碘化钠法提取牦牛基因组DNA的研究
牦牛绒DNA的提取及验证
成粉末 状 ，并在 样品 经裂解液处理后 先 离心除去 其 中尚未完全溶解 的纤维，然后进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增是 比较有 利 的，完全 能够得到 满
足Ｐ Ｃ Ｒ 扩增要求 的Ｄ Ｎ Ａ 样品。 ［ 关键词］牦牛绒 Ｄ Ｎ Ａ 提取方法 ห้องสมุดไป่ตู้证
ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｍｉ ｎ ｉ Ｂ Ｅ Ｓ Ｔ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ａ ｌ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ 牦牛是高寒地带的特有畜种，主要生活在海拔３ ０ ０ ０ ｍ以上 。 取 试 剂盒 Ｔ ｒ ． ５ ． ０（Ｔ ａ Ｋａ Ｒａ Ｃ ｏ ｄ ｅ ． ９ ７ ６ ５），Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｘ Ｅ ｘ Ｔａ ｑ （ Ｐ ｒ ｏ ｂ ｅ ｑ Ｐ Ｃ Ｒ） 我 国具 有 非 常 丰富 的牦 牛 毛纤 维 资 源 ］ 。牦 牛 绒 主要 作 为 纺 织用 Ｖｅ 高 档 纤维 原 料 ；牦 牛 毛作 为 毡 制 品 、绳 索 等 低 附加 值产 品原 料 ， （ Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｃ ｏ ｄ ｅ ． Ｒ Ｒ ３ ９ ０ Ａ），１ ０ ０ ％乙醇 ，Ｄ Ｎ Ａ Ｌ ａ ｄ ｄ ａ ｒ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 。
中国畜牧兽 医文摘
２ ０ １ ５ 年
３ １ 卷
第２ 期
基 础 科 学
牦牛绒Ｄ Ｎ Ａ 的提 取及验证
王 玫 任 亮 子 Ｌ平 肇慧君 颜怀 玉 杨春光
（ 辽宁 出入境检验检疫局 ，辽宁大连 １ １ ６ ０ ０ １ ）
［ 摘 要］ 提取Ｄ Ｎ Ａ 是 利用Ｐ ｅ Ｒ 技 术检 测纤维 的关键技 术难点 。对 牦牛绒Ｄ Ｎ Ａ ＠提取方法进行 了试验 ，通过Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 的方 法进 行验证 。结果表 明：使用Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｍ ｉ ｎ ｉ Ｂ Ｅ Ｓ Ｔ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ａ １ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ Ｖ ｅ ｒ ． ５ ． ０试剂盒 ，将 纤维样 品尽量 处理
动物肉制品基因组DNA的提取和纯化
品 的ＤＮＡ样 品（分 别 取２００ｎｇ）， 用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｍｓｅ Ｉ两 种 限 制 性 内 切 酶 进 行 双 酶 切 ， 然 后 加ＥｃｏＲ Ｉ和Ｍｓｅ Ｉ接 头进行连接， 再用ＥｃｏＲ Ｉ＋Ａ和Ｍｓｅ Ｉ＋Ｃ两 条引物进行 ＰＣＲ预扩增（反应体系采用９４℃预变性２ｍｉｎ、９４℃ ３０ｓ、 ５６℃ ３０ｓ、７２℃ ６０ｓ， 最后７２℃延伸５ｍｉｎ， 循环数２０）， 预扩增产物在１％的琼脂糖凝胶 电泳上进行 检 测 ， 在 紫 外 灯 上 进 行 观 察 ［１０］。
近年来， 随着疯牛病、羊瘙痒病、口蹄疫、禽流 感等一些疾病在欧洲及世界各国的流行， 以及一些 动物源食品掺假造假现象的普遍产生， 对食品、药 品， 以及饲料产品成分进行动物源性鉴定， 已经成 为一个备受关注的问题［１］。随着生物技术 的发展， 以 ＤＮＡ为 基 础 的 ＰＣＲ技 术 广 泛 被 用 来 鉴 定 食 品 中 的 动 物 源性， 由于ＰＣＲ方法比较简便， 特异性和灵敏度都很 高， 国内外已经运用该技术和其他技术结合建立了 多种鉴定食品动物源性成分的方法， 如常规ＰＣＲ、多 重 ＰＣＲ、 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ、 定 量 竞 争 ＰＣＲ、 ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ和ＡＦＬＰ－ ＰＣＲ等 ［２－７］。而高质量、高纯度的基因组 ＤＮＡ的 获 得 则 是 开 展 该 方 面 研 究 工 作 的 前 提 。 目 前 ， 有 关 动 物 肉 制 品 基 因 组 ＤＮＡ提 取 方 法 的 报 道 较 少 ，
本试验以猪肉、牛肉和羊肉３种动物的生鲜肉为原 料， 利用改进的ＳＤＳ方法， 建立了一种有效的动物源 食品基因组ＤＮＡ的提取方法。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 新鲜猪肉、牛肉、羊肉： 市售。
１．２ 试验仪器 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ， Ｓｙｓｔｅｍ ２７００： Ｓｉｎｇａｐｏｒｔ； ３Ｋ１８
动物基因组dna_rna 提取及含量测定
工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，用这 ， 工业上常用稀碱和浓盐酸法提 两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要 两种方法提取的核酸均为变性 。 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 浓盐法是用10％氯化钠的溶液， 浓盐法是用 ％氯化钠的溶液，在90摄氏 摄氏 度提取3—4小时，冷却，离心，上清液乙 度提取 小时，冷却，离心， 小时 醇沉淀RNA。稀碱法用 醇沉淀 。稀碱法用0.2％氢氧化钠是 ％ 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 上清液乙醇沉淀的RNA ,或调核酸等电点 上清液乙醇沉淀的 或调核酸等电点 PI2.5沉淀。 沉淀。 沉淀
DNA含量的测定 含量的测定
原理：
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核 糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核 苷酸。其中 2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400µg范围内光密度与DNA浓度 成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其 他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响 测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与 二 苯 胺 形 成 各 种 有 色 物 质 ， 干 扰 测 定 。
思考题
二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什 么？ 除杂质常用那些方法？
经常采用三种方法去除蛋白
用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材 料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、 DNA 离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操 作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化， 离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层， 可将DNA沉淀出来
牦牛INHBA基因的克隆及序列分析
摘
要 ：根据 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ检 索到的普通 牛的 Ｉ Ｎ ＨＢ Ａ 基 因序 列设计一对特异性 引物，以牦牛卵 巢组织总 Ｒ Ｎ Ａ 为模板 ， 通
过Ｒ Ｔ － Ｐ ＣＲ 技 术对牦牛 Ｉ Ｎ ＨＢ Ａ ｅ ＤＮ Ａ进行克隆测序和序列分析．结果表 明： 扩增 片段 Ｉ ３ ６ ０ ｂ ｐ ，包含 １ ２ ７ ７ ｂ ｐ的编码 区．编
制素的水平能反映出发情周期中卵泡生长的数量， 是决定动物排卵的关键调节激素¨ ． 牦牛是青藏高原的一个特有畜种， 分布于海拔 ３ ０ ０ ０ ｍ 以上， 能适应高寒、低氧等极端生态条件¨ ‘ ’ 。 ， 是青藏 高原畜牧业的支柱， 在遗传资源上是一个极为宝贵的基 因库¨ ． 然而牦牛的繁殖性能相对低下， 在如何提高牦 牛繁殖形状的课题上，国内外进行 了大量的科学研究． 本研究对牦牛 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ基 因编码区进行克隆分析， 并通过
抑制素是一种主要由雄性睾丸支持细胞… 和雌性 卵巢颗粒细胞分泌 的二聚体糖蛋白激素． 抑制素属于转 化 生长因子 １ ３ （ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ｉ ｎ ｇ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ － Ｊ ３ ， Ｔ Ｇ Ｆ ． Ｄ ） 超家族成员， 该家族成员主要参与体 内各种影响细胞生长和分 化的功能 ｊ ． 抑制素主要有 Ｉ Ｎ Ｈ Ａ 、 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ和 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ｂ三种类型的亚基． Ｉ Ｎ Ｈ Ａ亚基上具有糖基化位点， Ｉ Ｎ Ｈ Ａ亚基 分别与 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ和 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ｂ亚基之间通过二硫键连接而成异质二聚体 Ｊ ， 即抑制素 Ａ （ ｃ ｚ ｌ Ｂ Ａ ） 和抑制素 Ｂ （ ａ ｌ ３ Ｂ ） ． 许多 动物实验研究证实抑制素可 以抑制 ｒ 在垂体中的分泌 ， 是哺乳动物 Ｆ Ｓ Ｈ 分泌的主要负反馈调节因子． 抑
DNA提取方法优化及Taqman探针法检测牛肉及其制品中的猪源性成分
2.1.3 试剂盒法
参照说明书。 2.2 实时荧光 PCR 1J法检测
2.2.1 实时荧光 PCR 方法 [!HD]
高速离心机、核酸蛋白分析仪、荧 光定量 PCR~地 CTAB(生工)、 EDTA(暑 云天)、 50S (主工)、 DNA 提取
试剂盒(天根)、 2XTaqMan Fast qPCR Master Mix (生工)。 2 实验万法 2.1 火锅底料申 DNA 的提取后法研究
2.1.1 改良 CTAB 法同
次; 12000 r/min 商，~5min，取上清
液 700队，加入等体积的氯仿-异成
醇 (24 : 1) ，轻缓颠倒 15s 后室温 静置 1 min; 120∞ r/min 室温下离心 10 min; 转移上清液于一新的1.5 ml
离心售中，加入 0.8 倍体积预冷的异
丙醇，颠倒混匀后于 -20.C静置 1-2 h 沉淀 DNA; 12 000 r/min 重温离，心 10 min ，奔去上清液，用 70% Z.醇洗
涤沉淀两次。晾干，使用 50μL TE 缓 冲液溶解 DNA 沉淀，待测或子 -20.C 保存备用。
2.1.2 改良 505 法问 在 2 mL 离心管申加入 100 mg 样 晶，加入 1 mL20%SD5 混匀，臼。C 水浴 30 min ，期间颠倒数次;加入
200μL 3 moljL NaAC 溶液混匀， 4.C 15000 r/min 离心 10 min; 取上清液 加等体积氯仿-异成醇 (24 : 1) 温匀， 12000 r/min 室温离心 2min ，加入
用于Real-time PCR检测的牛肉组织DNA提取方法探索
用于Real-time PCR检测的牛肉组织DＮA提取方法探索摘要：使用ｃｈｅｌｅｘ－１００提取牛肉组织ｄｎａ，并用紫外分光光度法检测所提取的ｄｎａ浓度和纯度，结果表明所提取的ｄｎａａ２６０ｎｍ / ａ２８０ｎｍ在１．６６２～１．８２６之间，纯度较高。
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ扩增提取的ｄｎａ模板，表现出较高的敏感性。
该ｄｎａ提取方法效率较高，操作简便，能够获得较高质量的ｄｎａ，适合检疫部门的快速检测需要。
关键词：ｄｎａ；提取；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ；牛肉组织ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ of ｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ’s ｄｎａｆｏｒｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｂｓｔｒａｃｔ：ｃｈｅｌｅｘ－１００ｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｄｎａｆｒｏｍｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ．ｔｈｅｄｎａｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｈｅｎｔｅｓｔｅｄｂｙｕｖｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔａ２６０ｎｍ/ ａ２８０ｎｍｏｆｄｎａｗａｓ１．６６２～１．８２６．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｄｎａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄａｂｌｅｔｏｏｂｔａｉｎｄｎａｗｉｔｈｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｂｙｉｎｓｐｅｃｔａｎｄｑｕａｒａｎｔｉｎｅｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｎａ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； rｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ；ｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ肉类食品的安全直接关系到人类的健康，建立准确的动物源性成分检测方法非常重要［１，２］。
实时定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）将荧光能量传递技术应用于常规ｐｃｒ中，具有高特异性和高灵敏性［３－５］。
动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定
地衣酚 (orcinol)，又称“3，5-二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚”、“苔黑酚”。化学 式C7H8O2.H2O。
原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣 酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰， RNA浓度在20 ~ 200μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。
等
思考题
RNA 提取方法有几种？有什么优 缺点？ RNA 提取过程中应注意什么？
DNA的提取及含量测定
在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚 中都含有丰富的DNA； 微 生 物 中 ， 面 包 酵 母 含 4% ， 啤 酒 酵 母 含 6% ， 大 肠 肝 菌 含 9%~10%。 本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸 钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使 其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质， 也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
• 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上 层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？），加同体积的氯仿-异戊醇混合液， 重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；
• 沉淀：准确量取上清液体积， (1/10体积3mol/L NaAC溶液), 加2倍体积95％冷乙醇，搅 拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分 钟，得白色沉淀（质量？）；
生物化学实验II
动物基因组DNA、总RN 的提取及含量测定
目的要求
• 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技 术；
4种方法提取牛肉干DNA的效果比较
表２
１’ａｂＩｅ ２ ＣＴ Ｖａｌｕｅｓ ０ｆ
４种方法提取的ＤＮＡ实时荧光ＰｃＲ扩增ｃＴ值
ｒｅａＩ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｍｐＩｉｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ４“ｎｄｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈＯｄｓ
万方数据
第７期
石盼盼，等：４种方法提取牛肉干ＤＮＡ的效果比较
２９２３
ｎｍ是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，Ａ２６０／Ａ２３０比 值表示糖类、盐分等的去除情况，纯度较好的ＤＮＡ溶液此
比值为２．０。若比值小于２．０说明样品中碳水化合物（糖类）、 盐类或有机溶剂含量较高。本实验结果如表１所示，从整 个提取过程耗时来看，０ＭＥＧＡ试剂盒法耗时最长需８～１２
ｐｌｕｓ小型离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；微量紫外分光
ＤＮＡ胁ｍ ｂｅｅｆｊｅｒｂ ｓ砌ｐｌｅ．ＴＡＫＡＲＡ ｋｉｔ
ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ａｎｄ
ｍｅｔｈｏｄ
ｈａｄ ｔｈｅ ｓｈｏｎｅｓｔ ｔｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ｏｆ ０．５ ｈ，ＯＭＥＧＡ ｌ【ｉｔ ｍｅｔｌｌｏｄ ｃｏｕｌｄ ｇｅｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｔ），ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ａ２６０／Ａ２８０ ｏｆ １．８０， Ｔｉａｎｇｅｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ＣＴ ｖａｌｕｅ ｇｅｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
＋通讯作者：石盼盼，助理工程师，主要研究方向为食品检验。Ｅ＿ｍａｉｌ：５２３ １５０９２０＠ｑｑ．ｃｏｍ
＋Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＳＨＩ
ＰａＩｌ—Ｐａｎ，Ａｓｓｉｓｔ卸ｔ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒ，ＩＩｌｓｔｉｔＩｌｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｑｕａｌ时ＳｕｐｅⅣｉｓｉｏｎ
碘化钾法提取DNA
仪器：低温高速离心机、漩涡振荡器、 核酸/蛋白质定量紫外分光光度计、移液 枪（100ul，200ul,1000ul）
试剂：0.9%NH4Cl 、PH8.0的TE缓冲液 、 生理盐水、氯仿、异戊醇、异丙醇，无 水乙醇，5mol/L碘化钾。
四、实验步骤
(一)DNA的提取 1、取EDTA-K2抗凝血300μL加入到1.5 mL Ep
水相层，转移到新的Ep管中； 7、加入180μL异丙醇于Ep管中，轻轻混匀， 12000r/min低温（4oC）离心5 min，
8、弃上清，加无水乙醇1.0 mL，放置5-
10min，12000 r/min低温（4oC）离心5 min， 弃去无水乙醇，待干燥。
9、加入25μLPH8.0的TE缓冲液溶解DNA。
基因组DNA的分离和纯化
一、实验目的
1、掌握利用漩涡振荡 器、核酸/蛋白质定量紫外分光光度计。
二、实验原理
1.碘化钾法提取DNA的原理：利 用氯化铵形成的低渗环境破坏红细胞， 后经碘化钾短时间破坏白细胞及其核膜， 再通过氯仿/异戊醇等蛋白变性剂沉淀蛋 白质、脂质及残存细胞碎片，最后异丙 醇沉淀基因组DNA，乙醇洗涤并除去异 丙醇，提取的基因组DNA用TE溶解。
五、实验结果观察
1、吸取5ulDNA样品，加PH8.0的TE缓冲液至
100ul，混匀后，装入紫外分光光度计的一次 性比色杯中。
2、用100ul的PH8.0的TE缓冲液为空白管调零。
3、读取仪器显示的A260与A260/A280两个值
4、DNA浓度=A260x20x50/1000（ug/ul） ； DNA纯度=A260/A280。
动物基因组DNA和RNA的提取
4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
三、动物基因组DNA的提取
（2）阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中 提取DNA。
由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子 去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
4）加入8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是 37℃效果要好些）。
5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以 5500rpm，离心15min。
6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇 匀10min，以5500rpm，离心15min。
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
2）破碎抽提核酸除去杂质 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它
（cpDNA），质粒DNA。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
2、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小
哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告
实验序号
五
实验名称
哺乳动物组织基因组DNA提取
（Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue）
实验时间
2012-5-10
实验室
Agarose、DNA molecular weight markers、Boric acid、Sugar、Bromophenolblue、Fluorescent dye(Gelview)
四、实验步骤(Experimental Procedures)
（一）储备液的制备
1. 5mol/L Nacl
2. 1 mol/LTrisHCl pH8.0
为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。
The protocol described here result in DNA that is easily cut with restriction enzymes and, therefore, is useful for Southern Hybridization studies. If the DNA is to be used to construct a clone bank, higher molecular weight DNA is desirable, so the vortex step should be eliminated.
生物综合实验室I
一、实验目的(Experimental Purpose)
用Chelex-100方法从牦牛乳中提取总DNA扩增线粒体DNA序列
用Chelex-100方法从牦牛乳中提取总DNA扩增线粒体DNA序列罗卉卉;金素钰;黄林;郑玉才【摘要】旨在建立一种从牦牛乳中快速提取总DNA并扩增线粒体基因的方法.实验以20头麦洼牦牛的乳为试验材料,用Chelex-100方法提取总DNA,扩增线粒体DNA(mtDNA)的D-loop区和细胞色素b基因(Cytb).结果显示,Chelex-100法能利用20 μL全乳或脱脂乳快速制备总DNA,用于mtDNA的D-loop区和Cytb基因的PCR扩增,条带清晰并能直接测序.该方法的PCR扩增一般需要45个循环,扩增效果存在一定的个体差异,且全乳优于脱脂乳,半奶牦牛乳优于全奶牦牛乳.建立的方法既可使用全乳,也可采用脱脂乳大规模提取总DNA,并扩增线粒体基因用于后续研究.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(044)005【总页数】6页(P467-472)【关键词】Chelex-100;牦牛;乳;线粒体DNA【作者】罗卉卉;金素钰;黄林;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q5;Q7乳中的体细胞主要包括白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和少量乳腺上皮细胞[1].健康奶牛乳中体细胞数量约2×104～2×105个/mL[2]，虽然远低于血液中的白细胞浓度（通常为4×106～10×106个/mL），但仍能用于提取DNA[3-4].乳中提取DNA的方法有很多.Volk等人[5]采用苯酚—氯仿法从2 mL牛乳中提取DNA，方法中使用了氯仿、异丙醇等有害试剂，且实验耗时较长；崔艳华[6]采用盐析法从50 mL牦牛乳中提取DNA，提取步骤较为复杂；Liu等人[7]采用丙酮法和SDS—苯酚法从13 mL牛乳中提取DNA；Psifidi等人[8]采用商业试剂盒法提取乳中DNA，但试剂较昂贵.综上所述，目前从牛乳中提取DNA的方法往往耗时较长、试剂价格高，并且需要较大体积的牛乳（2 mL～50 mL），有时还会使用有害试剂而影响操作人员或环境.Amills等（1997）报道了利用Chelex-100方法从乳中快速提取基因组DNA，用于扩增一些核基因.由于线粒体DNA常被运用于疾病诊断、遗传等分析[9]，本研究建立了一种简单、快速、无毒且廉价的从少量牦牛乳中分离总DNA的方法，扩增线粒体DNA的D-loop区和细胞色素b基因（Cytb）.1 材料与方法1.1 乳样的采集和处理麦洼牦牛（Bos grunniens）乳样采自四川省红原县.于7月份泌乳高峰季节，在早晨对全奶麦洼牦牛（采样当年产犊）和半奶麦洼牦牛（采样前一年产犊）各10头手工挤乳，每头采集约50 mL全乳，冰冻后用冰瓶带回实验室.每个乳样取部分以800 g于4℃离心20 min，制备的脱脂乳分装.所有样品均保存于-80℃.实验时全乳和脱脂乳样品已保存约2年.1.2 牦牛乳中DNA的提取参考Amills等[10]的方法，采用 Chelex-100提取麦洼牦牛全乳和脱脂乳中的DNA.主要过程:取20 μL全乳或脱脂乳加入到980 μL超纯水中，涡旋15 s，再以12000 g室温离心3 min；沉淀用100 μL的5%Chelex-100（Bio-Rad，美国）重悬，再加入4 μL 的 10 mg/mL新鲜蛋白酶K（Bio-Froxx，德国），56℃金属浴55 min后，于沸水浴中变性8 min，冷却后于-20℃保存.1.3 用PCR扩增线粒体DNA两个基因序列根据GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1），用Premier 5.0软件设计扩增线粒体DNA的D-loop区的PCR引物.Cytb基因的引物参考胡强等的报道[11].D-loop-F:ccatcaacccccaaagctgaagttc， D-loop-R:caggaaggctgggaccaaacctatg； cytb-F:taccatgaggacaaatatcattctg，cytb-R:cctcctagtttgttagggattgatcg.预期扩增片段长分别为1045 bp和472 bp.引物由擎科梓熙生物技术有限公司合成.以乳中提取的DNA为模板进行PCR扩增（PCR仪，Bio-Rad）.D-loop和 Cytb 基因的 PCR反应体系（25 μL）:DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μM）各 1μL，Golden Star T6 Super PCR Mix（擎科梓熙）21 μL.PCR扩增程序:98℃ 预变性3 min；98℃变性30 s，退火（温度:D-loop为60℃，Cytb基因为55℃）30 s，72℃延伸30 s，45个循环；最后72℃延伸5 min.PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测.为比较全乳与脱脂乳、全奶与半奶牦牛乳提取DNA的PCR扩增差异，取全乳、脱脂乳提取的DNA各6个，及全奶牦牛乳、半奶牦牛乳提取的DNA各6个，分别扩增Cytb基因，比较PCR扩增效果.同时，取全奶牦牛全乳提取的DNA两个，分别扩增35、40、45、50、55个循环，比较不同循环数PCR扩增效果.1.4 PCR产物的直接测序为检验乳中提取DNA的PCR产物是否可用于后续研究，将乳中提取DNA扩增Cytb基因的PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程有限公司进行产物直接测序.获得的序列与GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1）进行比对.2 结果2.1 乳中DNA的提取及线粒体DNA的PCR扩增以麦洼牦牛（n＝10）全乳中提取的DNA为模板，用PCR扩增线粒体 D-loop区和Cytb基因的部分片段，琼脂糖凝胶电泳可显示与预期片段大小相符的、特异的扩增产物条带，条带亮度较大，无杂带（图1）.但个体间的扩增效率存在差异（如图1B中，Q4和Q10样品扩增条带较暗）.2.2 不同牦牛乳DNA对PCR扩增Cytb基因的影响以半奶牦牛（n＝6）全乳、脱脂乳提取的DNA为模板，扩增Cytb基因效果存在差异（图2A）.全乳提取DNA扩增条带亮度明显大于脱脂乳，同时个体之间也存在差异.表明Cytb基因的扩增可采用全乳，也可采用脱脂乳提取DNA作为模板，但是全乳效果更好.比较6头全奶牦牛和6头半奶牦牛的全乳提取的DNA扩增Cytb基因效果，发现虽然均能进行PCR扩增，并存在个体差异，但半奶牦牛乳提取的DNA，扩增条带总体更亮（图2B）.2.3 循环数对PCR扩增Cytb基因的影响以2头全奶牦牛（A和B）全乳提取的DNA为模板，比较循环数对PCR扩增Cytb基因的影响.发现当扩增循环数从35增至55时，条带亮度增加，但45个以下循环的扩增条带亮度较弱（图3）.2.4 乳DNA的PCR扩增产物的测序以乳DNA为模板，PCR扩增Cytb基因的产物直接测序表明，测序峰图清晰（图4），能正确获得序列.通过与GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1）进行比对，证实该基因确实为Cytb基因，表明扩增产物可应用于进一步实验.图1 PCR扩增牦牛乳源线粒体DNA的D-loop区和Cytb基因的琼脂糖凝胶电泳图（A）和（B）分别为扩增mtDNA D-loop区、Cytb基因的结果.M为DNA Marker；Q1～Q10为10头全奶牦牛的全乳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of mtDNA D-loop region and Cytb gene amplified using yak milk DNA templates（A）and（B）are the results of amplification of mtDNA D-loop region and Cytb gene from whole milk DNA；M:DNA Marker；Q1 ～ Q10 are the whole milk samples of 10 total lactating yaks图2 不同牦牛乳提取DNA扩增Cytb基因的琼脂糖凝胶电泳图（A）和（B）分别为牦牛脱脂乳和全乳、半奶牦牛和全奶牦牛全乳DNA扩增Cytb基因的结果；M 为DNA Marker；BT1～BT6和B1～B6分别为6头半奶牦牛的脱脂乳和全乳；B1～B6和Q1～Q6分别为半奶牦牛和全奶牦牛不同个体的全乳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified using DNA extracted from different yak milk samples（A） and （B） are the results amplifying the Cytb gene using DNA extracted from yak whole milk and skim milk，and milk of half-lactating yak and total-lactating yak，respectively；M:DNA Marker；BT1 to BT6 and B1 to B6 are skim milk and whole milk of six half-lactating yaks，respectively；B1 ～ B6 and Q1 ～ Q6 are whole milk of half-lactating yaks and total-lactating yaks，respectively图3 全奶牦牛全乳DNA在不同循环数下扩增Cytb基因琼脂糖凝胶电泳图M为DNA Marker；A、B为两个牦牛样品，图下数字为PCR循环数.Fig.3 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified from whole milk DNA of total-lactating yak at different cyclesM:DNA Marker；A and B are two yak samples.The figure under the map shows the number of PCR cycles.图4 全奶牦牛全乳DNA扩增细胞Cytb基因的部分测序峰图Fig.4 Sequence peak map of the partial Cytb gene amplified using whole milk DNA of total-lactating yak3 讨论本研究建立了从牦牛乳中快速提取总DNA扩增线粒体Cytb基因、D-loop区的方法，扩增产物条带清晰，无杂带，可用于直接测序并获得正确的结果.Amills等人[11]用 Chelex-100法从牛乳中提取了DNA，用于扩增细胞核中的多个功能基因和微卫星序列，并未涉及线粒体基因.而本研究表明，提取的DNA还可用于扩增线粒体 DNA，其中 D-loop区长度达1000 bp左右（图1），产物的进一步测序等可为基于乳样品的遗传学分析提供科学的数据.Chelex-100方法提取的乳DNA在扩增时存在个体差异，某些样品在相同条件下扩增条带较淡（图1 B），这可能与乳中细胞数量差异有关.有研究表明，牛乳中体细胞数量受许多因素影响，例如品种、产奶量、泌乳阶段和个体差异等[12].Usman[13]等人采用试剂盒方法提取的牛乳DNA进行PCR扩增，条带亮度也存在明显的个体差异.另外，Chelex-100法提取全乳、脱脂乳DNA扩增线粒体DNA的Cytb基因或D-loop区的效果存在明显差异（图2A），这可能也与二者的体细胞数量差异有关.脱脂乳比全乳中体细胞数量低[14].虽然牦牛全乳所提DNA 扩增效果比脱脂乳好，但脱脂乳也能用于提取DNA.由于脱脂乳更易保存，这扩展了基于乳中DNA的PCR分析.类似的机制也可解释半奶牦牛乳DNA扩增效果好于全奶牦牛的原因.有研究表明，半奶牦牛与产犊当年挤乳的全奶牦牛相比，虽然挤乳量显著下降，但是乳蛋白、乳脂含量极显著增加[15].因此，半奶牦牛乳更适合用Chelex-100方法提取总DNA.全奶牦牛全乳提取的DNA在PCR扩增Cytb基因时，45循环数以下扩增条带较淡.Amills等人[11]用Chelex-100法从牛乳中提取的DNA在PCR扩增45循环以下时，扩增条带亮度也不高.结合本研究结果，作者认为用Chelex-100方法从乳中提取DNA用于PCR时，其循环数应大于45个循环.综上所述，本研究建立了用Chelex-100方法快速提取牦牛全乳和脱脂乳DNA，并扩增线粒体DNA的D-loop区和Cytb基因的方法，为基于乳的分子遗传研究提供了可靠的技术.参考文献【相关文献】[1]BOUTINAUD M，JAMMES H.Potential uses of milk epithelial cells:areview[J].Reproduction Nutrition Development，2002，42（2）:133-147.[2]PANTOJA J C，HULLAND C，RUEGG P L.Somatic cell count status across the dry period as a risk factor for the development of clinical mastitis in the subsequentlactation[J].Journal of Dairy Science，2009，92（1）:139-148.[3]LIAO J，LIU Y F，YANG L，et al.Development of a rapid mitochondrial DNA extraction method for species identification in milk and milk products[J].Journal of Dairy Science，2017，100（9）.[4]KOUNELLI M L，KALOGIANNI D P.A sensitive DNA-based fluorometric method for milk authenticity of dairy products based on spectrally distinct microspheres[J].European Food Research and Technology，2017，243（10）:1773-1781.[5]VOLK H，PISKERNIK S，KURIN CˇICˇ M，et al.Evaluation of different methods for DNA extraction from milk[J].Journal of Food＆Nutrition Research，2014（2）:1-10.[6]崔艳华，马莺，曲晓军，等.牦牛乳中DNA提取方法的建立与优化[J].哈尔滨工业大学学报，2011，43（2）:66-69.[7]LIU YF，GAO J L，YANG Y F，et al.Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk[J].Journal of Dairy Science，2014，97（11）:6804-6809.[8]PSIFIDI A，DOVAS C I，BANOS G.A comparison of six methods for genomic DNA extraction suitable for PCR-based genotyping applications using ovine milksamples[J].Molecular and Cellular Probes ，2010，24（2）:93-98.[9]齐小辉，马玺，赵凯，等.线粒体DNA及其应用[J].生物技术通讯，2003，14（5）:413-415.[10]AMILLS M，FRANCINO O，JANSA M，et al.Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin[J].Journal of Dairy Research，1997，64（2）:231-238. [11]胡强，郑玉才，金素钰，等.用通用引物扩增细胞色素b基因进行牦牛肉的鉴定[J].食品科学，2007，28（11）:319-322.[12]RUPP R，BOICHARD D，BERTRAND C，et al.Overview of milk somatic cell counts in French dairy cattle breeds[J].Inra Productions Animales，2000，13（4）:257-267. [13]USMAN T，YU Y，LIU C，et parison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk[J].Genetics and Molecular Research，2014，13（2）:3319-3328.[14]POKORSKA J，KULAJ D，DUSZA M，et al.New rapid method of DNA isolation from milk somatic cells[J].Animal Biotechnology，2016，27（2）:113-117.[15]郑玉才，钟光辉，王永，等.半奶牦牛泌乳生理生化特点的研究[J].中国农业科学，2002（04）:421-425.。
牦牛CAPN1基因的克隆与序列分析
ｃ Ｄ Ｎ Ａ ｓ 的克隆和测序， 并且已经获得了这种 ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ蛋 白在组成和结构等方面的很多特性。 研究表明， ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ对于肌原纤维的降解和肉在 μ 冷冻贮藏过程中的嫩化具有重要作用
［ ５ ～ ７ ］
，其大亚基
的编码基因 Ｃ Ａ Ｐ Ｎ １可作为影响肌肉嫩度的数量性状位
中图分类号 Ｑ ７ ８ ５ Ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ 是一类特异性依钙激活的中性半胱氨酸内 肽酶， 其广泛地分布于绝大多数动物细胞中。其中 μ ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ 是由微 摩 尔 钙 激 活 的 无 组 织 特 异 性 的 钙 蛋 白
１ ］ ２ ］ 酶。到目前为止， 科学家已经成功地在人类 ［ 、 鼠［ 、 ３ ］ ４ ］ 牛［ 、 猪［ 、 鸡和斑马鱼等物种上进行了 μ ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ
部分后根据引物的先后顺序拼接得到 ２ ２ ６ ７ ｂ ｐ的片段， 经比对确为牦牛 Ｃ Ａ Ｐ Ｎ １基因序 列 （ Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ序 列 号： Ａ Ｆ ５ ６ ５ ８ １ ６ ） 其中 包 含 一 个 ２ １ ５ １ ｂ ｐ的 完 整 的 开 放 阅 读 ′ 和５ ′ 末端非编码区的部分序列（ ７ ７ ｂ ｐ和 框， 以及 ３ １ ６ ６ ｂ ｐ ） 。编码 区 序 列 与 已 知 的 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ中 发 布 的 牛 Ａ Ｆ ２ ２ １ １ ２ ９ ） 的核苷酸同源性为 ９ ９ ． ３ ％， 共有 １ ４个核 （ 苷酸发生了突变。与猪、 人、 猕猴、 小鼠、 大鼠、 鸡、 鹌鹑 ９ ３ ． ９ ％ 、 ９ ０ ． ９ ％、 ９ １ ． ３ ％、 ８ ５ ． ５ ％、 的同 源 性 分 别 为： ８ ５ ． ５ ％、 ７ ２ ． ３ ％和 ７ １ ． ３ ％（ 表２ ） 。对核苷酸组成进行 分析表明 Ｇ＋ Ｃ的含量为 ６ ０ ． ０ ２ ％。
一种提取动物基因组总DNA的野外样品保存方法
收稿日期：!""#$%"$!&作者简介：蔡振媛（%’&%!），女，硕士研究生，研究方向：分子进化生物学，()*+,-：.+,/01234+2"056*+,-7.5*!通讯作者，()*+,-：89:4"2;,9<7+.7.2一种提取动物基因组总!"#的野外样品保存方法蔡振媛%，!，张同作%，连新明%，!，慈海鑫%，!，苏建平%!（%7中国科学院西北高原生物研究所，西宁&%"""&；!7中国科学院研究生院）摘要：为了确定一种方便的野外动物样品保存方法，以新鲜材料作对照，从$!"=冰箱、>"?乙醇、含#"**5-／@(A B C 的>"?乙醇、’#?乙醇、液氮处理的高原鼠肌肉和肝脏组织中提取基因组总A D C 。
通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的基因组总A D C 质量进行检测。
结果显示：相同处理的肝脏A D C 产量大，肌肉组织提取的A D C 质量好；各种保存方法提取的A D C 降解程度依次为，$!"=冰箱、>"?乙醇"含#"**5-／@(A B C 的>"?乙醇、’#?乙醇"液氮"新鲜。
选择新鲜肌肉和’#?酒精处理的肌肉样品提取的总A D C 作模板，进行微卫星E F G 扩增，均可获得清晰的电泳带。
将该方法用于高原鼢鼠，进行线粒体%!H I G D C 、F 36!和A )-559区测序，结果显示该方法保存的样品与新鲜样品没有差别。
因此，在野外用’#?乙醇固定肌肉样品是一种可行的样品保存方法。
关键词：野外取样；高原鼠兔；高原鼢鼠；样品保存方法；总A D C 提取中图分类号：J >&文献标识码：C文章编号：%"""$>"&K （!""L ）"K $"M >K $"##$%&’()*+$’,-(.+/+’0,1,2#3&4(*$(45*+2,-67’-(8’&3.9+3,4&8!"#&3:&+*1F C N O 012)34+2%，!，O P C D QB 52R )/45%，@N C DS ,2)*,2R %，!，F NP +,)T ,2%，!，H UV ,+2)9,2R%!（%7D 5I 60;1:6E -+61+4N 2:6,64615W X ,5-5R 3，601F 0,21:1C .+Y 1*35W H .,12.1:，S ,2,2R &%"""&；!7Q I +Y 4+61H .055-5W F 0,21:1C .+Y 1*35W H .,12.1:）#);’-(8’：N 25I Y 1I 65:1-1.6+:4,6+<-1*1605Y 5W Z 119,2R +2,*+-:+*9-1:,2601W ,1-Y ，R125*,.A D C;+:1T 6I +.61Y W I 5**4:.-1+2Y -,[1I :5W 9-+61+49,Z +;0,.0;1I 1W I 5/12,2-,\4,Y 2,6I 5R12+2Y$!"=，W ,T 1Y;,60>"?5I ’#?160+25-，9I 1:1I [1Y ,2#"**5-／@(A B C5W >"?160+25-，+2Y 601W I 1:0*4:.-1+2Y -,[1I :4:1Y +:.526I 5-:+*9-1:]B 011T 6I +.61Y 656+-A D C;+:1T +*,21Y;,60R 1-5:1R 1-1-1.6I 5905I 1:,:+2Y 4-6I +[,5-16:91.6I 590565*161I ]B 01I 1:4-6:,2Y ,.+61Y 60+6A D C .54-Y <1R 56W I 5*+--601:+*9-1:，;01I 1+:601\4+-,63+2Y \4+26,635W 656+-A D C;1I 1Y ,W W 1I 126]B 01\4+-,635W 6011T )6I +.61YA D C W I 5**4:.-1+2Y 601\4+26,63W I 5*-,[1I :;1I 1:+6,:W ,1Y ]^I 1:0:+*9-1:+2Y :+*9-1:W I 5/12,2-,\4,Y 2,6I 5R 12+2Y W ,T 1Y ,2;,60#"**5-／@(A B C5W >"?160+25-+2Y ’#?160+25-;1I 1<1661I 60+2:+*9-1:W I 5/12$!"=+2Y W ,T 1Y ,2>"?160+25-]B +Z ,2R ,265.5*9I 1012:,[1.52:,Y 1I +6,52，601*4:.-1W ,T 1Y ,2’#?160+25-;+:601<1:6:+*9-1]B 0165)6+-A D C1T 6I +.61Y W I 5**4:.-1:+*9-1:;0,.0;1I 1W ,T 1Y ,2’#?160+25-+2Y W I 1:0;+:4:1Y +:61*9-+61,2*,.I 5:+61--,61:,61+*9-,W ,.+6,52+2Y 6019I 5Y 4.6,52:6I ,9:;1I 1.-1+I ).46]^4I 601I*5I 1，*,65.052Y I ,52A D C%!H I G D C ，F 36<+2YA )-559:1\412.,2R ;1I 14:1Y 6561:6,W 601A D C1T 6I +.61Y W I 5**4:.-1:+*9-1:5W 9-+61+4/5Z 5I W ,T 1Y ,2’#?160+25-.54-Y 91I W 5I *;1--]B 01I 1:4-6:5W A D C1T +*,2+6,52:05;1Y25Y ,W W 1I 12.1<16;112*4:.-1:+*9-1:W ,T 1Y ,2’#?160+25-+2Y W I 1:0521]N 2.52.-4:,52，,2601W ,[1Y ,W W 1I 126:+*9-1::65I +R 1*1605Y :，*4:.-19I 1:1I [1Y ,2’#?160+25-;+:601<1:6;+3<3[,I 6415W .I 1Y ,<,-,63，1.525*3，:,*9-121::+2Y :+W 163]<+=>,-1;：:+*9-1.5--1.6,52；"#$%&%’(#)*+%’,(-；.%/0(1(2!(,1-3,；:+*9-19I 1:1I [+6,52；656+-A D C1T 6I +.6,52%’’!年_5-1.4-+I(.5-5R 3在英国正式创刊，标志着分子生态学已经成为生态学的一个新分支学科。
用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA
用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA 周凡莉;黄林;金素钰;郑玉才【摘要】旨在建立快速、大规模提取牦牛(Bos grunniens)肌肉中基因组DNA的方法.试验样品为冰冻保存的九龙牦牛背最长肌(n=10).采用两种取样方法(镊子取样和枪头取样)采集冰冻的肌肉样品,用Chelex-100方法提取其中的基因组DNA,并进行PCR扩增.结果显示,镊子取样和枪头取样提取的基因组DNA,均可用于两个核基因和一个线粒体基因的PCR扩增,但枪头取样简便易行,提取的DNA用PCR 扩增细胞色素b,扩增35个循环数的PCR产物可直接测序.表明Chelex-100法可用于快速提取牦牛肌肉中基因组DNA,操作简单,成本低廉,适用于大规模提取组织中的DNA.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】5页(P347-351)【关键词】Chelex-100法;肌肉;基因组DNA;牦牛【作者】周凡莉;黄林;金素钰;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q52;S823动物基因组DNA提取方法包括十二烷基磺酸钠(SDS)法、酚-氯仿抽提法、碱裂解法、试剂盒提取法等[1].其中酚-氯仿抽提取法实验过程复杂、耗时，容易产生交叉污染，使用有害试剂；而试剂盒法操作过程较多，大规模使用成本较高；Chelex-100法近年来被广泛使用，适应于微量样品提取DNA[2-3].Chelex-100树脂可去除样品和缓冲液中的金属离子，防止DNA降解，操作简便，已用于血液、乳、蚊虫附肢、眼角膜、肝脏和肌肉、口腔黏膜细胞等生物材料提取基因组DNA[4-9].用Chelex-100法提取DNA的全部过程在同一个EP管中进行，污染机会少，检材损失小，适用于微量生物样品的DNA提取，虽然提取的DNA纯度不高，但作为PCR反应模板制备方法具有很大的优势[10].肌肉组织是常见的实验材料.本研究尝试建立用Chelex-100法快速提取牦牛肌肉中基因组DNA，以便为开展大规模的分子遗传学研究提供材料.1 材料与方法1.1 样品的采集与处理九龙牦牛背最长肌采自四川省甘孜州的九龙县.在冬季牦牛屠宰时，采集背最长肌，迅速冰冻后用冰瓶带回实验室，-80℃保存至分析.样品分析时已经在该条件下保存长达9年.本研究取10个背最长肌样品进行试验.1.2 肉中基因组DNA的提取参考Amills等提取乳样DNA的方法[11]提取肌肉中基因组DNA.主要步骤如下：1.5 mL的EP管中加入100 μL 的 5%Chelex-100和2 μL 的 20 mg/mL 新鲜蛋白酶K，加入肌肉组织，涡旋10 s；56℃金属浴孵育30 min；保温结束后于100℃沸水浴变性8 min，迅速置于冰上冷却3 min；涡旋10 s，8000 g离心1 min，上清液分装备用，-20℃保存.本研究中试验的肌肉保持冰冻状态，采取两种方法取样.方法一(镊子取样)：用干净的镊子，迅速取小米粒大小的肌肉；方法二(枪头取样)：采用倾斜修剪的200 μL枪头，迅速插取肌肉，该方法在枪头上并未见明显的肌肉组织.1.3 PCR引物的设计用PCR扩增核基因和线粒体基因.根据GenBank数据库中普通牛的Prdm 9(登录号：KJ020105)，利用Primer Premier 5.0软件设计Prdm 9基因的PCR引物.扩增牦牛Cytb和CSN2基因分别参考胡强等[12]和McLachlan[13]研究中的引物.3个基因的引物序列和预期扩增长度等信息见表1.引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成.表1 PCR引物信息Table 1 The information of PCR primers基因引物序列(5′-3′) 退火温度/℃ 扩增长度/bp Prdm9 F：CCAGCACAAGCCAGAAACCGAATC R：TGTCTTAGTTGCAGCATGTGGGAGC 66 893 Cytb F：TACCATGAGGACAAATATCATTCTG R：CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG 55 472 CSN2 F：CCTTCTTTCCAGGATGAACTCCAGG R：GAGTAAGAGGAGGGATGTTTTGTGGGAGGCTCT 66 2981.4 PCR扩增与检测Prdm9、Cytb和CSN2基因的PCR扩增反应体系(25.5 μL)：金牌Mix(Green)22 μL，DNA 模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL.PCR扩增条件：98℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；退火(温度见表1)30 s；72 ℃延伸(3个基因依次为40 s、15 s、10 s)，共计35个循环；72℃延伸5 min.PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.1.5 PCR产物的测序与分析为验证PCR产物可用于后续研究，将Cytb基因的PCR产物送上海生工生物公司进行正向测序，利用DNAman软件与普通牛(登录号：AY885283)和普通牦牛(登录号：KM280686)序列进行比对.2 结果2.1 镊子取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增牦牛肌肉样品用镊子取样后提取基因组DNA，PCR扩增CSN2、Cytb和Prdm9基因，发现3个基因的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合(图1).3个基因的扩增效果均存在样品个体差异，如牦牛Cytb基因扩增产物的电泳条带的亮度存在较明显的个体差异(图2).2.2 枪头取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增牦牛肌肉样品用枪头取样后提取基因组DNA，PCR扩增Cytb基因，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合.PCR循环数与扩增效果有关，大部分样品PCR扩增35个循环的产物可用于直接测序(图3).图1 九龙牦牛CSN2、Cytb和Prdm9基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-3：CSN2、Cytb和 Prdm9 基因；M：DNA Marker 2000.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of CSN2，Cytb and Prdm9 genes of Jiulong yak图2 九龙牦牛Cytb基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-7：Cytb基因；M：DNA Marker2000.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene of Jiulong yak图3 九龙牦牛Cytb基因不同循环数的PCR产物琼脂糖凝胶电泳1-3：45 个循环；4-6：35 个循环；M：DNA Marker 2000.Fig.3 Agarose gel electrophoresisof the PCR products of Cytb gene in Jiulong yak with different cycles2.3 PCR扩增产物的直接测序对九龙牦牛Cytb基因的PCR产物进行正向测序，结果与数据库中的普通牦牛(登录号：KM280686)、普通牛(登录号：AY885283)序列进行比对，发现九龙牦牛与普通牛的序列存在差异，但与普通牦牛的序列高度一致(图4).说明用Chelex-100法提取的牦牛肌肉中基因组DNA，PCR扩增的产物可直接测序，并获得正确的序列.图4 九龙牦牛、普通牦牛和普通牛的Cytb基因序列信息比对Fig.4 Sequence alignments of Cytb gene of Jiulong yak，yak and cattle3 讨论近年来Chelex树脂越来越多地应用于提取动物基因组DNA，国内外均有不少报道[3，14].Algriw等研究表明，Chelex-100和试剂盒均适用于提取肝脏和肌肉基因组DNA，且Chelex-100方法提取的产量更高.Chelex-100法是一种廉价、快速、有效的提取DNA的技术[11]，本试验用该方法提取肌肉中的基因组DNA，整个过程只需要约30 min，而Cytb基因的PCR产物序列与普通牦牛、普通牛序列信息比对(图4)，证明了Chelex-100法提取的基因组DNA的完整性，说明该方法适用于快速提取肌肉组织的DNA，并且对后续实验无影响.提取肌肉等组织DNA时，一般先定量取样并匀浆，再进行后续提取实验[15].这种方式用于大规模提取DNA时，工作量大且费时长.大规模提取肌肉组织DNA时，用镊子取样工作量大，增加交叉污染的可能.本研究采用的枪头取样简单易行，无交叉污染，适用于大规模取样，并且是在样品冰冻条件下进行.本研究比较了冰冻肌肉样品的两种取样方法，扩增2个核基因和1个线粒体基因，产物长度约300 bp～900 bp，均获得了正确的结果.不足之处在于两种取样方法均无法准确定量，尤其是枪头取样更难以控制取样量，这导致PCR产物的电泳条带亮度有个体差异. 对于没有准确称量的组织样品，Chelex-100法提取微量的DNA作为模板进行PCR扩增，需要适当调整循环数.本试验中枪头取样提取的DNA作为模板进行PCR扩增时，35个循环后一些样品扩增产物浓度不是特别高，可能不能用于直接测序，需要适当增加循环数，这与Amills等从乳中提取DNA进行PCR的研究结果一致[11].本研究表明，可用修剪后的一次性枪头对冰冻肌肉进行取样，采用Chelex-100法快速、大规模提取牦牛肌肉中的基因组DNA，用于PCR扩增和后续的研究.参考文献【相关文献】[1]周丽，李飞，魏刚.动物DNA提取方法概述[J].畜牧与兽医，2008，40(3)：66-68.[2]常瑞刚，刘丽霞.八眉猪基因组DNA提取方法比较[J].浙江农业科学，2017，58(4)：711-711.[3]徐可成，董跃丽，杨子祥，等.Chelex-100法提取甘薯小象甲DNA及云南地区甘薯小象甲的分子鉴定[J].植物保护，2017，43(3)：154-159.[4]WINGBERG G.A rapid method for preparing DNA from blood，suited for PCR screening of transgenes in mice[J].PCR Methods and Applications，1991，1(1)：72-74.[5]PINGCUO S，GAO J，JIANG ZR，et al.Duplication polymorphisms in exon 4 of κ-casein gene in three yak breeds/populations[J].Genetics and Molecular Research，2015，14(3)：10242-10248.[6]闫振天，司风玲，鲜鹏杰，等.基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术[J].重庆师范大学学报(自然科学版)，2017，34(5)：26-31.[7]IOVIENO A，MILLER D，LONNEN J，et al.Extraction of Acanthamoeba DNA by use of Chelex resin[J].Journal of Clinical Microbiology，2011，49(1)：476.[8]ALGRIW H H，ZRABA Z A，AL-MUNTASER S K，et al.Effects of storage temperature on the quantity and integrity of genomic DNA extracted from mice tissues：A comparison of recovery methods[J].Open Veterinary Journal，2017，7(3)：239-243.[9]李子怡，田秀荣，付佳，等.Chelex100法提取的口腔黏膜细胞DNA在STR分析中的研究[J].中国优生与遗传杂志，2017，25(03)：37-38，13.[10]WILLARD J M，LEE D A，HOLLAND M M.Recovery of DNA for PCR amplification from blood and forensic samples using a chelating resin[J].Methods in Molecular Biology，1998，98：9-18.[11]AMILLS M，FRANCINO O，JANSA M，et al.Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin[J].Journal of Dairy Research，1997，64：231-238.[12]胡强，郑玉才，金素钰，等.用通用引物扩增细胞色素b基因进行牦牛肉的鉴定[J].食品科学，2007(11)：319-322.[13]MCLACHLAN，C N.Breeding and milking cows for milk free of β-casein A1[P].United States Patent：US7094949B2，2006-8-22.[14]MAO J X，LV J，MIAO Y，et al.Development of a rapid and efficient method for non-lethal DNA sampling and genotyping in scallops[J].PLoS One，2013，8(7)：e68096. [15]陈珉，张恩迪.獐不同组织材料DNA提取的有效方法[J].四川动物，2006，25(3)：481-484.。
福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法
动物学报 48(2):264～269,2002A cta Zoologica S i nica 方法和观点Methods and Viewpoints福尔马林保存的动物标本基因组D NA 的提取方法3徐来祥①② 张知彬①33 宋铭晶① 曹小平① 王福生① 张春光③(①中国科学院动物研究所虫鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京100080)(②曲阜师范大学生物系,山东曲阜273165)(③中国科学院动物研究所动物进化与系统学研究中心,北京100080)摘 要 从在福尔马林长期保存的动物物标本中提取基因组DNA 用于分子生物学研究一直是一个未得到彻底解决的难题。
本文提出了一种从浸泡在福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取基因组DNA 的新方法。
取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量,用PBS 溶液冲洗,放在灭菌的吸水纸上将其揩干,于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50mg 的小块,放入PBS 液浸泡12～24h ;然后转入70%的乙醇中处理12～24h 。
依次换入下列梯度酒精中处理:80%乙醇,2h ,重复一次;90%乙醇,2h ,重复一次;95%乙醇,2h ,重复一次;100%乙醇,1h ,重复一次。
然后将材料放入1/2倍的PBS 液中浸泡12h ,其间更换一次溶液。
提取方法参考Sambroock 等人(1989),加蛋白酶K 的量按标准量(100μg/mL ),在50～56℃温浴3～6h 处理过程中,不断轻摇混匀,视消化效果可以重复加入标准量的1/2倍蛋白酶K 进行消化,直至将材料完全消化为止;酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析;沉淀DNA 时,在-20℃下20min 效果为宜。
该方法主要特点在于对标本进行预处理,在保证不使DNA 进一步降解的前提下,首先去除标本中所含的福尔马林溶液的成分,然后利用改进的酚氯仿抽提法提取该类标本的基因组DNA ,再进一步用透析法纯化DNA 。