流感病毒实验室PCR检测技术ppt课件
《流感病毒全基因组测序技术》医学课件
可变性
流感病毒的可变性使得疫 苗研发和流行病学调查面 临挑战。
流感病毒全基因组测序的步骤和方法
1
样本采集
从患者样本或动物标本中采集流感病毒RNA。
2
RNA提取
从样本中提取流感序技术进行流感病毒全基因组测序。
4
数据分析
对测序数据进行生物信息学分析，包括序列比对和变异分析。
结论和总结
《流感病毒全基因组测序技术》是一项强大的医学工具，可以帮助我们更好地了解流感病毒的演化、传 播和变异。随着技术的进步，全基因组测序将在流感研究和公共卫生领域发挥更重要的作用。
《流感病毒全基因组测序技术》 医学课件
欢迎来到《流感病毒全基因组测序技术》医学课件。在本课程中，我们将探 索流感病毒全基因组测序的介绍、步骤、医学意义和未来发展方向。
流感病毒的分类和特点
分类
流感病毒被分为A、B和C 三种类型，每种都具有不 同的亚型和毒株。
特点
流感病毒具有高突变率、 易传播和致病性强的特点， 使其成为全球关注的疾病。
应用流感病毒全基因组测序的 医学意义
1 追踪病毒演化
2 疫苗开发
通过全基因组测序，可追踪 流感病毒的演化路径和变异。
全基因组测序为疫苗研发提 供信息，帮助识别病毒株和 选择适当的疫苗组分。
3 流行病学研究
基因组数据可用于流感传播模式研究和流行病学调查。
流感病毒全基因组测序的挑战和限制
高成本
全基因组测序技术相对昂贵， 限制了其在临床和流行病学 实践中的应用。
技术复杂性
全基因组测序需要高度专业 化的实验室设备和熟练的操 作技术。
分析难度
处理和分析大规模的测序数 据是一项具有挑战性的任务。
未来发展方向
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green 法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
一、实时荧光定量PCR原理：1、SYBR Green法：SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。
2、TaqMan法：在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq 酶的5‘→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。
3、分子信标法：探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。
流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。
流感病毒RNA荧光RT(PCR检测技术)-
流感病毒RNA荧光RT（PCR检测技术）-流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。
通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。
最后，根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBR Green法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
1。
实时荧光定量聚合酶链反应原理:1。
SYBR Green方法:SYBR Green是一种双链DNA结合染料，在自由状态下不发光，当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。
它的强度与双链DNA 的数量有关。
随着扩增产物数量的增加，检测到的荧光信号增加。
2，TaqMan方法:在扩增反应液中加入特异性探针，探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，当探针完成时，两个基团的位置接近，5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时未检测到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时，发生链置换。
Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。
5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离，并且可以检测荧光信号。
在每个聚合酶链反应循环之后，荧光信号也有一个同步生长过程，就像扩增产物一样3.分子信标法:将探针设计成发夹形的茎环。
环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。
两端的核苷酸序列互补形成茎。
一端用报道基团标记，另一端用淬灭基团标记。
当探针不与模板结合时，报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。
此时，无法检测到荧光信号。
与模板结合后，探针的构象由发夹状变为链状，报道基团和淬灭基团分离，并呈荧光核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法，即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。
流感病毒实验室PCR检测技术课件
流感病毒实验室PCR检测技术课件流感病毒实验室PCR检测技术课件一、引言流感病毒是一种引起呼吸道传染病的病毒，每年都会在全球范围内流行。
为了及时诊断和治疗流感病毒感染，实验室PCR检测技术得到了广泛应用。
本文将详细介绍流感病毒实验室PCR检测技术的原理、操作步骤、优点以及实验结果的分析方法。
二、流感病毒的基础知识流感病毒是一种负链RNA病毒，分为A、B、C三种主要类型。
其中，A型病毒变异能力强，易引起大规模流行。
流感病毒的主要传播途径是飞沫和接触传播，症状包括发热、咳嗽、喉咙痛等。
三、PCR检测技术的原理、过程和优点PCR检测技术是一种通过体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
在流感病毒检测中，PCR技术利用特定的引物和探针，通过高温变性、低温退火和适温延伸等步骤，扩增病毒的核酸片段。
该技术的优点包括高特异性、高灵敏度、操作简便、快速等。
四、实验步骤及注意事项1.采集样品：使用拭子采集咽拭子、鼻拭子等样品，迅速放入保存液中。
2.样品处理：将采集的样品进行裂解、提取核酸。
3.PCR反应：根据不同类型的流感病毒，设计特定的引物和探针，加入到PCR反应液中。
4.扩增和检测：通过实时荧光PCR技术，监测核酸扩增过程，判断病毒是否存在。
5.注意事项：确保实验室安全，避免交叉感染；严格遵循实验操作规程；注意样品处理和PCR反应的条件。
五、实验结果及分析PCR实验结果以Ct值的形式呈现，Ct值较低表示病毒核酸含量较高。
根据Ct值大小，可以判断病毒载量。
同时，根据不同类型流感病毒的特异性引物和探针，可以判断病毒的种类。
结合临床症状和实验室结果，可以对流感病毒感染进行诊断和治疗。
六、结论实验室PCR检测技术是一种快速、特异、灵敏的流感病毒检测方法。
通过采集患者呼吸道样品，利用PCR技术扩增病毒核酸片段，可以及时诊断流感病毒感染，为临床提供重要参考。
此外，该技术还可以监测病毒载量，评估治疗效果，为制定抗病毒治疗方案提供依据。
PCR详细讲解PPT课件
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CHENLI
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引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
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引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
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退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
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低温退火
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中温延伸
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• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
流感病毒实验室PCR检测技术课件
根据流感病毒基因组的特点，设计特 异性引物，用于扩增病毒基因片段。
引物选择
选择高特异性、高灵敏度的引物，确 保PCR检测的准确性。
反应体系与反应条件
反应体系
根据所选引物和试剂盒的要求，建立适当的PCR反应体系。
反应条件
设置PCR反应的温度循环条件，包增数百万至数十 亿倍的DNA片段。
应用广泛
在遗传病诊断、基因克隆、流 行病学调查等领域广泛应用。
03
流感病毒的PCR检测方法
样本采集和处理
样本采集
采集疑似流感病毒感染者的咽拭 子、鼻拭子或支气管灌洗液等样 本。
样本处理
将采集的样本进行灭活处理，以 去除病毒活性，同时提取病毒核 酸。
引物设计与选择
产物检测
采用凝胶电泳或荧光定量PCR等方法检测扩增产物。
结果分析
对扩增产物进行分析，判断是否存在流感病毒核酸，并对其序列进行比对，以 确定病毒的亚型。
04
实验操作注意事项
实验前的准备事项
01
02
03
实验人员资质
确保实验人员具备PCR检 测技术资质，熟悉实验操 作流程和注意事项。
实验器材准备
根据实验需求，准备足够 的PCR仪、扩增管、吸头 、缓冲液等实验器材，确 保其性能良好。
流感病毒实验室PCR检测技 术课件
汇报人：
202X-12-25
• 流感病毒概述 • PCR技术原理 • 流感病毒的PCR检测方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果解读与报告
01
流感病毒概述
流感病毒的特性
流感病毒属于正粘病毒科，是一种有 包膜的RNA病毒。
根据核蛋白和基质蛋白的不同，流感 病毒可分为A、B、C三型，其中A型 流感病毒经常发生变异，是引起大流 行的主要病毒。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
流感病毒实验室检测 PPT
鸡胚分离方法-试剂准备
鸡胚分离方法-标记鸡胚
鸡胚分离方法
■ 接种病毒方法
◆ 单腔接种
盲种
◆双腔接种
灯下接种
开窗接种
鸡胚分离流程（1）
◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚
◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 ◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至 ½ 寸，将另外100 µl标本 注入鸡胚尿囊腔
咽拭子采集
• 咽拭子
•
用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的
塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，
将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾
部弃去，旋紧管盖。
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
• 未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存， 一周内送实验室
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本
后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。
• 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于
MDCK细胞病毒分离
CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关
PCR检测技术ppt课件
.
变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为 新一轮循环的模板，经过25~40个循环后DNA可
.
三、PCR的基本操作 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析
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PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
.
半保留复制
.
2、三个基本的步骤循环
①变性 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原 则互补结合，也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要 的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
开离心管时动作要轻，以防管内液体 溅出。
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
.
核酸提取方法
流感病毒实验室检测PPT课件
• 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保 持低温。
荧光定量PCR
• 反应体系和条件
• 试剂：Invitrogen SuperScript® III Platinum® One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen， 货号：11732-020或11745-100）
检测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
核酸检测
• 核酸提取- QIAamp® Viral RNA Mini Kit • 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 ％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 • 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 • 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。
鸡胚分离流程（3）
■
收获尿囊液和羊水
■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放臵4小时 ■标记15ml
流感的相关知识及实验室检测PPT课件
建议 关于如何提高我院流感检出率
A 组织培训，规范取材，保证送检标本质量 B 未检测送检标本应在4℃保存，防止RNA降解
致病性强 哺乳类动物（猪，鲸鱼， 马，海豹和猫）或禽类 都会被广泛感染 容易发生突发性变异， 从而引起普遍性流感， 世界性大流行
乙型 流感
以散在形式出现， 主要侵袭婴幼儿， 一般不引起流行。
甲型 流感
只 会 感 染 人 类 和 海豹 有 限 的 宿 主 导 致 不会发生重大突变， 呈局限性流行
因此对于高危人群，应在发病后尽早采 样，必要时可采用多部位、多次取样检 测,以提高流感病毒阳性检出率
参考文献 李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
检测方法的选择
有研究对流感病毒胶体金抗原快速检测法与核酸 PCR 法比较， 两者之间一致性较差。以咽拭子流感病毒核酸检测为标准， 流感病毒抗原快速检测法（胶体金法）的敏感性和特异性分 别为 27.6% 和 86.9%，其敏感性明显低于国内外文献报道的 水平（40%-85%）；
红细胞
适用范围
终浓度 （％） 孔底部形 状 孵育时间 细胞对照
鸡
流感和禽流 感病毒 0.5（1%）
U或V型
30min 细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状
火鸡
流感和禽 流感病毒
豚鼠 流感病毒
人O型血红 细胞 流感病毒
马 禽流感病毒
0.5 （ 1% ） 0.75（ 1.5%） 0.75（ 1.5%） 0.5（1%）
HA滴度<8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代 培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定
《PCR检测技术》课件
新一代测序技术的发展为PCR检测
高通量PCR技术的兴起
2
技术带来更大的应用空间和未来发 展前景。
高通量PCR技术的快速发展使得同
时检测多个目标序列成为可能，推
动了高效PCR检测的发展。
3
底物扩增技术的突破
底物扩增技术的不断改进和突破将
为PCR检测技术带来更高的灵敏度
微流控PCR技术的应用
4
和准确性。
PCR反应系统及反应体系的优化
1 优化引物设计
2 优化反应条件
选择合适的引物序列，确保其互补性和 特异性，提高PCR反应的选择性和灵敏 度。
调整反应液的温度、离子浓度和pH等 参数，提高PCR反应的效率和特异性。
3 采用热启动酶
4 控制反应体系污染
使用能在PCR反应开始前抑制活性的热 启动酶，避免非特异性扩增产物的形成。
犯罪学鉴定
DNA指纹技术利用PCR扩增特定DNA区域，通过分析DNA条带模式来确认个体的身份和亲缘 关系。
PCR检测技术的优势与局限
优势
• 高灵敏度 • 高特异性 • 快速便捷
局限
• 易受污染影响 • 需要已知序列的引物设计 • 难以扩增较长的DNA片段
PCR检测技术的发展和前景
1
新一代测序技术的兴起
PCR检测技术
PCR检测技术是一种广泛应用于生物医学领域的分子生物学方法，它通过放大 目标DNA片段，实现高灵敏度的检测和定量。本课件将带您深入了解PCR检测 技术的概述、反应原理、基本步骤，以及其在生物医学中的应用和发展前景。
PCR检测技术概述
W hat is PCR?
PCR（聚合酶链式反应）是一种体外放大DNA片段的技术，它能够在短时间内从极微量的 DNA模板放大到足够数量并进行检测。
流感病毒实验室检测概述.PPT文档共62页
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。—5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
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禽流感(H5N1)病毒的检测方法
抗原检测 核酸检测 抗体检测
•HI
病毒分离
•IFA •ELISA •胶体金
诊断快速；
•PCR
•MDD •NASBA
诊断快速； 特异度高； 灵敏度高； 得不到病毒；
•MN
•SRH
•细胞分 离 •鸡胚分 离
金标准； 病毒可用于其 它研究； 需要较严格的 实验条件；
特异度高； 无法进行早 期诊断；
临床样本收集的注意事项
操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护 采集标本要有一定力度 标本采集后应迅速至于冰上或者4℃以下保存，因为 流感病毒对热很敏感 标本管上写明：医院名称，标本号，患者姓名，性别， 采样日期 标本采集后4℃保存，尽量在24小时内送到实验室进 行检测，未能及时进行检测的 应放-70℃或以下保存， 放置4℃不应超过4天
其他检测方法
快速流感抗原检测 可以区分A 和B 型流感病毒，不能区分亚 型快速检测实验A 型流感阳性的病例符合 可能病例的标准 但由于和其它检测方法相比灵敏度较低， 因此，快速检测阴性结果可能是假阴性， 不能作为猪流感感染的最后诊断。
快诊方法的特点
操作简单 快速（＜30min） 教过容易判断和解释 无仪器设备需求，可用于疫情现场检测 FluA和FluB 不能进行亚型的鉴别
流感病毒实验室PCR检测技术
标本采集
应遵循标准的流感检测方案 应采集鼻拭子和/或咽拭子，和/或依据标 准操作来进行采集。对标本采集者应采取 适当的防护。 对于标本的处理、储存和运输应遵照流感 病毒A H5N1的操作指南来进行。
标本采集（一）
主要采集上呼吸道标本 鼻咽拭子：将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几 秒吸收分泌物。 口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃体部位，避免触及 舌部；迅速将棉签放入无菌、内装3-5ml样本运 送液及带垫圈的螺口塑料管中，在靠近顶端处折 断，旋紧管盖并密封。 气管分泌液：收集气管吸取液或支气管灌溉液510ml放入无菌、带垫圈的50ml螺口塑料管中，立 即密封。
临床标本运送、接收和保存
根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务 院424号令）的有关规定，人禽流感标本应当由不少 于两人的专人护送，并采取相应的防护措施，不得通 过公共电（汽）车和城市铁路运输。 标本接受不少于两人，做好记录，办理相关接受手续。 标本保存应设立专库或专柜单独保存
临床标本运输
临床标本应按照A 类包装要求运送，并用 干冰运输。 所有标本应标示清楚。疑似病例标本运送 应包含的信息请参照禽流感标本运输。
A类感染性物质
指在运输过程中与之接触能对健康人或动物造成 永久性残疾或致命疾病的感染性物质。此处“接 触”系指感染性物质离开保护性包装与人或动物 的身体接触或经呼吸道吸入的情况。 A类感染性物质使人染病或使人和动物都染病者 联合国编号为UN2814，其运输专用名称为危害人 的感染性物质； 仅使动物染病者联合国编号为UN2900，其运输专 用名称为仅危害动物的感染性物质。
监测：为社会公众提供流感活动情况的“早期预警” 系统。在一些国家快速检测已经被应用流感的监测形 成制度，被用于病毒分离前的标本筛选。但是WHO 要求对流感进行抗原分析，不推荐把快速检测作为监 测的单一手段。
免疫荧光法
免疫荧光试验可以区分A 和B 型流感病毒。 结果取决于临床标本的质量，操作技能 由于免疫荧光和其他免疫检测方法中使用 的抗体可能不会和该病毒的靶位点结合， 因此会产生假阴性结果，不能作为猪流感 感染的最后诊断。
特异度高；
灵敏度低；
实验室检测方法
推荐的检测方法 用Real-time RT-PCR 方法检测猪流行性感 冒（ H1N1 病毒）病毒。检测A 型流感病 毒的M 基因、Swine（ H1N1）的HA 基因 和NP 基因，以及质控对照RNP 基因 确诊猪流感病毒A/H1N1 的唯一可靠的方 法是进行病毒分离（病毒分离应在BSL-3 实验室进行），并且进行部分/全基因测序。
A类感染性物质的包装与标签
临床标本的包装
（1）标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡及圈 的塑料管里，拧紧。 （2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋密封； 每袋装一份标本。 （3）在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密 封。同时填写人感染猪流感监测病例标本原始登记 表，用另一塑料袋密封。 （4）将标本密封袋放入专用运输箱内，放入冰排， 然后以柔软物质填充，内衬具有吸水和缓冲能力的 材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同 一塑料袋内再次做密封。所有）
血清： 采集5-10ml全血放入带垫圈的螺口管中， 不加抗凝剂，待血液凝固分离血清，-20℃ 保存，血凝块灭菌处理后弃掉； 采集时间：入院后24小时；14-28天或出院 当日。
采样液的要求
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 最佳采样液：Hank’s液，Eagel’s液,生理盐水 BD15ML采样管 拭子是聚脂纤维杆可折断，不推荐棉拭和木杆
快诊的应用价值
感染病例的处理：辅助流感病例的临床治疗策略和医 院处理方案的制定。 爆发疫情的处理：有助于对爆发疫情的预防控制制度 的建立。 公共健康：在流感爆发期间，对于公共场所（如商业 区、旅游区）的人群健康，快速诊断将提供有效的信 息以供控制方案的制定，提供有效的公共健康建议。
快诊的应用价值
实验室检测决策
流行早期阶段 重点在于控制和预防，此时高灵敏度的检测手段 （如流行株特异性核酸检测）实优先被选择的，目的 在于发现起始病例或病例群，以便能够及时地进行抗 病毒治疗和制定相应的预防策略。
实验室检测决策
流感已经广泛流行期间 此时的重点在于临床病例的确认，进而防止在医 院内进一步传播扩散，因而此时实验室检测可以采用 免疫荧光、快速抗原检测（快诊）等技术进行病理诊 断，并且在有可能的情况下进行耐药性检测。