2免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA及相关免疫分析技术
ELISA及相关免疫分析技术ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量测定生物样本中的抗体或抗原。
ELISA是体外实验室诊断的重要工具，广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和农业科学等领域。
ELISA的基本原理是利用抗原-抗体反应的特异性来检测和测定样品中的目标物。
ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接荧光ELISA等不同的变种方法。
下面将分别介绍这些方法的原理和应用。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法。
它使用固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗体结合，然后通过一个与抗体特异结合的酶标记二抗进行检测。
该方法适用于检测样品中的抗体。
2.间接ELISA：间接ELISA是一种常见的ELISA方法，用于检测样品中的抗原。
它首先在微孔板上固定抗原，接着加入待测样品，样品中的抗原与固定的抗原结合。
然后通过加入与抗体特异结合的二抗来检测抗原，该二抗被酶标记，在添加相应底物后可以通过测量底物的反应来定量抗原。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测量样品中抗原或抗体的浓度。
它通过在固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗原或抗体竞争结合，来测定样品中的目标物浓度。
4.间接荧光ELISA：间接荧光ELISA是利用荧光信号来检测和测定样品中的抗体或抗原。
它与间接ELISA的原理类似，不同的是二抗被标记上荧光物质，通过测量荧光信号来定量目标物。
ELISA具有许多优点，例如灵敏度高、特异性强、操作简单、快速和成本低廉等。
它广泛应用于临床诊断中，如检测患者体液中的病原体抗体或抗原、监测药物浓度和筛选疫苗候选物。
此外，ELISA还可以应用于食品安全检测、环境监测和生物学研究等领域。
总而言之，ELISA是一种重要的免疫分析技术，广泛应用于不同领域的科学研究和临床实践中。
它的原理简单易懂，操作方便，同时具有高灵敏度和特异性，因此被认为是一种高度可靠和有效的生物分析工具。
免疫共沉淀磁珠法-概述说明以及解释
免疫共沉淀磁珠法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分可以简要介绍免疫共沉淀磁珠法的定义和原理。
免疫共沉淀磁珠法是一种利用磁珠载体对特定抗原/抗体进行选择性结合的技术，通过磁场的作用实现对特定分子的快速分离纯化。
这种方法在生物学、医学和生物化学等领域有着广泛的应用，并且具有操作简便、效率高、成本低的优势。
在接下来的文章内容中，我们将对免疫共沉淀磁珠法的方法介绍、应用领域以及优势和局限性进行详细阐述。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括对整篇文章的结构和内容进行简要介绍，让读者对文章有一个整体的了解。
可以包括文章的各个章节内容和重点，以及各个部分之间的逻辑关系和连接。
此部分可以是对整篇文章的概述和导读，帮助读者更好地理解和阅读整篇文章。
部分的内容1.3 目的本文旨在介绍免疫共沉淀磁珠法在生物学和医学领域的应用和发展现状。
通过对该方法的详细介绍和分析，旨在帮助读者了解其原理、操作步骤和相关领域的实际应用。
同时，通过评估该方法的优势和局限性，旨在为研究人员提供参考，以便更好地应用和改进该方法。
最终目的是促进免疫共沉淀磁珠法在生物医学研究和临床诊断中的应用，并为未来的研究方向和方法改进提供启示。
2.正文2.1 方法介绍免疫共沉淀磁珠法是一种利用磁珠载体进行免疫共沉淀的方法，在生物医学领域有着广泛的应用。
该方法可以分为直接法和间接法两种。
直接法是指将特异性抗体直接连接到磁珠表面，然后将混合物中的抗原与抗体结合，再利用外加磁场将磁珠与非特异性物质分离。
该方法操作简单，灵敏度高，适用于大多数免疫学试验。
间接法是指首先将特异性抗体连接到磁珠表面，然后将待检测样品中的抗原与抗体结合，再加入第二抗体结合抗原，最后利用外加磁场将磁珠与非特异性物质分离。
该方法对于多肽和蛋白质分析有着较高的灵敏度和特异性。
免疫共沉淀磁珠法具有操作简便、试验时间短、结果准确等优点，同时也存在着磁珠分离效率与特异性抗体结合的选择性等局限性。
磁珠和抗体结合的原理
磁珠和抗体结合的原理磁珠是一种直径约为10纳米至1微米的微球，通常由铁氧体或其他磁性材料制成。
磁珠可以被外部磁场引导和控制，在实验中可用于实现目标分子的高效分离和富集。
抗体是一种特异性的蛋白质，由免疫系统产生来识别和结合特定的抗原。
抗体具有两个重要的结构域：抗原结合段（antigen-binding fragment, Fab）和结合抗体的细胞的Fc段，其中Fab段是实现抗体与磁珠结合的重要部分。
1.磁珠表面涂覆抗体：将目标特定的抗体附着到磁珠的表面，通常通过共价键合或非共价键合的方法实现。
这样可以使磁珠具备与目标分子结合的能力。
2.样品处理：待处理样品中的目标分子需要与磁珠上的抗体结合。
通常，样品需要经过一系列预处理步骤，如样品的离心、洗涤和去除无关成分等，以提高结合效率和特异性。
3.抗原捕捉：将涂有抗体的磁珠与样品混合，使抗体与目标分子发生特异性结合。
这种结合可以通过抗体对抗原的亲和力来实现，具有高特异性和选择性。
4.磁珠捕捉：通过外部磁场的作用，将含有磁珠-抗原复合物的溶液置于磁场中。
磁珠具有磁性，可以在磁场中快速被吸附到磁场源附近，从而实现目标分子的高效分离和富集。
而其他无关物质则可以通过去除磁场来实现分离。
5.清洗：将含有磁珠-抗原复合物的溶液分离开，除去与磁珠非特异性结合的分子和其他杂质。
多次重复洗涤可以提高纯度和特异性。
6.目标分子的脱附：将磁珠上的目标分子从抗原抗体结合复合物中释放出来。
可使用低pH值、高盐浓度或特定结合位点的化合物来打断磁珠和抗原-抗体结合，实现目标分子的脱附。
这种磁珠和抗体结合技术具有许多优势，如高选择性、高灵敏度、易于操作、可以进行自动化和多重实验等。
它在生命科学研究中的应用广泛，包括免疫分析、癌症诊断、药物筛选等领域。
同时，这种技术的进一步发展也为临床诊断和治疗提供了新的手段和可能性。
免疫磁珠技术
2.1.1 大肠杆菌O157的检测
传统分离E.coli O157∶H7所采用的直接分离 法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、 工作量大等缺点。 采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样 品中分离富集E.coli O157∶H7，满足流行病学 的研究要求和提高控制力度。 现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健 康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也 已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入 国家标准（GB/T 4789.36-2008）和出入境检 验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。
例1：Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的 沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠 分离、DNA提取及PCR扩增，12～13h即可完 成检测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感染肉 类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异 性。
例2：Blackburn 等将用生物素标记的抗沙门 菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁 珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙 门菌。此法的敏感性可达105cfu/g 食物，总的 检测时间从5d减少至1~2d。
3.结合:在18℃~30℃环境中，将上述Eppendorff管 连同磁板架放在Dynal MXl样品混合器上转动或用 手轻微转10 min，使E. coli O157与免疫磁珠充分 接触。 4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min 内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫 磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁 中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。 5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集 物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通 过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁 珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将 其放回到Eppendorff管中，并重复4步骤。每个样品 换用1支无菌加长吸管。
免疫磁珠分离技术及应用
免疫磁珠分离技术及应用一、前沿免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads sep—aration techniques，IMB) 是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术；是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。
是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。
目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是目前最有推广价值的技术之一。
二、免疫磁珠分离技术介绍1、免疫磁珠分离技术原理利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠，作为抗体的载体。
当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。
2、免疫磁珠法分类⑴、阳性分离法磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞⑵、阴性分离法磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞。
一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用的更多。
磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。
磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直接法）; 也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法），使分离细胞的范围大大扩大。
3、免疫磁性微球的制备基本技术路线：制成磁性材料的微球，再在微球表面引入活性基团，通过载体表面偶联反应可将抗体结合到载体上，形成免疫磁性微球。
优质微载体的性能：合适且均一的磁响应强度,较小且均一的粒径,稳定均一、特异吸附的表面性能。
4、该技术的主要优点⑴、细小而均一的微球为配基与受体的反应提供了较大的接触面积⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地获得分离，且对被分离物无损伤⑶、检测复杂的生物样本和食品样本等时受到颗粒性杂质等的影响较小⑷、作为一种流动性的固相支持物，其洗涤和反应都进行得更加充分三、免疫磁分离技术的应用1、用于细胞分离和提纯使用IMB进行分离细胞有两种方式；直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。
ELISA试验及应用
酶联免疫吸附试验及其应用一、前言近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。
继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。
由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
二、方法的基本原理和种类ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+ ”、“-”号表示。
磁微粒化学发光 elisa-概述说明以及解释
磁微粒化学发光elisa-概述说明以及解释1.引言1.1 概述磁微粒化学发光ELISA是一种结合了化学发光技术和ELISA技术的新型检测方法。
通过利用磁性微粒作为固载标记物和化学发光底物，结合ELISA技术的高灵敏度和特异性，实现了对目标分子的快速、灵敏的检测。
本文将从磁微粒化学发光原理、ELISA技术介绍以及磁微粒化学发光ELISA的应用等方面进行详细介绍，旨在为读者提供关于这一新兴检测方法的全面了解。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行展开：1. 引言部分：首先对磁微粒化学发光ELISA技术做一个概述，介绍文章的结构和目的。
2. 正文部分：2.1 磁微粒化学发光原理：详细介绍磁微粒化学发光的原理和机制，包括其在ELISA技术中的应用。
2.2 ELISA技术介绍：对ELISA技术进行详细介绍，包括其原理、操作步骤和常见应用领域。
2.3 磁微粒化学发光ELISA应用：探讨磁微粒化学发光技术在ELISA中的具体应用，以及其在生物医学领域的潜在应用价值。
3. 结论部分：3.1 总结磁微粒化学发光ELISA的优势：归纳总结磁微粒化学发光ELISA技术相比传统ELISA技术的优势和特点。
3.2 展望未来发展方向：展望磁微粒化学发光ELISA技术在未来的发展方向和潜在发展趋势。
3.3 结束语：对本文进行总结，并表达对磁微粒化学发光ELISA技术的看法和展望。
1.3 目的目的部分旨在阐明本文研究的目的和意义。
通过本文对磁微粒化学发光ELISA技术的介绍和应用，旨在：1. 探讨磁微粒化学发光技术在ELISA技术中的应用优势；2. 分析磁微粒化学发光ELISA在生物医学领域的潜在应用价值；3. 探讨磁微粒化学发光ELISA技术的发展趋势和未来方向；4. 为磁微粒化学发光ELISA技术的进一步研究提供参考和指导。
通过深入研究和分析，本文旨在为读者提供关于磁微粒化学发光ELISA技术的全面了解，促进该技术在临床诊断、生物学研究等领域的广泛应用，推动相关领域的科学研究和技术发展。
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)
ELISA的测定方法包括：
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法
间接法：检测抗体最常用的方法
竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体 生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲和 素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
第三页，共22页。
直接法
第四页，共22页。
间接法
7. 终止反应：各孔. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔OD值。
第十一页，共22页。
6.显色 各孔（包括空白对照）加底物A 液50μl（1滴），底物B液50μl （1滴），置37℃避光温育 15min
7.终止反应 各孔加终止液50μl
第十页，共22页。
4. 加酶标记的抗HBsAb抗体：除空白对照外各孔50μl，充分混匀。 将即时帖覆盖于反应板上，37℃孵育30min。
5. 弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、 再拍干，重复洗涤5 次。(操作同2)
6. 显色：各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底物B 液50μl（1滴），置37℃避光温育15min。
第十六页，共22页。
THANKS
第十七页，共22页。
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分化抗 原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克隆抗体、 补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、CSF、TNF、 MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别受体（PRR）、抗 原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调节、 超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
ELISA原理、方法、操作及注意事项
ELISA是一种常用的实验技术，用于检测抗原或抗体的存在。本演示将介绍 ELISA的原理、不同方法、操作步骤，并提供注意事项，用以帮助您更好地理 解和应用ELISA技术。
ELISA概述
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种常用的生物化学分析方法，通过测定 光学信号来检测抗原或抗体的存在和浓度。
操作流程严格按照规定步骤进行，减少误差。
仪器设备质量
使用可靠的仪器和试剂，确保实验结果的可靠性。
实验记录完整性
详细记录实验步骤和结果，以备后续分析和参考。
反应生成的颜色变化。
7
样品预处理
收集样品，进行预处理，如离心、稀释等。
操作实例简介
具体操作步骤，如添加抗体、洗涤、添加 底物等。
酶标记方法简介
添加酶标记的抗体或试剂，通过酶催化使 信号产生。
数据分析方法简介
根据样品信号强度与标准曲线比对，计算 样品中分析物的浓度。
ELISA检测技术的应用领域
医学
ELISA在临床诊断、病 原体检测和新药开发等 方面有重要应用。
选择性ELISA方法
选择性ELISA是根据特定需求进行的修改，可用于检测特定抗原或抗体，提高 特异性和灵敏度。
ELISA操作步骤简介
1
涂覆准备
2
将样品或标准物质固定在试板上，使其与
试板表面特异性结合。
3
洗涤方法简介
4
通过洗涤去除非特异性结合物，减少背景
信号。
5
信号检测方法简介
6
利用光学或化学方法测量信号强度，如酶
食品安全
ELISA可用于检测食品 中的污染物、过敏原等， 确保食品安全。
环境监测
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，配制适当的缓冲液，例如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三倍磷酸盐缓冲液-Tween 20缓冲液）等。
2. 酶标板涂层抗体的制备：将特定抗体稀释至适当浓度，加入涂层液中，进行孵育。
三、样品处理1. 样品收集：收集待测样品，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据实验要求，对样品进行适当的处理，如稀释、离心等。
四、板涂覆1. 涂层液加入：将酶标板中的孔加入涂层液，注意避免气泡的产生。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使抗体与孔壁结合。
五、孵育1. 样品加入：将经过处理的样品加入酶标板的孔中。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使待测物与抗体结合。
六、洗涤1. 洗涤液准备：配制适当的洗涤液，如TBST。
2. 洗涤：将洗涤液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除未结合的物质。
七、检测1. 二抗加入：将特定的二抗加入酶标板的孔中，与待测物结合。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使二抗与待测物结合。
3. 洗涤：使用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的二抗。
4. 底物加入：将底物加入酶标板孔中，使酶与底物反应产生可测量的信号。
5. 反应停止：加入适当的反应停止液，停止底物反应。
八、数据分析1. 读板：使用酶标仪读取各孔的吸光度值。
2. 数据处理：根据实验设计和标准曲线，计算出待测物的浓度或相对含量。
3. 统计分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差、相关性等。
九、结果解读根据数据分析的结果，结合实验目的和背景知识，解读实验结果，得出相应的结论。
十、结论根据ELISA操作规程的步骤和结果解读，得出实验的结论，并讨论实验的可靠性和局限性。
ELISA方法的及步骤(精)
ELISA 方法的及步骤(一原理ELISA 是以免疫学反应为基础,将抗原、牽 9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行, 每加入一种试剂孵育后, 可通过洗涤除去多余的游离反应物, 从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中, 通过不同的设计, 具体的方法步骤可有多种。
即 :用于检测抗体的间接法 (图 a 、用于检测抗原的双抗体夹心法 (图 b 以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是 ELISA 双抗体夹心法及 ELISA 间接法。
(二操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法 :1. 包被:用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg / ml 。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml , 4℃过夜。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗 3次,每次 3分钟。
(简称洗涤,下同。
2. 加样:加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中, 加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度0.1ml 。
37℃孵育 0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml , 37℃10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml 。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深, 阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“ +” 、“ -”号表示。
也可测O ·D 值:在 ELISA 检测仪上, 于 450nm(若以 ABTS 显色, 则 410nm 处,以空白对照孔调零后测各孔 O ·D 值,若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1倍,即为阳性。
免疫磁珠分离技术及常见应用
免疫磁珠分离技术及常见应用冯涛201114912 食品科学与工程2班摘要：免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads separation techniques，IMB )是生物检测技术的一种具有分离迅速和无需离心等优点。
免疫磁珠分离技术以其靶向特异性强、操作方便、分离高效的优点，迅速渗透到药剂、病理、生理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域，尤其在药物靶向制剂研究方面取得巨大的进展，在微生物检测、细胞分离、蛋白质组学等方面也多有应用。
目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是目前最有推广价值的技术之一关键词：免疫磁珠；分离；检测；1.免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术(IMB) 是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术；是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。
是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术〔2〕。
其原理是利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠，作为抗体的载体。
当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的〔3〕。
1.1免疫磁珠分离技术的分类免疫磁珠分离技术法按结合的目标物不同有两种方法：（1）阳性分离法，磁珠结合的物质就是所要分离获得目标物质（2）阴性分离法，磁珠结合不需要的物质，游离于磁场的细胞为所需物质。
一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用的更多。
磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒〔4〕。
磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直接法）; 也可标记非特异抗体(间接法），使分离细胞的范围大大扩大〔5〕。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3. 平衡 取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水
口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕， 胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。 4. 准备收集 取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1～6编号，并在试管2mL处作 一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。
A.原理：
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共 价结合， 形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
B.标记步骤：
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速 控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放 置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶 溶液中。
B.需要配制的试剂
1.包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸缓冲液，4℃保存
Na2CO3 0.15g
NaHCO3 0.293g
稀释至100ml
2.洗涤缓冲液：0.01M pH7.4 PBS-Tween-20，室温保存
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g 或者Na2HPO4 1.15g
5. 上样与收集 打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL
混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集 一号管。每管收集洗脱液2mL。
当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱 内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入 3～5cm高的洗脱剂。
C.需要配制的试剂
(1) 0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂)溶于蒸馏水 10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: 0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml 0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml 加蒸馏水至2,000ml。 (3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉 淀物溶于
少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去
NaIO４
NaBH４
上海领潮科技有限公司 待询
上海领潮科技有限公司 待询
金泰公司（长春） 金泰公司（长春）
80元/100g 90元/100g
Sephadex G-25层析柱 (2cm×50cm/1cm×25c
6. 洗脱
不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至
收集到6号管达2mL时，关闭出口。
7. 鉴定
另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上
排成二排。
第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。
第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的
B.试剂的配制
1. 葡聚糖凝胶Ｇ-25 溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量 蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂 浮的细碎凝胶，重复3～4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。 2. BaCl2溶液（1%） 3. 考马斯亮蓝G-250 称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL， 最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。 4. 脲（6mol/L） 5. 洗脱剂 常规PBS
6.底物缓冲液：pH5.0磷酸棗柠檬酸，4℃保存
Na2HPO4
7.298g
柠檬酸
4.669g
加水至1000ml
7.底物溶液：
TMBS底物使用液（用时现配），450nm显色
TMBS（1mg/ml无水乙醇） 1.0ml
底物缓冲液
10ml
1%H2O2
25微升
2. HRP标记CEA单抗2
戊二醛二步法和过碘酸钠法 Ⅰ.戊二醛二步法
1. Elisa
A.实验步骤：
1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释（浓度由预实验确定），每孔加入200 微升，37℃孵育1小时后，4℃放置16-18小时。 2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。反复3次，最后 一次尽量拍干板孔中剩余液体。 3.加封闭缓冲液每孔200微升，37℃放置1小时。 4.同2步洗涤。 5.加被测血清100微升（做梯度稀释），并作阳性、阴性及空白对照。37℃放置1 小时或者4℃过夜。 6.同2步洗涤。 7.加二抗。50微升每孔加入适宜浓度的二抗，37摄氏度放置1小时。 8.同2步一样洗涤，并多重复一次，最后一次重复后一定要排干所有水分，否则 会有假阳性出现。 9.显色。每孔加入底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终 止显色。 10.酶标仪读数。
以备下次使用。
四、实验所需购买材料、试剂
材料、试剂
订购公司
价格
赖氨酸
金泰公司（长春）
124元/100g
HRP（辣根过氧化物酶） 金泰公司（长春）
250元/100mg
CEA抗原（L1C00207） 上海领潮科技有限公司 待询（1mg/mL）
CEA IgG1（单抗货号 L1C00205 ）
CEA IgG1（多抗货号 L1C00202 ）
Tween-20 0.5ml(用前临时加入)
稀释至1000ml
3.封闭缓冲液：在洗涤缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者10%BSA或者0.5%鸡卵清蛋
白。（用时现配）
4.稀释缓冲液：在洗涤缓冲液中加入0.1%BSA。（用时现配）
5.显色终止液：2M H2SO4，室温保存
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml，并边加入边混匀。
除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结 合物，分装后，冰冻保存。
C. 需要配制的试剂：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)： 取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至 200ml。
HRP标记单抗建立Elisa夹心法测定相应 抗原含量
汇报人：闫斯楠 时间：13.7.6
该方案是直接法与 夹心法的有效结合， 兼具两者的优点。 为 目 前 市 面 上 Elisa 检测试剂盒的通用 发法。
本实验夹心法 CEA抗体1-抗原-CEA抗体2（HRP标记）
三、主要技术方法
双抗夹心法Elisa HRP标记CEA单抗2 Sephadex G-25层析法
C.操作步骤
1. 层析柱的准备 (1) 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。 （若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。） (2) 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱， 让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱 剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。
(3) 排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排
出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分 离结果，排气完毕，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。 (4) 标记高度：在距顶端8～10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度 （15～17cm）的依据。 2. 装柱 每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体 积之比，约为1:1即可，否则应作调整。
(2) 1.25％戊二醛液： 取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液： 取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4) 0.2M赖氨酸溶液： 称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 (7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体（购买）。 (9) HRP(RZ>3.0)（购买）。
D.优缺点
本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～ 4％的酶与蛋白质结合。
Ⅱ.过碘酸钠法
A.原理：
HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏 碱，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
B.标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃ 过夜。
3. Sephadex G-25层析
A.分离原理 ：
当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不 同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下 它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快， 先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）； 而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另 一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析 柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。 当 我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采 用层析介质为葡聚糖凝胶G-25，用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大 分子蛋白质与小分子盐类分离。