色谱分离技术实验思考题及实验指导

附件3-5

色谱分离技术的演变和发展

（张卫*****************.cn）

一、本探究实验需要讨论的问题：

A组：

(1) 什么是色谱分离技术？它经历怎样的发展、演变过程？

(2) 简要说明色谱分析方法的基本原理，固定相和流动相的作用分别是什么？

(3) 柱色谱的色谱柱如何进行填充？填充过程中需要注意哪些问题？

(4) 简述柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？

(5) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离

任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。

设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。

拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；

B组：

(6) 常用的色谱分析方法有哪些？分别有怎样的特点和适用范围？

(7) 薄层色谱中，最常用的固定相（吸附剂）有哪些？其颗粒的大小对于分离效果有何影响？影响固定相活性的主要因素有哪些？

(8) 薄层色谱的分离效果的评价指标是什么？如何进行计算？若化合物本身无色，薄层色谱的色谱图中组分迁移产生的展开斑点位置如何确定？试举例说明两种常用的确定方法。(9) 采用薄层色谱分离顺式偶氮苯和反式偶氮苯的混合物时，若分别采用20:1环己烷-乙酸乙酯和10:1环己烷-乙酸乙酯作为展开剂，展开效果有何不同？为什么？

(10) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离

任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。

设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。

拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；

二、实验设计文本示例：层析技术用于分离有机染料

（一）实验目的

学习色谱法分离和鉴定化合物的原理和基本操作，了解和掌握薄层吸附色谱展开剂、柱色谱中洗脱剂、植物色素的提取和分离试剂的选择原则。

（二）实验原理

层析分离是利用混合物的各组份随着流动的液体或气体（称流动相）通过另一种固定不动的固体或液体（称固定相）时，在两相中分配（选择性溶解）、吸附或其他亲和性能的差别，达到分离的目的。

1、顺式偶氮苯与反式偶氮苯的分离

偶氮苯在通常情况下采取反式结构，紫外光照下发生异构化，形成一部分顺式结构。由于顺式偶氮苯的极性比反式偶氮苯稍大，可利用薄层色谱将二者分离。

反式偶氮苯顺式偶氮苯

二者极性不同，采用合适的展开剂加以分离。并比较不同的展开剂（如20:1和10:1环己烷-乙酸乙酯混合溶液）R f值的差别及原因。

2、有机染料甲基橙和亚甲基蓝的分离

有机染料甲基橙和亚甲基蓝的结构式如下：

H3C

N

N N SO3Na H3C

甲基橙

(2) 称量7g中性Al2O3放入小烧杯中，并用10ml 95％乙醇调匀。

(3) 打开色谱柱活塞，控制乙醇流速为1滴/s，将Al2O3从柱顶一次加入柱内，并用装有橡皮塞的玻棒轻轻敲击管外壁，使其填装均匀。

(4) 待Al2O3全部下沉，通过转动轻敲使Al2O3柱顶成均匀平面，然后在表面轻轻地覆盖一张圆形滤纸。

(5) 当乙醇液面降至滤纸表面时，关闭活塞，用滴管沿管壁加入1ml次甲基蓝与甲基橙（1:1）的乙醇混合液。

(6) 打开活塞，仍控制流速为1滴/s，当混合液降至滤纸面时再关闭活塞，用滴管沿管壁滴入1～2ml95％乙醇，洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，让洗涤液降至滤纸面时，再加入3ml95％乙醇。

(7) 在色谱柱顶上装上滴液漏斗，用95％乙醇淋洗，洗脱速度1滴/s，观察色层带的形成和分离。

(8) 当蓝色次甲基蓝色带到达柱底时，更换接受器，收集全部此色带，然后改用水为洗脱剂，同时更换接受器。

(9) 当黄色甲基橙色带到达柱底时，再更换接受器，收集全部色层带。

(10) 色谱分离结束后，开活塞将柱内氧化铝倒入废物桶内，切勿倒入水槽。

(11) 回收次甲基蓝乙醇溶液和甲基橙水溶液。

3. 纸层析分离植物色素（自行设计）

（五）实验数据记录（自行设计实验记录表）

（六）实验结论