ 12000 g 离心15min；1.4 RNA洗涤弃上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，4℃10000 g 离心5min（只做一次）；注：①无Ｒnase水配置：一般少配点儿，带胶塞的瓶子（250 ｍl），0.25ml DEPC ＋250ml双蒸水（先加DEPC），过夜，高压灭菌（30 min），高压是切记瓶口放一截细线，防止液体喷出。
冷却后4 ℃保存即可；②75%乙醇：即用即配，假如用4ml 75%乙醇，就吸取3ml无水乙醇，1ml无Ｒnase水；③样品可储存于75%乙醇中，-20℃保存至少一年。
1.5 RNA溶解倒掉上清，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥；加20ul DEPC水至EP管中，吹打几次；在55℃~60℃孵育10 min(或手握10min)，使RNA充分溶解。
1.6 RNA浓度测定调零：750 ul DEPC水；测量：745 ul DEPC水+5 ul RNA（稀释150倍，可根据实际情况调整）总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260×6 ug/ul注：OD260/OD280应在1.8~2.0之间。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
rt—qpcr实验原理及步骤
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。
其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。
1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。
逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。
2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。
在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。
3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。
这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。
样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。
逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。
3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。
PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。
4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。
RT-PCR全过程步骤
RT-PCR全过程步骤一．试剂材料准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖二．总RNA提取1. 取100mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
(1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizo l，转入离心管进行第 2 步操作。
(2) 匀浆：组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。
另外，组织体积不能超过 Trizol 体积的 10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2 分钟。
2. 震荡30s，室温放置 5min，使其充分裂解。
12,000rpm 离心 5min，弃沉淀。
3. 加0.2ml氯仿，摇动30s，室温5-10min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组 DNA 断裂。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，室温放置 5-10min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。
逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。
二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。
在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。
rt-pcr实验原理
rt-pcr实验原理RT-PCR 这玩意儿可神奇啦！简单来说，它就像是一个超级侦探，能帮我们找出细胞里那些神秘的遗传信息。
想象一下，细胞就像是一个装满了各种宝贝的大仓库。
而我们想要找的，就是其中特定的那几个宝贝——特定的基因。
RT-PCR 就是我们打开这个仓库，找到宝贝的钥匙。
先来说说“RT”这部分。
RT 其实就是反转录的意思。
咱们都知道，基因在细胞里一般是以 DNA 的形式存在的，对吧？但是呢，有时候这些基因会先变成一种叫 RNA 的家伙。
RNA 就像是 DNA 的调皮小弟，到处乱跑。
那我们要研究这些基因，就得先把RNA 这个调皮小弟给抓回来，变成和 DNA 差不多的样子，这就是反转录啦！怎么抓回来呢？这就得靠一些特别的“工具”。
有一种叫反转录酶的东西，它可厉害了！就像一个神奇的魔法棒，一挥，就能把 RNA 变成和它对应的 DNA，我们叫它cDNA 。
然后呢，就到了“PCR”闪亮登场的时候啦！PCR 啊，就像是一场疯狂的复制派对。
咱们刚刚得到的 cDNA ，数量可能很少很少，就像沙漠里的几颗小水珠。
但是通过 PCR ，就能让它们像吹气球一样，迅速变多，变多，变得超级多！PCR 是怎么做到的呢？这就得靠一些巧妙的设计。
有一对引物，就像是两个专门找特定 cDNA 的小侦探，它们能精准地找到我们想要的那段 cDNA 。
然后呢，还有各种酶啊，原料啊，一起帮忙。
先把温度升高，让 DNA 双链打开，变成两条单链。
这时候引物就赶紧跑上去，和对应的单链结合。
然后温度降低，各种原料就开始工作，合成新的 DNA 链。
就这样一轮一轮地加热、降温，DNA 的数量就呈指数级增长啦！经过一轮又一轮的复制，原来那一点点 cDNA ，就变成了一大堆。
这样，我们就能够比较容易地检测和分析它们啦。
比如说，我们可以看看某个基因是不是在细胞里特别活跃，是不是在生病的时候发生了变化。
RT-PCR 就像是我们的眼睛，让我们能看到细胞里那些微小而又重要的变化。
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提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择
1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择
1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
生物科研
二、实验耗材与试剂
1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、实验步骤
(一) 总RNA的提取
见相关内容。
(二) cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1. 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。
在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
2. 70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer————2μl
25mM MgCl2————2μl
10mM dNTPmix————1μl
0.1M DTT————2μl
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5min。
3. 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
4. 于70℃加热15min以终止反应。
5. 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
(三) PCR扩增
1. 取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA————2μl
上游引物(10pM)————2μl
下游引物(10pM)————2μl
dNTP(2mM)————4μl
10×PCR buffer————5μl
Taq 酶(2u/μl)————1μl
2. 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。
轻轻混匀，离心。
3. 设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G3PD)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
4. 电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
5. 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA断裂。
2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
2. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5. 防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
6. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
7. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
8. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
9. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
10. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
11. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
什么是Hofstede的五个文化尺度
吉尔特·霍夫斯塔德（Hofstede）的五个文化尺度是用来衡量不同国家文化差异、价值取向的一个有效架构：
•权力距离。
一国范围内人与人之间的不平等程度。
•个人主义与集体主义。
个人对于人际关系（他们所属
的家庭或组织）的认同与重视程度。
•男性气质与女性气质。
男性气质的文化有益于权力、
控制、获取等社会行，与之相对的女性气质文化则更
有益于个人、情感以及生活质量。
•不确定性规避。
一国范围内人们对于结构性情景（相
对于非结构性情景、非常规态势）的偏爱程度。
•长期取向与短期取向。
长期：着眼于未来的价值取向，
比如储蓄习惯和坚持力。
短期：着眼于短期和眼前的
价值取向，比如尊重传统、重视履行社会义务。
权力距离是指“一个社会对组织机构中权力分配不平等的情况所能接受的程度。
”在权力距离大的文化中，下属对上司有强烈的依附性，人们心目中理想的上司是开明专制君主，是仁慈的独裁者；在权力距离小的文化中，员工参与决策的程度较高，下属在其规定的职责范围内有相应的自主权。
个人主义是指一个松散的社会结构，假定其中的人们都只关心自己和最亲密的家庭成员；而集体主义则是在一个紧密的社会结构中人们分为内部群体与外部群体，人们期望自己所在的那个内部群体照顾自己，而自己则对这个内部群体绝对忠诚。
所谓“不确定性的规避”，是指“一个社会对不确定和模糊态势所感到的威胁程度，试图保障职业安全，制订更为正式的规则，拒绝越轨的观点和行为，相信绝对忠诚和专业知识来规避上述态势。
”
男性气质与女性气质，是指“社会中‘男性’价值观占优势的程度，即自信、追求金钱和物质、不关心别人、重视个人生活质量”；其反面则是“女性”价值占优势。
长期导向性、短期导向性表明一个民族对长远利益和近期利益的价值观。
具有长期导向的文化和社会主要面向未来，较注重对未来的考虑，对待事物以动态的观点去考察；注重节约、节俭
和储备；做任何事均留有余地。
短期导向性的文化与社会则面向过去与现在，着重眼前的利益，注重对传统的尊重，注重负担社会的责任；在管理上最重要的是此时的利润，上级对下级的考绩周期较短，要求立见功效，急功近利，不容拖延。
要了解一个国家的管理文化，你不仅仅要有关于这个国家的知识，还要对它的文化有一个完整概念，能够心领神会。
Hofstede的独特统计。