溶菌酶

前景与展望： 溶菌酶是一种小分子碱性蛋白,长期以来一直被作 为一种"模型"体系,用于研究蛋白质的空间构象、 酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。 溶菌酶具有分解细菌细胞壁中的肽聚糖的特殊作 用,因而起着防腐和杀菌作用,同时溶菌酶是高盐 基蛋白质,具有一定保健作用,而且与植酸、聚合 磷酸盐、甘氨酸等结合使用,可大大提高其防腐效 果
简介:
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质（muramidase） 或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病 菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1,4糖 苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽， 导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌 酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、 RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此， 该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
制备原理:
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为 2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前， 溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具 有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作 用。 溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中 性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用 等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。 采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。
步骤： 蛋清溶菌酶分离提取步骤
溶菌酶活力测定
变性与等 电点选择 性沉淀
丙烯酸处 理
乙二醇浓缩
Sephade x G-50 柱层析
蛋清溶菌酶分离提取步骤
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。 用微量进样器取酶液样品10μ L，加入0.5mL 的 0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃ 预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。 37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。 反应液经3000r/min 离心10min，取清液在721型 分光光度计上进行比色(540nm)。空白管用磷酸缓 冲液替代样液。
天然溶菌酶是一种非广谱抗菌剂,主要作用于革兰 氏阳性菌,而对革兰氏阴性菌几乎没有作用,近年 来,很多学者研究了对溶菌酶的改性方法,使其达 到对革兰氏阴性菌的抑制作用 溶菌酶作为动物自身的一种非特异性 免疫因子， 以其广谱高效的杀菌、无残留、无污染的特性吸 引众多研究者的视线。
随着产品市场的竞争的日趋激烈，发展绿色、安 全、优质、高效 的畜产品将是畜牧业发展的必然 趋势，绿色的畜产品的生产备受社会的关注和人 们的青睐。鉴于饲用抗生素对人类健康与环境造 成的危害，许多的国家特别是经济发 达的国家已 经或准备禁止饲用抗生素的使用。抗生素的替代 问题已迫在眉睫，溶菌酶无疑是个不错的选择。 很多的研究与应用证明，饲用溶菌酶可以有效提 高动物的生长性能，满足人们对畜产品的要求， 提高畜牧业的经济效益，降低对环境以及人类健 康带来的危害。
作用机理：
溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是 N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG) 的4位碳原子间的β -1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的 主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸) 组成，NAM与NAG通过β -1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通 过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽 “桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾” 与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞 壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌 细胞壁的损伤。对于革兰氏阳性菌（G+），如藤黄微球菌、 枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌(G-)，如大肠 杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中肽 聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而 G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对于破坏G+细 菌的细胞壁较G-细菌强。
溶菌酶的应用：
1 医学上应用
可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。 有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢 复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉 炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也 可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。滴 眼：用2%溶液。 副作用 偶有较轻的过敏反应。 氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑 制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用， 因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、 皮肤病及眼、鼻、喉等用药.
分布：
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家 禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳 汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含 量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由 18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱 性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性 蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解 溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革 兰阳性菌。
应用领域：
1、 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定 的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应 用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐； 还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微 生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增 殖。 2、 溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特 异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、 抗肿瘤的功效，目前医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、 血痰和鼻炎等。 3、 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理 G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工 程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
溶菌酶活力测定
溶菌酶的应用过程中的优点： （1）溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋 清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；
（2）溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移 到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；
（3）溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定； （4）溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐； （5）溶菌酶生产成本较低；
使用条件:
鸡蛋清溶菌酶作为溶菌酶类的典型代表是一种稳定的 蛋白质，其最适pH为4-6.5，最适温度为35℃，酶的最适 添加量必须按照具体生产情况而定。
储存:
•建议在阴凉干燥的环境下避光保存，储存温度：零度以 下。 • 贮藏过久或贮藏条件不利，会使酶活不同程度的降低； 如温度湿度过高，则需要在使用时适当的增加使用量。
2
食品保藏应用
可作为防腐剂,它的主要功用是水解细菌细胞 壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用. 该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球 菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶 血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用， 其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘 氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。
化学性质:
白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和 丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。稳定性： 酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活； 96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。 抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十 二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。 1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。通过水 解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。