第5章细胞融合介绍

三 基本原理 对于植物细胞而言， 1、一般先将两种不同植物的体细胞(来自其叶或 根)经过纤维素酶、果胶酶消化，除去其细胞壁， 得到原生质体； ２、 而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂 种细胞； ３、 继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养， 促使 杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直 至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的 转移。 ４、由 于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和 细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个 体就是一个新的物种或品系。
3.体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造 细胞质杂种。在体细胞杂交中双亲的细胞质 都有一定的贡献。据试验，融合后的杂种细 胞质最终会选择某一亲本的叶绿体，但线粒 体可以实现双亲重组。因此，有可能通过细 胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组 的不同组合，这在育种上无疑有着重大价值。 4.体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独 到的意义和作用。随着新的融合技术(如电融 合技术)进一步完善和发展，体细胞杂交对作 物改良必将发挥出更大的作用。
2. 基本过程 以植物原生质体为例，PEG法诱导原生质 体融合的过程见图5-4所示。 融合中应注意： (1)事先要做好两种原生质体的识别标记，如 色素、缺陷型、抗性标记等。 (2)原生质体的密度应在105个／ml左右，两种 原生质体按1:1等量混合。
(3)常用PEG的分子量通常为4000~6000，加热熔 化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质 量的PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24 ℃ 培育10-20min(注意时间宜短不宜长，过长，使 原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低 融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液， 15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。 (4)计算：融合率=(融合细胞的细胞核总数／视野 内全部细胞的细胞核总数)×100％
2 基本过程 电融合装置的电极有两种：微电极型(图5—5 中B)和平行多电极型(图5-5中A)，它们的特点与 操作如下： (1)将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合 小室中，微电极型只有一个小室(图5-5中B)，平 行电极型有4个小室(图5-5中A)，两电极间隔 3mm，整个装置放在一个培养皿中。
(2)微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近 的原生质体膜表面接触，微电极所产生的 5~12mA的脉冲电流间断刺激1~5ms，原生质体 在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的 收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一 个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体， 整个过程大约10~30min。 (3)平行多电极通过1兆赫(MHz)交流电场发生双 向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产 生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状(图5-5中 C)。在适当时间和强度(如50mA l.2~2kV／cm)的 直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融 合体。应用如下图所示。
下图所示的是两个不同的原生质体质体或细胞通过细胞融合，得到含有两 者遗传信息的新的杂合细胞，然后通过培养基筛 选出这种杂合细胞，就有可能得到一个新生物。
植物细胞融合过程示意图:
显微镜下的细胞融合过程见图5-2
细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互 相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融 合几个步骤。其中细胞桥的形成是细胞融合 最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼 此接触到破裂形成细胞桥的具体变化过程图 解如图5-3所示。 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。 后来，细胞融合技术逐步扩展到植物细胞 和微生物细胞。
(四) 细胞融合的影响因素 1. 植物细胞融合 植物原生质体融合无种属特异性，故其融合效率仅 与外界条件有关，而与其自身种属无关。如何确定不同 材料的融合条件，需经过具体实验制定出最佳融合方案。 植物细胞融合的影响因素如下： (1)PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca 2+和 pH溶液处理时间长短非常重要。时间过长原生质体损 伤严重，融合效率降低；过短则不融合。 (2)PEG规格和纯度与融合效率亦有关系。以往认为PEG 分子质量越大，对细胞毒性越大，因此选用分子质量小 的PEG。但是目前发现PEG毒性是其中杂质所致，经纯 化后即无毒性。故目前应用分子质量较大者(4000~6000) 居多。因此操作时应注意PEG纯度。
(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经 常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合 率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。 (5)有些细胞融合时需要Ca2+ ，否则不融合，细 胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+ 、 Mg2+ 、Mn2+ 等离子可代替Ca2+，但有效浓度较 Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为 0.1mol／L。 (6)最适合的pH为7.4~7.8之间，在此范围之外， 融合率均较低。
第五章 细胞融合
一 细胞融合的定义 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细 胞工程技术。细胞融合(Cellfusion)又称体细胞杂 交(Somatic hybridization)，是指将不同来源的原 生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再 生、形成新物种或新品种的技术。
二.细胞融合的意义 1.通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细 胞工程研究的重要内容之一。可把这种技术 应用于遗传性状改良、克服远缘杂交中的不 亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优 良遗传性状，从而培育出理想的新品种。 2.进行体细胞融合可以避开生殖细胞的受精过 程，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移， 创造出自然界中所没有的新物种。
（一）生物法——仙台病毒法 我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力，它一边黏 接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面， 从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。 在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞 杂种的标准融合剂。 病毒促使细胞融合的主要步骤如下： (1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。 (2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜 间互相渗透，胞质互相渗透。 (3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。 (4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体 的杂种子细胞。 过程图解如下图所示。
2.组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成 细胞团或单细胞。可根据不同的组织对象采用不 同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶 等。其他的酶如链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶 等也可用于动物组织的消化。EDTA最适合消化 传代细胞，常与胰蛋白酶使用。 下面分别以胰蛋白酶和胶原酶为例介绍一下 动物组织的消化方法：
(三)物理法——电融合诱导法 1 基本原理 电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技 术。在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面 的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质 体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接， 直到闭和成完整的膜形成融合体。与PEG法比较， 电融合法优点较多，如融合率高、重复性强、对 原生质体伤害小；装置精巧、方便简单、可在显 微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的 洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。电融合设 备及原理如图5-5：
胶原酶：是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质 有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、 癌组织等。胶原酶不受Ca 2+、Mg2+的螯合影响，可 用BSS和含血清培养基配制成200U／ml或0.1~0.3mg／ ml浓度，作用温和，无需机械振荡。具体消化方法如下： (1)向培养瓶中放入1~5mm3大小的组织块，加 5m12000U／ml的胶原酶母液，最终浓度为200U／ml， pH=6.5 。 (2)36.5 ℃水浴4~48h，无需摇动，中间可更换酶液一次。 (3)当组织变软，分散于瓶底时，轻轻振荡即散成细胞 团或单个细胞，小心倒出培养液。 (4)800r／min离心5min，弃上清液，重新悬浮BSS溶液 中，再离心一次。 (5)加入培养液制成细胞悬浮液。
五 细胞融合技术 为了使制备好的原生质体或细胞能融合在一 起，选择适宜有效的诱导融合方法很重要。诱导 融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物 理法主要包括显微操作、电场刺激等；化学法主 要是用聚乙二醇PEG结合高pH、高钙离子法； 生物法有仙台病毒法等。具体应用时要根据不同 对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物 细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合 法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法； 微生物细胞融合只适用PEG法。表5-1显示不同 细胞融合的条件及其主要应用。
胰蛋白酶：尤其适合于细胞间质较少的软组织， 如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代细胞等。 用胰蛋白酶消化动物细胞的基本步骤如下： (1)向剪碎的组织块中加入30-50倍体积的0.25％ 浓度的胰蛋白酶。 (2)在37℃水浴内消化30~60min，每5-l0min摇动 一次，根据具体情况可以中间更换消化液。 (3)Hanks液漂洗两次，每次2~3min 。 (4)800r／min离心5min，弃上清液，加入营养液。 如果有大块，可用纱网过滤。
（二）化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法 细胞融合中的化学法诱导主要包括：NaNO3 诱导(NaNO3可中和原生质体表面负电荷，促进 原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率 低)、高Ca2+和pH诱导法、PEG诱导、高Ca2+和 pH诱导PEG结合诱导等。上面几种方法中以后 者最为常用，下面做一重点介绍：
四 融合材料 （一）植物或微生物原生质体的制备 植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞 壁，如植物细胞质膜外面包裹一层细胞壁，各 细胞壁间有果胶层将细胞联结在一起。为了促 使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除 去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原 生质球。因此对于植物和微生物细胞的融合一 般又可称为原生质体融合。
2.动物细胞融合 在动物细胞融合过程中，除促融剂外，其他如细胞 性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均会影响细 胞融合效率。 (1)首先，亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛 而不规则者较易融合，而表面光滑者较难融合。 (2)细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化 细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。 (3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒 诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于37 ℃振摇时易于 融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34 ℃振摇则 融合率下降。在37℃时不振摇则几乎不融合。