RNA提取试剂灭菌
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤
Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA 只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
组织RNA提取
哺乳动物组织样品RNA的抽提哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。
以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。
关键词：抽提样品哺乳动物组织样品RNA哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。
以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。
一、实验材料：Trizol试剂（Invitrogen公司）研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可；二、具体过程：1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。
组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。
可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。
2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。
从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。
一次研磨的组织块重量不要超过300mg。
3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。
由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状。
可以继续研磨此固体成粉末，随着研钵温度回升到室温，固体状的 Trizol逐步回复到液体状态，此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol 的量太少，需在此步继续补加Trizol。
若 Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。
由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。
4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min。
试剂盒提取RNA
RNA提取（试剂盒法）1、取适量的植物组织（0.5g）多次加液氮研磨至粉末状，将粉末状样品（50-100mg）加入到含有450uL Buffer RL（使用前加入50×DTT Solution，1mL Buffer RL中加入20uL50×DTT，现用现配）的1.5mL灭菌管中，移液器反复吸打至无明显沉淀2、12,000rpm，5min，4℃3、上清转移到新的1.5mL管4、加入1∕2倍体积的无水乙醇（可能出现沉淀）吸打混匀5、立即将混合液（含沉淀）转入RNA Spin Column（含2mLCollection Tube）中。
（若混合液体积大于600uL，分批加入，每次加入体积不大于600uL）6、12,000rpm，1min，弃滤液，将RNA Spin Column放回2mLCollection Tube7、将500uL Buffer RW A加入RNA Spin Column，12,000rpm，30s，弃滤液8、将600uL Buffer RWB加入RNA Spin Column，12,000rpm，30s，弃滤液（RWB使用前加70mL100％乙醇）（沿RNA Spin Column管壁四周加入Buffer RWB有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐分）9、DNase I消化⑴DNase I反应液：5uL 10 × DNase I Buffer，4uL Recombinant DNase I（RNase free，5U∕uL），41uL RNase free dH2O到新的1.5ml RNase free Tube 混匀⑵向RNA Spin Column膜中央加入50uLDNase I 室温静置15min⑶向RNA Spin Column膜中央加入350uL Buffer RWB，12,000rpm，30s，弃滤液10、重复步骤811、将RNA Spin Column重新置于2mLCollection Tube，12,000rpm，2min12、将RNA Spin Column置于1.5mL RNase free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央加入50-200uL RNase free dH2O或0.1％DEPC水，室温静置5min13、12,000rpm，2min 洗脱RNA14、若想提高RNA收量可再向膜中央加入50-200uL RNase free dH2O或0.1％DEPC水；若想提高RNA浓度可将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column室温静置5min，12,000rpm，2min 洗脱RNA。
提取植物组织RNA的准备工作和操作规范
提取RNA前的准备工作1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服，戴口罩和一次性手套，触摸皮肤（例如面部）、门把手及实验室其他未处理过RNase的普通物体表面后立即更换手套。
2、器具干烤：需要干烤的器具包括金属和玻璃制品，如研钵、钥匙、镊子、剪刀、试剂瓶（200mL、500mL、1L）、量筒（50mL、100mL）、烧杯，即所有在配制RNA提取试剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。
所有干烤的器具均用锡箔纸包住，如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器，容器用锡箔纸封口，如试剂瓶、量筒和烧杯。
180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。
3、DEPC水的处理：用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的DEPC水可以在烧杯中配制，磁力搅拌器上搅拌过夜，搅拌过程中用锡箔纸封口。
用于配制RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制，盖上瓶盖搅拌过夜后121℃灭菌20min。
4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高温灭菌，移液器必须是专用的，用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器，特别是枪杆。
超净台的处理：用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭，再用75%酒精擦拭，将提取所需的物品放入超净台，并用75%酒精擦拭，另放置一个废物缸，表面喷酒精，上述完成后，超净工作台紫外灯照射15-20min。
试剂配制过程中所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。
5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇，用DEPC水处理过的15mL离心管分装，每管分装10mL并于4℃保存，最后溶解RNA沉淀的DEPC处理过的水用处理过的1.5mL离心管分装并于-20℃保存。
6、用专用的电泳槽电泳RNA，用DEPC处理的水配制50×TAE缓冲液，每次电泳前用DEPC处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳，电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和梳子清洗干净，DEPC水配制的75%乙醇擦拭，最后用DEPC处理的水冲洗干净。
RNA提取相关试剂——DEPC和TRIS
DEPC焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC即diethypyrocarbonate，DEPC结构式中文名为。
分子式为C6H10O5，分子量为162.14。
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
DEPC 可以抑制植物细胞上的NSCC，即nonselective cation channel （非选择性阳离子通道）。
是常用的NSCC抑制剂.DEPC毒性1．DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 是一种高效烷化剂。
配置：加0.1% DEPC 到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃，20min，DEPC即降解成二氧化碳和水无毒。
2．DEPC有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。
3．DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。
DEPC水泡过一次枪头后还能再用吗?是否每次都要重配？答：不能再用。
每次处理耗材时都要用新配的。
DEPC水用于配制电泳缓冲液和溶解RNA.DEPC在水中的半衰期25℃、磷酸缓冲液中其半衰期为4 min（pH 6）、9 min（pH 7）。
Tris缓冲液中DEPC的降解会加快，25℃时，半衰期为1.25 min（pH 7.5）、0.37 min（pH 8.2）。
DEPC加入到水中之后并不会立即溶解，而是形成小的球状液滴（类似于油滴），需要彻底搅拌直至液滴消失才算混合均匀。
此时的溶液才可以拿去高温除菌除DEPC。
一般灭菌15min即可将DEPC彻底除去。
（试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性）配制泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
提取RNA步骤
实验目的：提取动物组织RNA，备后续实验使用。
实验试剂：研钵、镊子、刮勺、冰盒、试管架、微量移液器、RNA无酶管、低温离心机、酒精、液氮、Takara RNA提取试剂盒、去除DNA试剂盒冰袋实验步骤：1、实验准备:研钵中加入少量酒精，点燃，灭菌后，超净台灭菌30min（包括研钵、镊子、刮勺、试管架、微量移液器、RNA无酶管）。
2、取液氮、冰袋备、冰盒备用3、将研钵预冷，其中大研钵的可以放在冰袋上，然后再倒入液氮，小研钵直接倒入少量液氮预冷。
4、将超低温冻结的RNA 提取样品，剪取绿豆到黄豆大小组织(不能太大,不要大于黄豆大小），迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量)。
可用刮勺将其刮到一团。
5、可以向4的研钵中加入适量的含有裂解液的Buffer RL,(大约700ul)，确保研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置（研钵倾斜放置），直至样品完全融化后用枪头吹打混匀,只至液体中无明显沉淀。
这期间可以研磨下一组织.6、将步骤5中的匀浆液转移至1。
5mlRNA无酶管中，12,000 rpm，4℃离心5 分钟。
期间配置70％乙醇(7份无水乙醇+3份水（为试剂盒中的RNA无酶水)）7、小心吸取6步骤上清液（吸取400ul即可），移入1。
5ml的RNase Free collection（切勿吸取沉淀，否则会阻塞后面的膜）。
然后向其中加入等体积的70％乙醇，此时可见沉淀，立即摇匀。
8、将7中的混合液，取600ul（要小于600ul)到RNA spin column （含2ml collection Tube）中，12，000 rpm，4℃离心 1 分钟,弃滤液。
将RNA spin column 放到2ml collection Tube 管中。
9、将500ul buffer RWA加入至RNA spin column 12，000 rpm，4℃离心30s，弃滤液。
RNA提取中的原理
氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。
DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA 进入水相。
但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。
不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。
所以不要剧烈震荡。
异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。
氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。
异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。
Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。
而且DNA 在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。
醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。
l楼主问的问题，我的个人理解是：前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。
RNA方法-异硫氰酸胍法
用异硫氰酸胍法提取RNA一、试剂配制1.变性液buffer（灭菌100ml DEPC水）1.1 柠檬酸钠：0.75Mbuffer 22.06g将柠檬酸钠加入超纯水中，待完全溶解，用HCI调节pH值至7.0。
加ddH2O定容到100 mL1.2 十二烷基肌氨酸钠buffer：10% 10g0.1%DEPC水配制以后，高温高压灭菌。
2.变性液（500ml 现配）0.75mol/L柠檬酸钠buffer 17.6ml10 %十二烷基肌氨酸钠26.4ml异硫氰酸胍250gPVP（2%m/v）10gBeta-巯基乙醇1ml3. 0.1%的DEPC水（v/v）搅拌（4h以上）混匀，高温灭菌4. DEPC水处理的（配制）的75%乙醇（瓶子需要处理，灭菌）500ml 0.1%DEPC灭菌水：无水乙醇 = 100ml:300ml5 氯仿：异戊醇（24:1）（瓶子需要处理，灭菌）500ml 氯仿：异戊醇 = 480ml：20ml将氯仿和异戊醇混匀，入瓶封装。
-20℃保存6 2M醋酸钠（pH4.5）70ml醋酸钠·3H20： 19g DEPC H2O： 40ml 冰醋酸将醋酸钠完全溶解于ddH2O中，用冰醋酸调pH值至4.5，加ddH2O至70ml，搅拌过夜，高温高压灭菌所用的氯仿、乙醇、异丙醇都应该是未开封的。
准备枪头：1ml 100ul离心管：2ml 1.5ml 0.5ml瓶子：二、植物RNA提取操作规程1．取1-2g左右新鲜植物样品置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2. 将粉末（0.15-0.10g）移入预冷的离心管中，加入裂解液1 ml 混匀，涡旋5min（1）3. 加入100 ul2M 醋酸钠（PH4.5），混匀，4℃条件下，12000r，离心15 min，取上清液900 ul。
（2）4．加入900μL氯仿：异戊醇，涡旋10-15min，冰浴15-30 min，4℃条件下，12000 r，离心10 min。
RNA提取步骤_cell
RNA的提取1.试验所用试剂的配制(1)含0.1%DEPC(二乙基焦磷酸酰胺)的灭菌水<实验过程中用>0.1mlDEPC+99.9mlddH2O<瓶子事先用0.01%DEPC水浸泡2-3d灭菌后可用>。
配好后灭菌，高压灭菌的目的是使DEPC分解，未分解的DEPC会影响后面的实验。
所以需要放在通风厨中挥发至少3小时，一般都要放置过夜。
用1.5ml的进口去RNA酶的doff管分装该DEPC水，置-20度储存，需要实验的人可以领取一支，使用后放置自己的-20度中下次可以继续使用，只需要注意使用的时候都用去RNA酶的枪头及相关的注意操作即可。
(2)0.01%DEPC的灭菌水。
<用于浸泡瓶子器材等除去Rnase用>(3)琼脂糖凝胶电泳所用试剂配制与准备①0.5mol/L PH=8.0的EDTA溶液将37.2g EDTA-Na加入160ml的蒸馏水中，于搅拌器上剧烈搅拌。
再用NaOH调其PH值至8.0(约需4g NaOH)。
之后用蒸馏水定容至200ml，后送至高压灭菌，室温保存。
②50×TAE溶液在400ml蒸馏水中溶解121g Tris,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5mol/L PH=8.0的EDTA 溶液，加水定容至500ml，室温保存。
③溴化乙锭(EB) (10mg/ml)在20ml水中加入0.2g EB,磁力搅拌，然后用铝箔包裹容器或将溶液移至棕色瓶中，室温保存。
④RNA电泳 loading buf. (一般为6×)2.实验过程(1)细胞种板：按相应细胞密度种板及处理，可以参考WB中的相关方法。
(2)mRNA提取：（所有试剂和耗材都需要RNA-free，一般认为氯仿等试剂新开瓶的都是RNA-free的，所以可以作为专属RNA用做好标记）①去细胞培养液用预冷的PBS洗1次，一般常用六孔板，每孔加入Trizol 300ul-500 ul,用RNA-free的枪头,吹打细胞数次,并转移到1.5mlEP管中室温孵育5min（此时的EP 管不一定需要RNA-free，可以是普通的EP管，但用于吸取液体的枪头一定要是RNA-free 的）。
Trizol法提取RNA
Trizol 法提取RNA实验步骤一、需要的试剂：1.氯仿2.异丙醇3.75%乙醇（in DEPC-treated water)4.RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000×g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 ×g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 ×g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
RNA提取方法
RNA 提取方法（TRIzol法）一、试剂和耗材准备1、Trizol试剂、异丙醇、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）、0.1%DEPC水、消毒用酒精。
2、1.5mlEP管、各种大小的枪头、剪刀、镊子、研钵、锡箔纸、保温瓶（装液氮）等（塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡或高压灭菌法）；手套、口罩3、0.1%DEPC水：100ml dd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37℃孵育12h以上，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。
二、操作步骤1.样品处理（1）组织：50-100mg组织中加入1ml Trizol试剂。
（2）单层细胞：加入Tizol试剂1ml/cm2平板。
（3）悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。
每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1 ml Tizol试剂。
2.将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。
3.加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。
4.于2-8℃，不超过12000g离心15min。
离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。
5.取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。
6.于2-8℃，不超过12000g离心10min后弃去上清。
7.向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。
8.于2-8℃，不超过7500g离心5min后弃上清9.晾干RNA样品，加入适量DEPC水溶解。
10.测量浓度和比值。
三、RNA电泳1、将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。
2、配制琼脂糖凝胶（1）称取0.6g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入0.5X TAE缓冲液40ml，微波炉内加热至沸腾使琼脂糖彻底溶化均匀。
（2）加入核酸染料4微升，待冷却至60℃左右，倒入制胶用具。
3、样品准备四、注意问题1、在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60- -70℃保存至少一个月。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS （溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg 组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。
弃上清，收集白细胞沉淀。
每1ml 血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%⼄醇（in DEPC-treated water)RNase free⽔或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的⽔，将其装⼊不含RNase的玻璃瓶中，加⼊diethylpyrocarbonate (DEPC 是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后⾼压灭菌。
0.5% SDS溶液必须⽤DEPC预处理、⾼压灭菌的⽔]1、组织匀浆(1) 取出⾼温⾼压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒⼊液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加⼊1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋⽩复合体。
2、相分离加⼊0.2 ml的氯仿，加盖好后⽤⼿剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离⼼12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离⼼后分成三层，下⾯的红⾊为酚-氯仿相，⼀个中间层，⼀⾯是⽆⾊的⽔相。
RNA 只存在于⽔相中。
⽔相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层⽔相转移到另⼀⼲净的EP管中，加⼊0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离⼼12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。
离⼼前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加⼊1ml 75%⼄醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离⼼7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空⽓中5-10分钟，⼲燥RNA沉淀，（不能在真空中离⼼⼲燥）。
RNA提取步骤
RNA提取：用TaKaRa RNAiso Reagent试剂提取RNA步骤(1).试剂盒之外所需准备试剂：◆氯仿◆异丙醇◆ 75%乙醇（DEPC 处理水配制）◆ RNase-free 水（制备方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC 至终浓度 0.01%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。
(2).尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
a）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理 12 小时。
b）然后在120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。
RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
(3) 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 分钟）或使用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。
RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
实验操作1. RNAiso Reagent 的使用量情况如下。
2. 实验样品的研磨和匀浆。
A. 贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS 清洗一次。
②每10 cm2生长的培养细胞中加入 2 ml的RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。
③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置 5 分钟。
B. 悬浮培养细胞①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心 2 分钟，弃上清。
②向每5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。
③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温静置 5 分钟。
C. 动物组织、植物材料样品①将超低温冻结的 RNA 提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量）。
使用天根试剂盒提取样品RNA
使⽤天根试剂盒提取样品RNA需提取14个样品RNA，全部⼯作流程如下：前期准备⼯作：1.分别清洗14个研钵、研磨棒、⾦属勺⼦，清洗完成后⽤卫⽣纸擦⼲，随后⽤锡纸将研钵、研磨棒、勺⼦包住并，并灭菌备⽤；2.装⼀盒蓝枪头（1000µ），⼀盒黄枪头（200µ），⼀盒⽩枪头（10µ），并⽤报纸包裹住，灭菌备⽤；3.带上锡纸，装液氮，在⽥间取样后⽴刻⽤锡纸包裹住样品，并置于液氮中备⽤；RNA的提取：1.将样品置于研钵中，倒⼊液氮（可⽤纸杯分装液氮），⽤研磨棒将样品研磨成粉末状，取研磨后的粉末加⼊600µ裂解液SG和10µProteinase K，⽴即涡旋剧烈震荡混匀，混匀后室温放置5min；2.12000 rpm离⼼2min，取约500µ上清进⾏以下操作注意：枪头尽量不要触碰到沉淀底部，以免吸到杂质3.将得到的上清加⼊基因组DNA去除柱中，12000rpm离⼼30s，保留滤液；4.向上述滤液中缓慢加⼊0.5倍上清体积的⽆⽔⼄醇（约250µ），混匀，得到的溶液和沉淀⼀起转⼊RNase—Free吸附柱CR4中（吸附柱放在收集管中），12000 rpm离⼼30S，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；5.不进⾏DNase Ⅰ消化，直接向RNase—Free吸附柱CR4中加⼊700µ去蛋⽩液RW3，12000 rpm 离⼼30S，弃废液，将吸附柱放回收集管中；6.向RNase—Free吸附柱CR4中加⼊500µ漂洗液RW，漂洗液RW在使⽤前需要加⼊⽆⽔⼄醇，室温静置2min，12000 rpm 离⼼30-60S，弃废液，将吸附柱放回收集管中；7.重复步骤6；8.12000 rpm 离⼼2min，倒掉废液。
将RNase—Free吸附柱CR4置于室温放置2min，以彻底晾⼲吸附材料中残余的漂洗液（注意：此步骤⽬的是将RNase —Free吸附柱CR4中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
TRIzol-法提取血液总RNA
TRIzol 法提取血液总RNA
一、所需试剂、耗材
1. 0.1% DEPC-DDW;
2. 5ml, 2ml, 1.5ml灭菌离心管；
3. TRIzol；
4. 氯仿；
5. 异丙醇；
6. RNase-free water；
7. 70% DEPC-EtOH;
8. 检测用胶盒等
二、操作步骤
1. 取经过DEPC-DDW泡过，且灭菌烘干的7 ml 离心管；
2. 在0.5 ml小鼠全血（4C）中加入3 ml的TRIzol，震荡摇匀，室温静置5 min；
3. 将上述混合液体转移到灭菌的2 ml离心管中，12000 rpm 4℃离心5 min；
4. 将上清液移至新的1.5 mL离心管中；
5. 加入0.2 ml的氯仿，震荡摇均匀，室温静置5 min；
6. 12000 rpm 4℃离心15 min；
7. 将上清液移至新的1.5 ml离心管中，加入等体积-20C预冷的异丙醇，
-20C静置10 min；
8. 12000 rpm 4℃离心10 min；
9. 向沉淀中加入1 ml 70% DEPC-EtOH清洗沉淀;
10. 12000 rpm 4℃离心15 min;
11. 弃上清液保留沉淀，室温干燥10 min；
12. 加入30 μl RNase-free DDW 溶解RNA沉淀；
13. OD值检测（OD260/OD280=1.8-2.0）以及1% agrose gel检测（5ul）；
14. -80℃保存。
28S
18S
5.8S。
RNA提取操作
RNA的提取：准备：1. 预定台式低温离心机。
2. 检查是否有足够的冰。
3. 处理实验中用到的枪头、离心管（灭菌）4. 检查所有试剂的质量。
5. 剪子、镊子、酒精灯、注射器。
第二天：1.预冷离心机，取一盒冰。
2.在匀浆器中加入1ml的Trizol置于冰上预冷。
3.剪取100mg组织或采集血细胞（5500s 离心3－4分钟，弃上清。
）用枪头打匀至无块状组织为止。
4.将1.0ml的匀浆液转移至1.5ml的离心管中，室温放置5分钟。
5.加入0.2ml 的氯仿，用力震荡30秒，室温放置5分钟。
6.与4℃、12000g离心15分钟。
7.取上清500μl，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上放置10分钟。
8.12000g离心10分钟。
9.用1.0ml的75％的乙醇洗涤RNA沉淀2次。
每次于4℃，7500g离心5分钟。
10.干燥RNA沉淀，加入50ulRNA水溶解。
注意：1.干燥RNA：RNA沉淀离心后，用抢头吸去残留的酒精，然后于超净工作台10min即可，然后加水。
加水中如有不溶透明胶状物可适当补加水即可。
2.Trizol中的组织匀浆液可在－70℃保存1个月再进行后续操作。
3.RNA沉淀可于75％乙醇中保存一周（4℃）至一年以上（－20℃）再离心用。
用M－MLV反转录cDNA一链：step1：变性：1．在0.2ml的PCR管中加入：Total RNA 8OligodT 2.5 μl2. 70℃热变性5分钟，然后置于冰上2分钟。
3. 稍离心收集primer－RNA产物。
Step2：反转录：1.在0.2的PCR管中加入：M－MLV后转录Buffer （5×） 5 μlRNase－free的dNTP （2.5m/M each）5 μlRnase E 抑制剂 0.5M－MLV反转录 E 1μl （200U）RNase－free water 32.稍离心。
3.42℃反转录1小时。
4.65℃灭活反转录酶10分钟。
注：1. 反转录一定要在RNase－free 及RNase－free的PCR管中进行。
RNA提取操作要领
RNA提取实验材料实验耗材：1.5ml灭菌EP管、去RNA酶枪头、、高速低温离心机试剂：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、DEPC水、无水乙醇实验步骤：1.对于培养细胞样品：贴壁细胞：1)去除培养液，加PBS清洗，按照6孔板每孔加入500μl Trizol细胞裂解液，移液枪反复吹打至细胞完全脱落后，将细胞裂解液转移至1.5ml 去RNA EP管中（可置-80℃保存）；2)每管加入100μl氯仿（三氯甲烷），轻柔的上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，置12000转4℃离心15分钟；小心取出EP管，可清楚看到管内3分层，从上到下依次为：上层无色透明液体（RNA层）、中层白色沉淀（脂质层）、下层粉红色油状液体（苯酚-氯仿层）；3)尽可能多的取出上层无色透明液体（200~300μl）至一新的1.5ml EP管中，若取出沉淀，需重新离心再取；4)每管加入等体积异丙醇，振荡、混匀，4℃静置10分钟。
12000转4℃离心10分钟，取出EP管可见下层白色沉淀，弃上清液；5)加入500μl 75%无水乙醇（无水乙醇与DEPC水，现配现用），上下颠倒、摇晃EP管至白色沉淀漂浮，7500转4℃离心5分钟，弃上清，75%无水乙醇重复清洗一次。
弃上清，瞬时离心数秒，移液枪小心去除多余上清液，打开EP管盖置超净台风干；6)至管内白色沉淀消失完全，加20-50μl DEPC水，轻轻振荡溶解RNA。
置-80℃保存一段时间后，用NanoDrop2000测样品RNA浓度，加适量DEPC水稀释RNA至200或500ng/μl。
2.悬浮细胞：2000rpm离心3min收集细胞，去上清，加入PBS洗1次，离心去除PBS(尽量去除干净)，加入相应量的Trizol试剂吹打混匀。
其他步骤同贴壁细胞RNA 提取操作。
3.组织样本：取50~100mg的组织加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol 先放于冰上）。
其余步骤同贴壁细胞RNA提取操作。
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1. RNA提取所需的试剂枪头玻璃器皿EP管的灭菌方法：
试剂：无酶水、氯仿：异戊醇（25:24）、75%乙醇、
（1）无酶水（DEPG水）的灭菌方法：取DEPC 1mL,加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静置，然后高温高压灭菌（121℃，30min），以降解除去DEPC。
（2）氯仿、异戊醇：用新开的，现配现用。
（3）75%乙醇：用无酶水（DEPG水）进行配制：现用现配，就在1.5mL离心管里将高压好的DEPC水加到乙醇里；取95%乙醇0.75ml，加DEPG水0.2ml，所得的浓度即为（95%×0.75）/（0.75+0.2）=75%。
（4）离心管、枪头的灭菌：用0.1%DEPC水在37℃泡枪头、离心管24小时，倒出DEPC水，80℃干燥枪头和离心管，湿热高压灭菌（121℃、30min）。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22um滤膜过滤除菌。
所有的玻璃、陶瓷和铁器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。
配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。
另外操作过程中应戴手套。
2. 聚乙二醇（PEG）的灭菌：118度12min湿热灭菌
附：DEPC是焦碳酸二乙酯的简称，它是一种强烈但不彻底的RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需
小心。
DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT[二硫苏糖醇（强还原剂）]的试剂不能用DEPC处理。