川西獐牙菜多糖的提取及含量测定

西南民族大学学报·自然科学版第33卷第1期Journal of Southwest University for Nationalities ⋅Natural Science Edition Feb.2007______________________________________________________________________________________________收稿日期：2006-09-05作者简介：李磊(1968-), 男, 青海民族学院副教授.文章编号：1003-2843(2007)01-0052-04川西獐牙菜多糖的提取及含量测定李磊(青海民族学院化学系, 青海西宁 810007)摘 要：对川西獐牙菜中多糖进行提取及含量测定; 通过正交实验确定提取多糖的优化条件, 用分光光度法测定多糖的含量; 川西獐牙菜多糖提取的最佳条件是：料液比为1:10、提取时间为2.0h 、提取次数为4次、温度90℃. 并测得川西獐牙菜中多糖含量为41.60mg/g, 回收率为 99%, RSD= 1.2% 结论 该方法简便, 快速, 准确, 适用于药材中多糖的含量测定.关键词：川西獐牙菜; 多糖; 正交实验; 含量测定 中图分类号: O6-332, O657.3 文献标识码：A藏药川西獐牙菜(Swertia mussotii Ftanch ）为龙胆科植物獐牙菜属植物, 藏药名为“蒂达”, 主要分布在西藏、四川、以及青海省的海西、海北、黄南、果洛、玉树等海拔3600-3800米高寒地区, 一年生草本植物, 全草入药, 亦称“藏茵陈”. 该类植物性寒、味苦、具有清热利湿、舒肝利胆之功效, 多用于消化不良、骨髓炎及各型肝、胆系统疾病的治疗. 川西獐牙菜中主要含三萜类、酮类、芒果甙、龙胆苦甙、獐牙菜苦甙、多糖等成分. 这些化合物都具有多种生理活性, 如龙胆苦甙具有促进胃液分泌、抗原虫和抗炎作用. 由于多糖是多种中草药的有效成分之一, 随着对多糖药理学研究的深入, 发现多糖对抗衰老、抗溃疡、抗肿瘤、降血糖血脂等有显著疗效[1,2], 国内对植物多糖的研究也逐渐增多[3-5]. 有关川西獐牙菜中多糖的提取及含量测定的文章还未见报道, 因此本文将主要研究川西獐牙菜中多糖的提取及含量测定.1 仪器与试药1.1 仪器HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司); 721型分光光度计(上海第三仪器厂); SHZ-95型循环式多用真空泵(郑州长城工贸有限公司); CS101-1型真空干燥箱(重庆实验设备厂制造); T6328A 型光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂); FQ102S 型微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司）.1.2 试剂石油醚(AR ）, 乙醇(AR ）, 苯酚(AR ）, 丙酮(AR ）, 乙醚(AR ）, 浓硫酸(AR ）, 葡萄糖(对照品）. 1.3 样品川西獐牙菜：产于青海省.2 方法与结果2.1 川西獐牙菜多糖的提取与精制取已经干燥的川西獐牙菜适量, 粉碎过筛后, 精密称取样品粉末5克置提取装置中, 先以石油醚(60℃-90℃)回流除去脂类(1h), 药渣挥去溶剂后, 再以80%的乙醇提取(3h)以除去单糖、低聚糖等干扰成分, 最后用水提取多糖, 提取液在50℃经减压浓缩至原体积的1/3, 浓缩后水溶液中加入3-5倍量的95%乙醇, 静置过夜, 抽滤, 沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤多次, 60℃烘干至恒重, 即得川西獐牙菜多糖.第1期 以1: 10为料液比, 根据药材性质和生产实际要求, 拟定影响浸出效果的3个主要因素A(水浴温度); B(提取时间); C(提取次数)为优选因素, 每个因素3个水平进行L 9(33)正交实验(见表1、2).表1 正交试验因素水平表水 平 水浴温度(℃)A 提取时间(h)B 提取次数C 1 2 350 70 901.02.03.02 3 4由表2直观分析可知, 8号实验结果最好, 对应的优化组合为A 3B 2C 1; 由极差R 分析可知, 多糖提取条件因素的主次顺序为A>B>C, 即温度>提取时间>提取次数. 而由正交条件的均匀可比性得知, 各因素的好水平组合起来就是最优水平组合, 即 A 3B 2C 3. 综合优选, 进行实验验证, 结果A 3B 2C 3条件下提取的多糖含量最高为 41.60mg/g. 故最优条件是：料液比为1︰10、温度为 90℃、提取时间为2h 、提取次数为4次.表2 川西獐牙菜多糖提取L 9(33)正交实验实验号 A BC 多糖含量 (mg/g)1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R1 1 12 2 23 3 340.152.21 103.59 13.37 17.40 34.53 21.161 2 3 1 2 3 1 2 3 66.21 71.84 57.85 22.07 23.95 19.28 4.671 2 3 2 3 1 3 1 2 64.48 60.68 70.74 21.49 20.23 23.58 3.359.02 14.64 16.44 19.91 17.02 15.28 37.28 40.18 26.132. 2 川西獐牙菜多糖含量的测定 2. 2. 1 测定原理本文采用苯酚——硫酸法测定多糖的含量. 多糖在浓硫酸作用下, 先水解成单糖, 并迅速脱水生成糠醛衍生物, 然后和苯酚缩合成有色化合物, 用分光光度法测定 2. 2. 2 标准曲线的测定2. 2 .2. 1葡萄糖标准溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg, 加入适量蒸馏水溶解, 转移到100 mL 的容量瓶中加水至刻度, 摇匀, 配成浓度为1 mg/mL 标准葡萄糖溶液备用. 2. 2. 2. 2苯酚溶液的制备取苯酚100 g, 加铝片0.1 g 和NaHCO 3 0.05 g, 蒸馏收集172℃馏分(常压蒸馏,空气冷凝)白色针状苯酚结晶. 称取13.33g 馏分水溶解后, 置于200 mL 棕色容量瓶中, 用水稀释至刻度. 2. 2. 2. 3 测定波长的选择精密吸取葡萄糖标准液0.60 mL 置10 mL 容量瓶中, 加水补足2 mL, 用标准曲线的测定方法显色后, 以试西南民族大学学报·自然科学版剂空白为参比, 从370-520 nm每隔5 nm测定一次吸光度, 结果测得在425 nm处吸光度最大, 所以选择测定波长为425 nm.2. 2. 2. 4 标准曲线的绘制精密吸取0.1mL, 0.2 mL, 0.3mL, 0.4 mL, 0.5mL, 0.6 mL, 0.8 mL的葡萄糖标准溶液分别置于7个10 mL容量瓶中, 加水补足2 mL, 加入苯酚溶液1mL, 然后迅速加入5 mL的H2SO4, 摇匀后, 放置5 min, 置沸水浴中加热15 min, 取出后冷却至室温, 并用蒸馏水稀释至刻度; 另取2 mL蒸馏水, 加苯酚和浓硫酸同上操作为参比, 于425 nm处测定其吸光度, 求得回归方程为：y=9.3041x+0.0494; 相关系数r=0.9998.2. 3 换算因子的测定精密称取60℃干燥至恒重的川西獐牙菜多糖10 mg, 置25 mL的容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀. 精密吸取此液2.0 mL, 按标准曲线项下方法操作, 测定吸光度, 从回归方程中求得多糖供试液中葡萄糖浓度. 利用公式f=W/(C×D)计算换算因子. 式中W为多糖的质量(mg), C为多糖液中葡萄糖的浓度(mg/mL), D为多糖的稀释倍数. 测得f =1.66.2. 4 稳定性测定取样品液适量, 显色后每隔1 h测一次吸光度, 共6次, 结果见表3.表3 稳定性测定结果时间 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 5.0 h 6.0 h吸光度0.499 0.499 0.499 0.460 0.451 0.443 由此可知, 在1.0-3.0h内稳定性良好.2. 5 加标回收率测定精密吸取1 mL样品液分别置于5个10 mL的容量瓶中, 分别加入精密吸取0.3 mL, 0.45 mL, 0.55 mL, 0.6 mL, 0.65 mL,葡萄糖标准溶液加水补足2 mL, 按标准曲线项下方法测定, 结果见表4.表4 回收率测定结果加入标准量(mg) 测得量(mg) 回收率% RSD(%)0.3 0.45 0.55 0.60 0.65 0.2900.4420.5400.5920.62497989899961.22. 6 精密度试验同批样品, 重复测定6次, RSD%= 0.42%.2. 7 样品含量测定精密吸取样品液1.0 mL于容量瓶中, 照样品标准曲线项下方法操作, 测定吸光度, 利用回归方程求得供试液中葡萄糖的浓度, 按下式计算样品中多糖的含量：多糖含量=C×D×f/W=41.60 mg/g式中C为供试液中葡萄糖浓度(mg/mL); D为供试液的稀释因素; f为换算因子; W为供试品质量(g).3 结果与讨论本文所采用的L9(33)正交试验方法, 以水提取川西獐牙菜中的多糖; 川西獐牙菜多糖提取的最佳工艺参数为：料液比为1：10、温度为90℃、提取时间为2.0 h、提取次数为4次. 在此条件下, 川西獐牙菜中多糖含量最高达到41.60 mg/g. 由此可知, 在此试验中, 温度为主要因素.该方法结果准确, 操作简便可靠, 稳定性良好. 试验结果表明, 川西獐牙菜样品中含有一定量的多糖, 其种类和结构还需进一步研究.第1期参考文献：[1] 田庚元, 冯宇澄, 林颍. 植物多糖的研究进展[J]. 中国中药杂志, 1995, 20(7): 441.[2] WEI WS, TAN JQ,GUO F, et al .effect of coriolus versicolor polysaccharose on superoxide dismutase activities in mice[J]. Actapharmacol Sin, 1996, 17(2): 174.[3] 刘金荣, 江发寿. 独尾草多糖的超声提取及含量测定[J]. 中草药, 2002, 33(4): 322-323.[4] 李平, 王艳辉, 马润宇. 碱提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究[J]. 中草药, 2003, 34(11): 973-976.[5] 王东, 林力, 袁昌鲁, 等. 车前子多糖含量的分析[J]. 中草药, 2002, 33(10): 896-897.Extraction and measurement of the polysaccharidesfrom swertia mussotii franchLI Lei( Dept. of Chemistry, Qinghai College for Minorities, Xining 810007, P. R. C. )Abstract: To extract and determine the volume of polysaccharides from swertia mussotii franch, the optimal condition is determined by the orthayonal experiment, and volume of polysaccharides is measured by spectrophotometry. Experiment reveals that optimal condition for extraction is as follows: temperature: 90℃; duration: 2 hours; times: 4 times; ratio: 1:10(w/v).The volume of polysaccharides in swertia mussotii franch is 41.60mg/g. The method can be easily operated and its result is very accurate.Key words : swertia mussotii franch; polysaccharide; extraction; spectrophotometry。