散发性结直肠癌中CpG岛甲基化表型研究及其与微卫星不稳定的关系

散发性结直肠癌中CpG岛甲基化表型研究及其与微卫星不稳定的关系作者：鞠海星吴伟胡锦林等来源：《中国现代医生》2013年第26期[摘要] 目的研究散发性结直肠癌（SCRC）中CpG岛甲基化表型（CIMP）阳性的发生率及其临床病理特征，并探讨其与微卫星不稳定（MSI）的关系。

方法采用甲基化特异性PCR （MSP）方法对91例散发性结直肠癌患者行P16、hMLH1、MINT1、MINT2和MINT31共5个基因启动子甲基化检测，分析散发性结直肠癌中CIMP阳性病例的临床病理特征。

同时应用荧光标记多重PCR法扩增两个微卫星位点BAT25和BAT26，分析两个微卫星位点状况，探讨CIMP与MSI的关系。

结果 91例散发性结直肠癌患者中共检出CIMP阳性者22例，阳性率为24.2%。

CIMP阳性者与CIMP阴性者相比，前者好发于近端结肠（P=0.02）、分化程度上低分化癌多见（P=0.03）、组织学类型上黏液腺癌或印戒细胞多见（P=0.04）。

27.3%的CIMP阳性病例表现为MSI，54.5%的MSI病例表现为CIMP阳性（P=0.02）。

结论 CIMP的散发性结直肠癌具有好发于近端结肠、低分化癌及黏液腺癌或印戒细胞多见等特点，CIMP与MSI两者具有密切关系。

[关键词] 散发性结直肠癌；CpG岛甲基化表型；微卫星不稳定[中图分类号] R735.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）26-0051-03近年来研究揭示DNA启动子异常甲基化是抑癌基因转录失活的重要机制，Toyota等[1]提出CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）的概念，用于反映多个抑癌基因的同时异常甲基化状态。

微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）是基因组遗传不稳定的一个重要标记，在结直肠癌中MSI已成为筛查遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）的重要分子指标[2]，但在散发性结肠癌中，有关CIMP与MSI关系的研究国内外报道尚不一致[3，4]。

本研究通过检测与结直肠癌密切相关的5个抑癌基因的启动子甲基化状态，研究散发性结直肠癌中CIMP阳性的发生率及其临床病理特征，同时探讨CIMP与MSI的关系。

1 材料与方法1.1 材料来源收集浙江省肿瘤医院结直肠外科2009年1～6月份收治的手术切除91例结直肠肿瘤标本。

所有病例术前均未行放疗和化疗，并有明确病理诊断，无肿瘤家族史。

所有肿瘤标本均于手术切除后15～30 min内取材，并迅速转移至-80℃低温冰箱中保存。

1.2 DNA提取采用酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA。

1.3 MSP检测按文献方法进行DNA的亚硫酸盐处理[5]，P16、hMLH1、MINT1、MINT2及MINT31 5个抑癌基因的MSP甲基化及非甲基化引物和反应条件见表1。

PCR反应混合物包括：1×PCR buffer[16.6 mmol/L（NH4）2SO4，67 mmol/L Tris（pH 8.8）]，dNTP 0.4 mmol/L，MgCl2终浓度2.5 mmol/L，上下游引物各10 pmol，亚硫酸盐处理后的模板DNA（30～50 ng），用ddH2O补足体积至25 μL。

95℃预反应5 min后加入热启动Taq酶（Hot-star Taq DNA多聚酶，Qiagen公司）0.75 U，之后94℃变性45 s，退火温度45 s，72℃延伸45 s，35个循环，然后72℃延伸7 min，4℃结束反应。

以SssⅠ处理过的DNA（New England Biolabs，Ipswich，MA）作为阳性对照，以蒸馏水为空白对照，PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳，置于紫外线凝胶扫描系统中观察结果。

MSP产物电泳时只出现未甲基化条带时为未甲基化，如出现甲基化条带则为甲基化。

5个基因中有2个或2个以上基因同时出现甲基化条带者，该样本定义为CIMP阳性[4]。

1.4 MSI检测选用BAT25和BAT26两个位点，PCR反应后将反应物在ABI PRISM 3730XL DNA测序仪上按仪器说明进行毛细管凝胶电泳，数据由GenScan3.1软件收集后进行分析。

如果肿瘤组织DNA出现正常组织DNA没有的峰形判断为MSI。

本研究按参考文献将BAT25、BAT26两个位点均为阴性定义为微卫星稳定（MSS），两个位点均为阳性定义为高度微卫星不稳定（MSI-H），单个位点阳性者定义为低度微卫星不稳定（MSI-L）[5]。

1.5 统计学分析采用SPSS13.0软件分析，比较CIMP阳性者与CIMP阴性者两者的病理特征，并分析5个基因的甲基化及CIMP状态与MSI的关系。

采用χ2检验与Fisher确切概率法进行统计，均为双侧检验，P2 结果91例SCRC中共检出CIMP阳性者22例，阳性率为24.2%，5个基因的MSP产物电泳图及甲基化状态见图1及表2。

CIMP状态与临床病理特征的关系见表3，CIMP阳性者与CIMP 阴性者相比，前者好发于近端结肠（P < 0.05）、分化程度上低分化癌多见（P < 0.05）、组织学类型上黏液腺癌或印戒细胞多见（P < 0.05）。

27.3%的CIMP阳性病例表现为MSI，54.5%的MSI病例表现为CIMP阳性，5个基因的甲基化状态及CIMP与MSI的关系见表4，其中hMLH1甲基化及CIMP状态与MSI密切相关（P < 0.05或P < 0.01）。

3 讨论近年来研究显示CIMP阳性的SCRC具有独特的病理特征，Toyota等[1]研究显示近端结肠癌中82%病例存在CIMP阳性，而远端结直肠癌只有37%，两者存在显著差异。

Lee等[6]结果表明CIMP阳性的SCRC多位于近端结肠（24/42），明显高于CIMP阴性的病例（30/92，P=0.007），本研究结果也显示CIMP阳性的SCRC多位于近端结肠，与文献报道一致。

本研究还显示CIMP与肿瘤的分化程度以及病理类型有密切关系，CIMP阳性的SCRC低分化癌更为多见，目前多数文献显示CIMP阳性的SCRC与低分化肿瘤有关[6]，但也有研究未发现CIMP状态与肿瘤分化程度有关[7]，有关CIMP与肿瘤分化程度的机制目前尚不明确。

关于CIMP和肿瘤分期的关系，目前文献报道亦不一致。

Shannon等[8]研究发现CIMP阳性的SCRC分期较晚，但也有部分研究未发现CIMP与结直肠癌分期相关[9，10]，本研究中未发现CIMP状态与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。

SCRC中CIMP阳性与MSI-H的病例具有相似的临床病理特征如多位于近端结肠和低分化癌多见等，本研究结果显示27.3%的CIMP阳性病例表现为MSI，54.5%的MSI病例表现为CIMP阳性，提示CIMP阳性与MSI两者间存在密切关系，与Lee等[10]的研究结果相似，近年来有研究显示MSI-H病例的临床病理特征取决于CIMP状态[11]。

本研究中CIMP 5个基因中hMLH1启动子异常甲基化与MSI存在显著关联，所有hMLH1启动子异常甲基化的SCRC均表现为MSI。

SCRC中较少存在错配修复基因（MMR）突变，但部分肿瘤存在hMLH1启动子异常甲基化，提示hMLH1启动子异常甲基化是SCRC中发生MSI的重要机制。

另外有部分MSI-H的SCRC病例表现为CIMP阴性，或者尽管也表现为CIMP阳性，但hMLH1启动子未检测到异常甲基化，提示这部分患者的MSI发生还存在其他分子机制[12]，有待进一步研究。

[参考文献][1] Toyota M，Suzuki H，Yamamoto E，et al. Integrated analysis of genetic and epigenetic alterations in cancer[J]. Epigenomics，2009，1（2）：291-299.[2] Serrano M，Lage P，Belga S，et al. Bethesda criteria for microsatellite instability testing：impact on the detection of new cases of Lynch syndrome[J]. Fam Cancer，2012，11（4）：571-578.[3] 蔡国响，徐烨，蔡三军. 散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型和基因组遗传学不稳定性的关系[J]. 中华胃肠外科杂志，2007，10（6）：555-560.[4] Hagland HR，Berg M，Jolma IW，et al. Molecular pathways and cellular metabolism in colorectal cancer[J]. Dig Surg，2013，30（1）：12-25.[5] Herman JG，Graff JR，Myohanen S，et al. Methylation-specific PCR： A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（18）：9821-9826.[6] Lee S，Cho NY，Choi M，et al. Clinicopathological features of CpG island methylator phenotype-positive colorectal cancer and its adverse prognosis in relation to KRAS/BRAF mutation[J]. Pathol Int，2008，58（2）：104-113.[7] Ang PW，Loh M，Liem N，et al. Comprehensive profiling of DNA methylation in colorectal cancer reveals subgroups with distinct clinicopathological and molecular features[J]. BMC Cancer，2010，10（21）：227-234.[8] Shannon BA，Iacopetta BJ. Methylation of the hMLH1， p16， and MDR1 genes in colorectal carcinoma： associations with clinicopathological features[J]. Cancer Lett，2001，167（1）：91-97.[9] Lind GE，Thorstensen L，Lovig T，et al. A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas and colon cancer cell lines[J]. Mol Cancer，2004，11（3）：28.[10] Lee S，Hwang KS，Lee HJ，et al. Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in colorectal neoplasia[J]. Lab Invest，2004，84（7）：884-893.[11] Bae JM，Kim MJ，Kim JH，et al. Differential clinicopathological features in microsatellite instability-positive colorectal cancers depending on CIMP status[J]. Virchows Arch，2011，459（1）：55-63.[12] Tanaka J，Watanabe T，Kanazawa T，et al. Left-sided microsatellite unstable colorectal cancers show less frequent methylation of hMLH1 and CpG island methylator phenotype than right-sided ones[J]. J Surg Oncol，2007，96（7）：611-618.（收稿日期：2013-06-03）。