蛇足石杉内生真菌的分离纯化与鉴定研究

蛇足石杉内生真菌的分离纯化与鉴定研究俞　超,罗胡科,齐　娜,胡　彦,王忠华(浙江万里学院生物技术研究所,浙江宁波315100) 摘要:从药用植物蛇足石杉中分离内生真菌,并对其进行初步鉴定。

先在M S 培养基上对蛇足石杉的茎、叶和孢子进行离体组织培养;然后在P DA 平板培养基上,分别对茎、叶和孢子离体培养中产生的内生真菌进行分离;最后对照真菌鉴定手册,根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率、质地、生长培养基颜色变化,以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。

结果从蛇足石杉的茎中分离出4株内生真菌菌株,分别属于顶孢霉属、头孢霉属、酵母属和束梗孢霉属;从叶中分离出2株内生真菌菌株,分别属于头孢霉属和青霉属。

关键词:蛇足石杉;内生真菌;分离;纯化;鉴定 中图分类号:S567.1+90.353 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)03-0381-04收稿日期:2008-12-22基金项目:浙江省创新创业计划;浙江省宁波市农业攻关项目(编号:2006C100068)。

作者简介:俞　超(1979—),男,浙江奉化人,实验师,主要从事药用植物生物技术研究。

通讯作者:王忠华。

E -mail:wang1972@z wu .edu .cn 。

蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb .)Trev .],又名千层塔,为石杉科石杉属蕨类植物[1]。

民间用其全草治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、淤血肿痛和精神分裂等疾病。

蛇足石杉主要分布于我国中亚热带和南亚热带所在的地理区域,性喜阴湿,适应于中亚热带常绿阔叶林和南亚热带季风常绿阔叶林的气候条件中生长。

现代医学研究表明,蛇足石杉所含有的石杉碱甲具有高选择性的抑制乙酰胆碱酯酶活性,对提高学习记忆力和改善老年人记忆功能及治疗重症肌无力和早期老年痴呆有显著疗效[2-3]。

由于石杉碱甲在全草中含量甚微,结构复杂,人工合成十分困难,目前药品生产完全依赖野生资源,价格昂贵。

长期采挖势必破坏蛇足石杉天然资源的保存与可持续开发[4],因此,开展蛇足石杉快繁技术研究和开拓新的原料来源显得尤为必要。

我国学者在蛇足石杉组织培养研究方面进行了一些有益的尝试,但是在蛇足石杉组织培养过程中,尽管采用了各种灭菌方法,植株总是带菌,说明蛇足石杉健康植株中生活着内生真菌[5]。

因此,蛇足石杉等较低等且伴有内源真菌的蕨类植物的离体培养,外植体的消毒效果已成为制约其组培快繁技术应用的一个重要因素。

但基于某些内生真菌能产生和其共生植物相同或相似生理活性物质的特点[6-8],对药用植物内生真菌的研究近来十分活跃,人们已先后从红豆杉属、长春花、桃儿七、德国鸢尾等珍贵药用植物中分离出能够产生活性成分的内生真菌[6-9]。

本研究对蛇足石杉植株的茎、叶、孢子囊内生真菌进行了分离、纯化与初步鉴定,为蛇足石杉的组培快繁技术应用及其内生真菌开发研究奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料供试蛇足石杉全草采自于浙江省庆元县山上。

植株茎高10～24c m,多年丛生,单一或数回二叉分支,匍匐或直立,茎生叶长1～2c m,宽2～4c m,孢子腋生,不定根生于匍匐茎。

1.2　培养基配制(1)MS 培养基参照浙江省中药研究所采用的方法配制[5]。

(2)P DA 培养基:取P DA 44g 于1000m l 蒸馏水中,加热至完全溶解,于121℃15m in 灭菌后,倒入厚度2～3mm 的P DA 培养基于无菌培养皿中以备用。

1.3　内生真菌的分离和纯化内生真菌的分离:先将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗干净,75%乙醇漂洗2～3m in,无菌水冲洗3～4次,于0.1%升汞溶液中浸泡15m in 后无菌水冲洗4～5次,再将茎段、叶片和孢子分别接种于M S 培养基上,置于28℃恒温培养箱培养。

1周后再以升汞灭菌1次,观察发现外植体的边缘部分仍然有菌丝长出。

用接种针挑取不同部位的菌丝,分别接种于P DA 培养基平板上,30℃恒温培养,长出新的菌落,供鉴定用。

将上述表面二次灭菌处理的材料不作切割置于同样条件下培养,检查表面消毒是否彻底,辨别真菌是否为内生。

内生真菌的纯化:用接种针挑取菌株尖端菌丝,接种于P DA 培养基平板的适当位置,使成三角形的3个点,倒置于恒温培养箱中30℃下培养5、7、20d,观察菌落特征。

1.4　菌种的鉴定在各菌株生长的最佳时期,用接种针分别挑取3株位于尖端、外缘等不同位置的菌丝,置于滴加了蒸馏水的载玻片上,菌丝散开后盖上盖玻片,吸去多余的水。

在显微图像电脑分析系统下,放大400倍,观察孢子及菌丝体的形态,并对其进行拍照。

根据菌株的菌丝体和孢子的形态特征,对照真菌鉴定手册进行初步鉴定[10]。

2　结果与分析2.1　蛇足石杉内生真菌培养与纯化蛇足石杉不同外植体经第一次灭菌后接种于MS 培养基中,1周内基本没有细菌污染,符合常规的材料表面消毒要求。

但随着培养时间的延长,部分外植体逐渐出现真菌污染。

为了排除非内生真菌,取培养2周未出现真菌污染的材料进行第二次灭菌,再放入MS 培养基中继续培养,3～4周后在切口处出现菌丝,随后快速生长。

蛇足石杉内生真菌主要存在于茎部,叶中很少,孢子未获得真菌。

温度和光照对内生真菌—183—江苏农业科学　2009年第3期的诱导和生长速度有较大的影响,光照下长出菌丝的外植体数少,并且菌丝生长缓慢,这可能反映了蛇足石杉对荫蔽生长环境的长期适应性。

本次试验培养条件比较单一,只获得了3种菌株。

但是从菌落形态和生长等方面上看,蛇足石杉内生真菌种类应该是相当丰富的,显示了该植物内生真菌的多样性。

通过进一步改变培养条件和加强分离手段,将会分离纯化出更多的蛇足石杉内生真菌菌株。

2.2　蛇足石杉内生真菌的特征与鉴定2.2.1　茎中内生真菌的特征与鉴定2.2.1.1　菌株1　内生真菌菌株在P DA培养基上培养,形成的菌落密度低且呈绒毛状。

当菌株在P DA培养基上培养20d后,形成菌落直径可达1.5c m,菌落表面呈白色,棉絮状,背面黄色,中心突起(图1)。

在显微镜下观察,菌丝体白色,菌丝较细、有横隔,菌丝多次二叉分枝(图2)。

根据菌落的形态和菌丝的结构特征,查阅真菌鉴定手册可初步鉴定,蛇足石杉内生真菌菌株1属于半知菌亚纲(Deu2ter omycotina)丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Monilialceae)顶孢霉属(Cephalosporium Corda)的真菌。

此类真菌的特点为:腐生或寄生。

菌丝和分生孢子梗无色或鲜色,菌丝状,或分化为特别的形式,分散而不连接成束。

分生孢子与孢子梗同色、无色或鲜色。

分生孢子梗从菌丝生出或子座上形成,单枝或顶端分枝。

单枝集成绒毛状,或基部联合而顶部分散,称为束丝,或纠结而成子座状,称为分生孢子座[10]。

2.2.1.2　菌株2　内生真菌菌株2在P DA培养基上培养5d后,菌落直径可达1.5c m左右,呈青褐色绒毛状,中心突起,反面黄色(图3)。

在显微镜下观察,菌丝气生菌丝发达,表面密布绿色粉粒状结构,有横隔,透明,分生孢子梗不对称分枝、光滑、竹结状,分生孢子串生于分生孢子梗顶端,分生孢子单胞、椭圆形或近球形,无色、光滑(图4)。

根据已经观察到的菌落形态和菌丝的结构特征,查阅真菌鉴定手册及参考文献进行了初步鉴定,内生真菌菌株2可能是属于半知菌亚纲(Deuter omycotina)丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Monilialceae)头孢霉属(Cephalotaxine)的真菌。

此类真菌的特点为:分生孢子梗从菌丝生出,直立,短小,顶端生球形或卵形的分生孢子相继断脱,由所分泌的胶状物质黏着成小球,无色,单细胞。

分生孢子不生在分生孢子器内,分生孢子梗外露,子实体无一定的界限,绒毛状。

丛梗孢目的真菌包括许多腐生菌和寄生菌,与人类的经济关系极为密切,它们在基物上形成各种颜色的霉层。

分生孢子梗从菌丝生出或在子座上形成,单枝或顶端分枝。

单枝集成绒毛状,或基部联合而顶部分散,称为束丝,或纠结而成子座状,称为分生孢子座。

分生孢子生于分生孢子梗上,形态变化甚大。

丛梗孢子科菌丝和分生孢子梗无色或鲜色,菌丝状,或分化为特别的形式,分散而不连结成束。

分生孢子与孢子梗同色、无色或鲜色[10]。

2.2.1.3　菌株3　内生真菌菌株3在P DA培养基上培养10d后,菌落直径为2～3c m,菌落平坦、湿润、无光泽,中心有环形沟状,稍突起,呈现土黄色向边缘逐渐淡至乳白色,菌落边缘缺刻呈不规则锯齿状(图5)。

在显微镜下观察,菌落无假菌丝体,仅有1～3个细胞连接成短链,细胞呈卵形、椭圆形或圆形,成表面光滑的子囊孢子(图6)。

根据菌落的形态和菌丝的结构特征,查阅真菌鉴定手册可初步鉴定,内生真菌菌株3属于子囊菌纲(A scomycetes)酵母目(Endomycetales)酵母科(Sacchar omycetaceae)酵母菌属[Saccharo m yces(Meyen)Reess]的真菌。

此类真菌的特点为:—283—江苏农业科学　2009年第3期营养细胞圆形、卵形或长圆形,出芽多处发生,假菌丝在少数种中发生,但不发达。

有性生殖在子囊形成前进行同形或异形交配,或全无交配即时形成子囊,或有一段二倍体期。

子囊含孢子1～4个,子囊孢子圆形、卵形,间或呈礼帽形、多角形或肾脏形,有时在子囊内即可交配。

半子囊菌亚纲的特点是:多数腐生,少数寄生于植物、动物或人体。

菌丝发达或全缺。

无性生殖可由芽生、裂殖或由菌丝的分枝裂成束状的节孢子。

有性生殖的子囊由2个同形或异形的细胞配合而生,或由单性生殖的方式单独形成;不形成子实体[10]。

2.2.1.4　菌株4　内生真菌菌株4在P DA 培养基上培养14d 后,观察到的菌落形态为:菌落颜色接近无色,直径为2c m 左右,菌落平坦、湿润、无光泽,菌丝向四周生长开,边缘光滑(图7)。

通过显微镜观察,菌丝生长发达,且较细,分生孢子梗有横隔膜,孢子呈卵形、椭圆形或圆形,孢子梗短小,分生孢子呈卵圆形,单孢子(图8)。

根据已经观察到的菌落的形态和菌丝的结构特征,查阅真菌鉴定手册及参考文献进行了初步鉴定,内生真菌菌株4可能是属于半知菌亚纲(Deuter omycotina )丛梗孢目(Monilia 2les )丛梗孢科(Monilialceae )束梗孢霉属(M eria Vuill .ex Fr.)的真菌。

此类真菌的特点为:分生孢子从气孔或表面生出,有隔膜,每细胞生短小的小梗1个;分生孢子无色,单细胞,单生或簇生于小梗上。

丛梗孢科的特点为:腐生或寄生,菌丝和分生孢子梗无色或鲜色,菌丝状,或分化为特别的形式,分散而不连接成束。

分生孢子与孢子梗同色、无色或鲜色[10]。

2.2.2　叶中内生真菌的特征与鉴定2.2.2.1　菌株5　内生真菌菌株5从蛇足石杉组培叶中分离,在P DA 培养基上培养5d 后,观察到的菌落形态为:菌落颜色黄绿色,直径为1c m 左右,菌落平坦,中心微突起,呈黄绿色向边缘渐淡至乳白色,菌落边缘缺刻呈不规则锯齿状(图9)。