pACYCDuet-1大肠杆菌表达载体说明

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大肠杆菌表达操作规程

大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。

2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。

3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。

4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。

5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。

二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。

培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。

2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。

3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。

4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。

5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。

6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。

7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。

8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。

9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。

三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。

2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。

3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。

4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。

大肠杆菌表达体系的特点

大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。

其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。

2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。

这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。

3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。

这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。

4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。

例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。

5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。

这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。

总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。

- 1 -。

petduet1 pacycduet 原理

Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，用于原核和真核表达重组蛋白。

它们都包含了两个不同的多克隆位点，可以用于插入感兴趣的基因并进行表达。

Petduet1使用了T7和lacUV5启动子，pacycduet则使用了T7和CMV启动子。

以下是关于这两种系统的详细介绍：Petduet1和pacycduet系统的结构Petduet1和pacycduet系统的DNA载体结构大体相似，都包括了多个重要元件：双选择标记位点（Ampicillin和Chloramphenicol）、启动子（T7和lacUV5/CMV）、His标签、HA标签、TEV位点、定向载体和复制起点等。

Petduet1由5429bp长的质粒构成，其中含有lacIq基因的启动子和T7启动子，并通过MCS1和MCS2多克隆位点构建了重组基因组成，方便插入两个不同的重组蛋白基因。

Petduet1还包含了His标签和HA标签，对于蛋白的纯化和检测非常有帮助。

Pacycduet的质粒长度为5726bp，包含了Ampicillin和Chloramphenicol的双选择标记位点，T7和CMV的启动子，His标签和HA标签。

与Petduet1类似，pacycduet也有MCS1和MCS2多克隆位点，方便插入两个感兴趣的基因。

pacycduet还包含了TEV位点，方便进行蛋白纯化和切割。

Petduet1和pacycduet系统的应用这两种双元表达系统可以广泛应用于原核和真核系统中，用于表达多种蛋白。

研究表明，它们不仅可以同时表达两个重组蛋白，而且还可以在同一细胞中进行蛋白融合。

在原核表达系统中，Petduet1和pacycduet系统可以在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，提供了一种简单、快速的蛋白制备方法。

而在真核表达系统中，它们同样可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，为疾病治疗和生物医药领域提供了重要的工具。

总结Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，具有结构简单、应用广泛的特点。

chapter 04 表达载体

②外源基因的表达水平与细胞中基因的拷贝数有关，拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑将载体构建为一种自主复制型载体。
该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。
COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40的大T 抗原。
COS细胞的特点： ①细胞来源丰富；
②细胞易于培养和转染；
启动子和增强子
长为100～200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动子和上游启动子两部分组成。
目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。
病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。
常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的 BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。
剪接信号
mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 ′和3 ′边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。 GT-AG法则
鼠骨髓瘤细胞的特点：
①细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高； ③能对蛋白质进行糖基化修饰。
提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略
（1）设法提高外源基因的表达水平和产量
方法包括：
①载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达的关键因素之一，选择强启动子可获得高效表达。

大肠杆菌表达系统

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG
解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录
lac、tac 表达系统存在的问题
lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控
把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
启动子
Lac 表达系统
以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理
lacO
lacZ lacY lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。

大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

所有质粒载体汇总

酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEFpY15TEF, pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109;质粒pGADT7,pGBKT7 ;对照质粒pGBKT7-53 , pGBKT7-lam , pGADT7-T , PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,丫187,丫190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ aA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc ,配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33, KM71 , KM71H , GS115,原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列，pET-GST, pGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPi nPoi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK(+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 TopIO ToplOF BL21 ( DE3) HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21 (AI ) BL21 (DE3) plysS TG1 TB1 DH5a (pir) Tuner (DE3) Bl21 codonplusRIPL Novablue (DE3) Rosetta Rosetta(DE3) Rosetta (DE3) plys Rosetta-gami (DE3)Rosetta-gamiB(DE3) , Rosetta-gamiB( DE3) plysS Orgami(DE3) OrgamiB (DE3) HMS174 (DE3)植物表达/RNAi 载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381 Z,1391 Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIA super1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNA载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2, T-DNA插入载体(随机突变体库)pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽抱杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01 ,配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi 基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0, pSilencer 2.1-U6 hygro, pSilencer 3.1-H1 hygro, pSilencer 3.1-H1 neo pSilencer 4.1-CMV neo, pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi 载体(oligoengine) pSuper-puro RNAi 逆转录病毒载体(clontech) : RNAi-Ready pSIREN-Retro Q, RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen ( Luciferase shRNA Ann ealed Oligo nucleotide) RNAi 慢病毒载体(addgene : pLKO.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B , pSecTag2 A, pVAX1 , pBudCE4.1,pTracer CMV2, pcDNA3.1 (-) /myc-His A , pcDNA6-Myc/His B , pCEP4, pIRES, pIRESneo, pIRES hyg3, pCMV-myc, pCMV-HA , pIRES-puro3, pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT , pBIND , pACT-MyoD , pBIND-ld , pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-HybridSystem:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II 哺乳动物诱导表达系统：pOPRSVI , pOPI3CAT, pCMVLacl,GeneSwitch System:pSwitch 哺乳动物表面展示系统:pDisplay,四环素调控系统(Invitrogen): pcDNA4/TO/Myc-HisA ，pcDNA4/TO/Myc-HisB ，pcDNA4/TO/Myc-HisC ，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR 四环素调控系统(Clontech) : pTet-On, pTet-Off，pTRE2,pRevTRE, pRevTet-On, pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc ，pI K B-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-senso, pAP1 (PMA) -Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc，pNF- K B-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统(invitrogen) pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY300PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.pla ntarum,L.rham no susGG,B.coagula ns,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infan tis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos 载体pLAFR3,pMP2444 (GFP) ,pHY300PLK,pRT102,pRL1063a,转座子载体pUT-mi niT n5,pMGS100,pWHM10,pKC1139,pSET152, pOJ260,pPG611.1,pPG612.1腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统(Stratagene : pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ, pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3,配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cell line 腺相关病毒系统(Stratagen© : pAAV-MCS , pAAV-RC , pHelper, pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP , pCMV-MCS ,慢病毒载体:pLVX-DsRed-Mo no mer-N1,pLVX-IRES-ZsGree n1,pLVX-AcGFP1-N1 丄en ti6/v5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLe ntilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q, RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGree n, pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV- neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry 质粒载体。

大肠杆菌重组蛋白表达流程

大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。

启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。

2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。

3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。

转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。

转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。

4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。

此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。

5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。

诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。

6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。

可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。

常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。

7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。

确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。

需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。

为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。

pBV220大肠杆菌表达载体说明

pBV220⼤肠杆菌表达载体说明pBV220编号名称北京华越洋VECT--‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体⾼拷贝/低拷贝: ⾼拷贝启动⼦: pR/pL克隆⽅法: 多克隆位点，限制性内切酶载体⼤⼩: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220--‐F: 5?′--‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG--‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220--‐R: 5?′--‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG--‐3‘载体标签: --‐--‐载体抗性: 氨苄筛选标记: --‐--‐备注: pBV220质粒的SD sequence（⽤于结合原核⽣物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插⼊带起始ATG的外源基因，可表达⾮融合蛋⽩。

载体含有强的转录终⽌⼦可防⽌出现"通读"现象，有利于质粒--‐宿主系统的稳定。

载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。

pBV220含有PL启动⼦和编码对该启动⼦具有抑制作⽤⽽⼜对温度敏感的cI蛋⽩基因cIts857调控基因cI，因此可⽤温度对插⼊其中的外源基因的转录进⾏调控。

温控型原核表达载体，⾼拷贝数，⼤容量，强启动⼦，强转录终⽌⼦，可在任何受体菌中诱导表达。

pBV220载体是λPL/PR--‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达⾮融合的⽬的蛋⽩。

在利⽤pBV220载体进⾏质粒构建的时候，需要加⼊ATG起始密码⼦。

PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。

稳定性: 诱导表达组成型: ⾮组成型病毒/⾮病毒: ⾮病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达⽬的基因; PRPL, 来⾃于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动⼦，保证基因的⾼⽔平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终⽌信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所⾃⾏构建的⼤肠杆菌温控表达载体,⽬前仍在⼴泛使⽤.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 1501 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 1561 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 1621 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 1681 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 1741 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 1801 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 1861 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 1921 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA 1981 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 2041 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 2101 GTCGGGTTTC GCCAACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 2161 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 2221 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 2281 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他⼤肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET--‐52b(+) pAmCyan pDsRed--‐Express2 pBV220 pCold--‐GST pColdS--‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE--‐SUMO pCold--‐ProS2 pBAD102/D--‐TOPO pBAD202/D--‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio--‐TOPO pBad/Myc--‐His C pBad/Myc--‐His B pBad/Myc--‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD--‐TOPO pET--‐23b(+) pET--‐23a(+) pET--‐23c(+) pET--‐23(+) pET--‐12b(+) pET--‐12c(+)pET--‐12a(+) pET--‐11b(+) pET--‐11a(+) pET--‐11c(+) pBad24 pQE--‐82L pQE--‐81L pQE--‐80LpQE--‐32 pQE--‐9 pQE--‐16 pQE--‐31pQE--‐60 pQE--‐70 pQE--‐40 pET--‐51b(+)pET--‐50b(+) pET--‐49b(+) pET--‐48b(+) pET--‐47b(+)pET--‐26b(+) pET--‐32a(+) pET--‐21b(+) pET--‐22b(+)pET--‐14b pET--‐16b pET--‐15b pET--‐19bpET--‐20b(+) pET--‐21d(+) pET--‐21c(+) pET--‐21b(+)pET--‐21a(+) pET--‐24a(+) pET--‐24d(+) pET--‐25b(+)pET--‐27b(+) pET--‐28a(+) pET--‐30a(+) pET--‐42a(+)pET--‐43.1c(+) pET--‐43.1b(+) pET--‐43.1a(+) pET--‐44a(+)pET--‐44c(+) pET--‐46 E K/LIC pET--‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT--‐His pET302/NT--‐His pRSET--‐CFP pRSET--‐EmGFP pRSET--‐BFP pGFPuvpET300/NT--‐DEST pET301/CT--‐DEST pGEM--‐T pBad43pGEX--‐4T--‐3 pGEX--‐5X--‐2 pBlueScript S K(+) pG--‐Tf2pG--‐KJE8 pGro7 pET--‐SUMO pSE380pET--‐17b pET102/D--‐TOPO pCDFDuet--‐1 pMAL--‐p5xpTf16 pET--‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET--‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(--‐) pTYB12pMAL--‐p5e pACYCDuet--‐1 pEGM--‐11ZF(+) pEGM--‐7ZF(+) PinPoint X a--‐3 PinPoint X a--‐2 PinPoint X a--‐1 pSP73 pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET--‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET--‐5a(+) pMal--‐p4X pMal--‐p2G pkk223--‐3pkk232--‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL--‐c5x pMal--‐p2E pMal--‐p2X pET--‐44 E K/LIC pET--‐43.1 E K/LIC pET--‐41 E K/LIC pMal--‐c4X pTrcHis BpET--‐31b(+) pET--‐3b(+) pET--‐41a(+) pGEX--‐3XpGEX--‐4T--‐2 pETDuet--‐1 pGEX--‐4T--‐1 pTrc99apET--‐28b(+) pET--‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli--‐6xHN--‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX--‐KGpGEX--‐2T pRSFDuet--‐1 pCOLADuet--‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET--‐41b(+) pET--‐42b(+) pET--‐3a(+) pGEX--‐6P--‐3 pGEX--‐6P--‐2 pGEX--‐6P--‐1 pGEX--‐5X--‐3 pGEX--‐5X--‐1 pGEX--‐2TK pRSET A pMal--‐c2G pMal--‐c2E pMal--‐c2X pRSET C pQE--‐30pET--‐45b(+) pET--‐44b(+) pET--‐42c(+) pET--‐41c(+) pET--‐40b(+) pET--‐33b(+) pET--‐39b(+) pET--‐32 E K/LIC pET--‐32 X a/LIC pET--‐32c(+) pET--‐32b(+) pET--‐30 X a/LIC pET--‐30 E K/LIC pET--‐30c(+) pET--‐29c(+) pET--‐29b(+) pET--‐29a(+) pET--‐24c(+) pET--‐24b(+) pET--‐24(+) pET--‐23d(+) pET--‐11d(+) pBad33。

大肠杆菌表达系统使用指导

胞因子与细胞因子受体基因重组，可大大促进其生物学活性的发挥。IL- 6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和IL6Rα(gp80)的结合使其易于和另一个受体IL-6Rβ (gpl30)结合。
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体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
• HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质 (达40g/L)，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，增加在体内的半衰期至19d之久。
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各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化帮助可溶化帮助分泌到周质

大肠杆菌表达

大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。

大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。

本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。

大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。

表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。

启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。

参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。

大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。

2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。

3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。

4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。

5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。

6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。

大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。

2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。

3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。

4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。

总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。

利用Duet系列共表达载体构建工程菌生物合成3-羟基丁酸(3HB)

利用Duet系列共表达载体构建工程菌生物合成3-羟基丁酸(3HB)宋琳琳;陈少云;吴坚平;杨立荣【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2014(044)003【摘要】通过PCR获得β-酮基硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)和硫酯酶(TesB)的基因phaA,phaB和tesB.以pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、PET30a(+)为载体,以大肠杆菌表达型宿主E.coli BL21 (DE3)为宿主菌,分别构建了两株表达体系不同的工程菌,建立了R-3-羟基丁酸(3HB)的代谢途径,实现3HB的生物合成.将两株工程菌分别进行诱导表达及发酵,结果表明,三个基因均可在表达型宿主BL21(DE3)中进行活性表达,通过三个酶的连续催化生物合成3HB,并且三个基因的均衡表达更有利于3HB的生物合成.将phaAB基因簇构建在ACYCDuet-1上,tesB基因构建在RSFDuet-1上,获得的工程菌BL21(AAB+ RB),3HB产量可达到1.8 g/L.【总页数】6页(P19-24)【作者】宋琳琳;陈少云;吴坚平;杨立荣【作者单位】浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州310027;浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州310027;浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州310027;浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州310027【正文语种】中文【相关文献】1.嗜水性气单孢菌利用豆油生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物 [J], 张瑾;吴琼;张广;陈国强2.3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯纳米颗粒作为雷帕霉素缓释载体的应用研究 [J], 李明川;张雅利;卢晓云;朱新亮;陈旭;李崇;马惺锋;唐秉韬3.代谢工程技术调控3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯PHBHHx的微生物合成 [J], 欧阳少平;丘远征;卢晓云;吴琼;陈国强4.聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)/聚碳酸亚丙酯复合支架的构建与表征 [J], 李静;闫伟;高越;靳泽星;薛岳;郭源;周中凯5.利用假单胞菌DS1001a降解聚3-羟基丁酸酯制备3-羟基丁酸 [J], 张春雨;李凡;时东方;王雨萌;刘东波;夏红梅;陈珊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

所有质粒载体汇总

酿酒酵母表达载体p YES2 ,p YES2/NT ,p YES2/CT ,p YES3 ,p YES6, pYCp Iac22-GF P,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEFPY15TEF, pY16TEF,酵母基因重组表达载体p UG6, p SH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109 ;质粒PGADT7,pGBKT7 ；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T , PCL1,酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109，丫187，丫190, 毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ aA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115,原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列，pET-GST, PGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-HI-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a,pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His, pET Dsb, pET GST, pET Trx p QE2, pQE9 p QE30,31,32, pQE 40 p QE70 pQE80L p QETirs system pRSET-A pRSET-B p RSET-C p GEX4T-1,-2,-3,5x-1,6 p-1,6 p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinP oi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3, PACYC184, pBR322 ,p UC119 p TYB1, pTYB2, pTYB4, pTYB11 p BIueScri pt SK(+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：PG-KJE8 PGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21( DE3) HB101 ER2529 E2566C2566 MG1655 XL- 10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21 ( AI) BL21(DE3)plysS TG1 TB1 DH5a (pir)Tuner( DE3)BI21 codonplusRIPL Novablue(DE3) Rosetta Rosetta(DE3) Rosetta( DE3)plys Rosetta-gami (DE3)Rosetta-gamiB(DE3) , Rosetta-gamiB( DE3)plysS Orgami(DE3) OrgamiB( DE3) HMS174 (DE3) 植物表达/RNAi 载体农杆菌PBI121,PBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301, p UN1301, pRTL2 , p RTL2-GF P , p RTL2-C FP, p RTL2-R FP , p RTL2-Y FP,p CAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z, 1391Z,2300, 2301,3300,3301, pCAMBIA sup er1300, pCAMBIAsup er1300-GF P,pPZP 212, pPZP 2121, pPZP 212-GF P,p GDG,RNA K 体p ART27, pH ANNIBAL ,p KANNIBAL, pFGC5941, pTCK303, pTRV1, pTRV2,T-DNA插入载体(随机突变体库)pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体p BIG2R HPH 2-GUS-GF P,p BHt1枯草芽抱杆菌表达载体P WB980, pH T43, pHP 13, pHP 43, pBE2, PMUTIN4,pUB110, pE194, pMA5, p MK3, pMK4, pH T304, pH Y300PLK, pBest502, PDG1363,p SG1154, pAX01, pSAS144, pDL, pDG148-stu, pDG641, pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01 ,配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi 基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0, pSilencer 2.1-U6 hygro, pSilencer3.1-H1 hygro, pSilencer 3.1-H1 neo PSilencer4.1-CMV neo, pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi 载体(oligoengine) pSuper-puro RNAi 逆转录病毒载体(clontech) : RNAi-Ready pSIREN-Retro Q, RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen ( Luciferase shRNA Ann ealed Oligo nucleotide) RNAi 慢病毒载体(addgene : pLKO.1哺乳动物表达载体PCDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B , pSecTag2 A, pVAX1 , pBudCE4.1,pTracer CMV2, pcDNA3.1 (-) /myc-His A , pcDNA6-Myc/His B , pCEP4, pIRES, pIRESneo, pIRES hyg3, pCMV-myc, pCMV-HA , pIRES-puro3, pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT , pBIND , pACT-MyoD , pBIND-Id , pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-HybridSystem:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II 哺乳动物诱导表达系统：pOPRSVI , pOPI3CAT , pCMVLacI,GeneSwitchSystem: pSwitch哺乳动物表面展示系统：p Dis play,四环素调控系统(In vitrogen): pcDNA4/TO/Myc-His A , pcDNA4/TO/Myc-His B , pcDNA4/TO/Myc-His C ,pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ , pcDNA6/TR 四环素调控系统(Clontech): pTet-On , pTet-Off , pTRE2,pRevTRE , pRevTet-On , pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc , pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc , pI K B-EGFP,pNFAT-TA-Luc ,pCaspase3-sensQr pAP1 (PMA)-Luc; pGL4.26[luc2 P/minP/Hygro], pGL4.29[luc2 P/CRE/Hygro], pGL4.30[luc2 P/NFA T-RE/Hygro] , pGL4.75;p53-Luc, pAP-1-Luc, pNF-K B-Luc, pSRE-Luc, pFA2-Elk1 , pFC-MEKK , pFR-luc,Gateway系统(invitrogen) pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR , 乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株pN Z8148, pLEISS, pMG36e, pBBR1MCS-5, pBBR1MCS-6, pRV610, pLEM415, pHY3 OOPLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523, pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L. pla ntarum,L.rham no susGG,B.coagula ns’Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infan tis,Lactococcus lactisM17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33, pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215, pJN105, pME6032,Cos 载体pLAFR3,pMP2444 (GFP) , pHY300PLK,pRT102,pRL1063a,转座子载体pUT-mi niT n5, pMGS100, p WHM10, pKC1139, pSET152, pO J260, pP G611.1, pP G612.1腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统(Stratagene : pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ, pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3,配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cell line 腺相关病毒系统(Stratageng : pAAV-MCS , pAAV-RC , pHeIper , pAAV-LacZ , pAAV-IRES-hrGFP , pCMV-MCS ,慢病毒载体:p LVX-DsRed-Mo no mer-N1, pLVX-IRES-ZsGree n1, pLVX-AcGF P1-N1,Le nti6/v 5-EDST-EGF P,pWP XL, FUGW, pLe ntilox 3.7,RNAi-Ready p SIREN-Retro Q,RNAi-Ready p SIREN-Retro Q-ZsGree n,pSUP ER.Retro-GF P/Neo ,pSUP ER-Retro-Neo, pSUP ER.Retro-puro,P LNCXP LNCX2 p MSCV-HYG p MSCV- neo p MSCV- puro p LEGF P-C1 p LOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry 质粒载体。

pSUMO大肠杆菌表达载体说明

pSUMO编号载体名称北京华越洋生物VECT4280 pSUMOpSUMO载体基本信息载体名称: pSUMO质粒类型: 大肠杆菌基因表达高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: T7克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5598 b p5' 测序引物及序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'3' 测序引物及序列: T7t: 5'-‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG-‐3'载体标签: N-‐His; N-‐SUMO载体抗性: 卡那霉素备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达组成型/诱导型: 诱导型病毒/非病毒: 非病毒pSUMO载体质粒图谱和多克隆位点信息其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+) pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。

利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。

本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。

一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。

选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。

2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。

3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。

可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。

4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。

通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。

二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。

这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。

2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。

通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。

3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。

通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。

4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。

将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。

5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。

通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。

大肠杆菌表达载体

pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
西南大学生物技术专业基因工程 14
分泌型融合表达载体----pEZZ18
西南大学生物技术专业基因工程
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分泌型表达载体----pINIII-ompA1
西南大学生物技术专业基因工程
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四、表达产物的纯化
1 、包涵体 (inclusion body) 的纯化：许多情况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胍、尿素和 SDS 溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后就没有活性了，但可作为抗原。 2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内解物的上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
西南大学生物技术专业基因工程 7
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
西南大学生物技术专业基因工程
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2 ）植物 Ac-Ds 转座子双因子插入突变：玉米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因的缺失体，但具两端的反向重复序列。

外源蛋白在大肠杆菌中的表达

外源蛋白在大肠杆菌中的表达一、引言外源蛋白是指不属于宿主生物体自身的蛋白质，通常是由其他生物体合成的蛋白质。

在大肠杆菌中表达外源蛋白已经成为了基因工程和生物技术领域中的一个重要研究方向。

本文将从大肠杆菌表达外源蛋白的原理、方法、策略等方面进行详细阐述。

二、原理1. 大肠杆菌表达系统原理大肠杆菌表达系统是指利用大肠杆菌作为宿主细胞，通过转化外源DNA进入细胞，使其在细胞内得到表达并产生相应的蛋白质。

这个系统包括三个部分：载体、宿主细胞和诱导剂。

2. 质粒载体质粒载体是指一种环状DNA分子，可以携带外源DNA序列并在大肠杆菌中进行复制和表达。

常用的载体有pUC19、pET28a等。

3. 宿主细胞宿主细胞是指被转化了质粒载体的大肠杆菌细胞。

常用的宿主细胞有BL21(DE3)等。

4. 诱导剂诱导剂是指在宿主细胞中引发表达外源蛋白的物质。

常用的诱导剂有IPTG、L-arabinose等。

三、方法1. 克隆外源DNA序列到质粒载体中将外源DNA序列克隆到质粒载体中，形成表达载体。

常用的方法有限制性酶切和连接法、PCR扩增法等。

2. 将表达载体转化到宿主细胞中将表达载体通过热激转化或电转化等方法导入到宿主细胞中，使其在细胞内进行复制和表达。

3. 选择正常表达的克隆通过筛选，选择出正常表达目标蛋白的克隆。

常用的筛选方法有PCR 检测、Western blotting等。

4. 诱导表达目标蛋白在选定的克隆中加入适量的诱导剂，使其开始表达目标蛋白。

通常在温度、时间、浓度等方面进行调节，以得到最佳效果。

四、策略1. 选择合适的载体和宿主细胞根据需要表达的外源蛋白的不同，选择适合的载体和宿主细胞。

例如，如果需要表达带有His标签的蛋白质，可以选择pET28a载体和BL21(DE3)宿主细胞。

2. 优化表达条件通过调节温度、时间、浓度等参数来优化表达条件，以提高目标蛋白的表达量和纯度。

3. 联合表达将多个外源蛋白基因克隆到同一个载体中，使其在同一宿主细胞中进行联合表达。

N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素

第54卷第9期 2021年9月天津大学学报(自然科学与工程技术版)Journal of Tianjin University (Science and Technology )V ol. 54 No. 9Sep. 2021收稿日期：2020-06-20；修回日期：2020-08-03. 作者简介：赵广荣（1966— ），男，博士，教授. 通信作者：赵广荣，**************.cn.基金项目：国家自然科学基金资助项目(31870077).Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31870077).DOI:10.11784/tdxbz202006056N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素赵广荣1, 2，侯亚男1, 2(1. 天津大学化工学院，天津 300350；2. 教育部合成生物学前沿科学中心和系统生物工程重点实验室，天津 300350)摘要：甜菜黄素是安全的植物源水溶性天然色素，主要应用于食品行业．甜菜黄素还具有抗氧化活性和光学特性，在医疗保健、荧光成像等领域具有潜在应用价值．目前，甜菜黄素的主要来源是植物提取分离，但存在甜菜黄素含量低、种类少等问题．本文改造植物P450氧化酶，研发大肠杆菌异源合成甜菜黄素的新方法．首先，对甜菜的P450氧化酶CYP76AD1LL 和P450还原酶(cytochrome P 450 reductase ，CPR )进行N-端截短和改造，研究不同改造序列和表达策略对合成L-多巴的影响．结果表明，截去N-端跨膜序列，利用3种不同N-端序列修饰P450氧化酶，MA 序列修饰CPR (MA-tCPR )，工程大肠杆菌中均能以L-酪氨酸为底物合成L-多巴．其中亲水性2B1序列(MAKKTSS )修饰P450氧化酶，采用双顺反子表达策略优于单顺反子，工程大肠杆菌BDP10合成L-多巴的产量最高，为40.42mg/L ．进一步表达紫茉莉的4，5-多巴双加氧酶基因，构建了工程大肠杆菌BTA11，利用L-酪氨酸为前体，合成了甜菜醛氨酸．最后，在培养基添加3种氨基酸(对氨基苯甲酸、L-组氨酸、L-亮氨酸)和3种胺类化合物(酪胺、吡咯烷、吲哚啉)，工程大肠杆BTA11合成了6种对应的甜菜黄素．研究结果表明，采用N-端改造策略赋予植物P450氧化酶在大肠杆菌中具有催化功能，能合成天然和非天然的颜色多样、结构丰富的多种甜菜素．关键词：细胞色素P450酶；甜菜黄素；大肠杆菌；合成生物学；酶的改造中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：0493-2137(2021)09-0934-08Betaxanthins Bioproduction by Escherichia coli UsingN -Terminal -Modified Plant P450 EnzymeZhao Guangrong 1, 2，Hou Yanan 1, 2(1. School of Chemical Engineering and Technology ，Tianjin University ，Tianjin 300350，China ； 2. Frontier Science Center for Synthetic Biology and Key Laboratory of System Bioengineering(Ministry of Education )，Tianjin 300350，China )Abstract ：Betaxanthins are water-soluble and safe pigments mainly used in the food industry. With rich antioxidantand optical properties ，betaxanthins have potential applications in the fields of health care and fluorescence imaging. Presently ，the main source of betaxanthins is plant extraction and separation ，but the obtained betaxanthin content is low and the betaxanthin varieties are few. In this study ，a new method for the heterologous synthesis of betaxanthins by Escherichia coli was developed by the expression of modified plant P450 oxidase. First ，to study the effects of modified sequences and expression methods on the conversion of L-tyrosine into L-dopa ，beet-derived P450 enzyme CYP76AD1LL and cytochrome P450 reductase (CPR )were truncated and modified at the N-terminal. The results showed that after the truncation of the transmembrane sequences ，all three different N-terminal sequence-modified P450 oxidase co-expressing with the MA sequence-modified CPR (MA-tCPR )successfully catalyzed the conversion of L-tyrosine to L-dopa in E. coli . The engineered E. coli strain BDP10 expressing N-terminal hydrophilic sequence 2B1-2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·935·modified P450 oxidase used in combination with the bicistronic strateg y resulted in the hig hest L-dopa produc-tion(40.42mg/L)，which was higher than that obtained with the monocistronic strategy. Furthermore，a betalamic acid-producing strain was constructed through the co-expression of a 4，5-dopa dioxygenase extradiol gene from Mir-abilis jalapa，which enabled the conversion of L-tyrosine to betalamic acid. Finally，three amino acids(para-aminobenzoic acid，L-histidine，and L-leucine)and three amines(tyramine，pyrrolidine，and indoline)were fed into the fermentation medium with the engineered E. coli strain，and six betaxanthins could be produced. The results show that N-terminal modification can endow plant P450 oxidase with catalytic function，and the resulting strain can synthesize natural and unnatural betaxanthins with various colors and rich structures.Keywords：cytochrome P450 enzyme；betaxanthin；Escherichia coli；synthetic biology；modification of enzymes甜菜黄素是优质天然色素，广泛应用于食品加工中．甜菜黄素还具有抗氧化活性和光学活性，使其在医疗保健、荧光成像等领域具有潜在的应用价值[1].甜菜醛氨酸是甜菜黄素的生色基团，它与不同氨基酸或胺类之间自发席夫碱缩合反应，生成不同的甜菜黄素[2]．甜菜黄素主要存在于甜菜(Beta vulgaris)等石竹目植物中，由于多种组分并存使得单组分甜菜黄素的提取分离工艺复杂、成本高[3]．随着合成生物学发展，构建工程微生物为甜菜黄素的发酵生产提供了可能．在酿酒酵母中共表达大花马齿苋的多巴双加氧酶(PgDODA)分别与CYP76AD5、CYP76AD6或CYP76AD15，在培养基中添加酪氨酸前体，工程酵母合成了甜菜黄素[4].．大肠杆菌是异源合成天然产物的重要底盘细胞，具有生长快、培养简单、成本低廉等优势．最近在大肠杆菌中表达醋杆菌多巴双加氧酶基因，外源添加6种胺类物质，合成了相应的甜菜黄素[5]．本文利用合成生物学与代谢工程手段，对CYP76AD1和P450还原酶(cytochrome P450 reduc-tase，CPR)进行N-端改造(见图1)，与紫茉莉的多巴双加氧酶(DOD)基因共表达，重构和优化了甜菜醛氨酸的生物合成途径，构建了生产甜菜醛氨酸的工程大肠杆菌．补加氨基酸或胺类物质进行发酵，实现半合成多种甜菜黄素．图1工程大肠杆菌合成甜菜黄素代谢途径优化Fig.1Optimization of betaxanthin metabiotic pathway in engineered E. coli·936·天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷第9期1 材料与方法1.1 菌株及质粒对甜菜来源的细胞色素P450氧化酶CYP76AD1 (GenBank HQ656024.1)的突变体CYP76AD1W13L F309L 基因和P450还原酶CPR(GenBank XP_010692385)基因，紫茉莉来源的多巴双加氧酶DOD(GenBank B6F0W8.1)基因进行密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司合成．大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)用于甜菜黄素的半合成．本文构建的载体与菌株如表1所示．表1菌株与质粒Tab.1Strains and plasmids used in this study菌株描述质粒描述E. coli DH5αΔLac U169(Φ80 LacZ ΔM15) pACYCduet-1 pACYCori-P T7；CmRE. coli BL21(DE3) F-ompThsdS(rB-mB-)gal dcm(DE3)pHYN5 pACYC-P T7-CYP76AD1LL-P T7-CPR BDP1 BL21(DE3)，pHYN5 pHYN9 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP2 BL21(DE3)，pHYN9 pHYN10 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP3 BL21(DE3)，pHYN10 pHYN11 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP4 BL21(DE3)，pHYN11 pHYN12 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP5 BL21(DE3)，pHYN12 pHYN13 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP6 BL21(DE3)，pHYN13 pHYN14 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP7 BL21(DE3)，pHYN14 pHYN15 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP8 BL21(DE3)，pHYN15 pHYN16 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP9 BL21(DE3)，pHYN16 pHYN17 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP10 BL21(DE3)，pHYN17 pHYN24 pACYC-P T7-DOD BTA10 BL21(DE3)，pHYN24 pHYN25pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR-P T7-DOD BTA11 BL21(DE3)，pHYN251.2 主要试剂L-氨基酸、L-多巴、酪胺和抗坏血酸购自鼎国生物科技公司；吲哚啉及吡咯烷购自阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇购自康科德科技有限公司；质粒提取试剂盒、限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔；DNA聚合酶购自诺唯赞生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公司；表2所示的PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成．表2PCR引物Tab.2PCR primers引物引物序列 5’→3’ 用途CYP Nc-F CATGCCATGGACCACGCGACCCTGCYP Bm-R CGCGGATCCTTAGTAGCGTGGGATAGGGATTAAT扩增CYP76AD1LL CP R-Nd-F GGGAATTCCATATGGCTTCCTCGACTTCTGACP R-Kp-R CGGGGTACCTTACCAAACATCGCGGAGGT扩增CPRMAC P R-Nd-F GGGAATTCCATATGGCGCGTCGTAGCAATG 扩增MA-tCPR的上游引物MA-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCGCTTTTCTCCCAACAGACCACT 扩增MA-tCYP76AD1L的上游引物17A-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTTTT-CTCCCAACAGACCACT扩增17A-tCYP76AD1L的上游引物2B1-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCGAAGAAAACCTCTTCTCTTTTCT-CCCAACAGACCACT扩增2B1-tCYP76AD1L的上游引物CYPR1-R GGTATATCTCCTT TTAGTAGCGTGGGATAGGGATT 扩增tCYP76AD1L-R1的上游引物CYPR2-R CATTGCTATCTCC TTAGTAGCGTGGGATAGGGATTAAT 扩增tCYP76AD1L-R2的上游引物R1MACPR-F TCCCTATCCCACGCTACTAA AAGGAGATATACC ATGGCGCGTCGTAGCAAT-GACAACAG扩增R1-MA-tCPR的上游引物R2MACPR-F TCCCTATCCCACGCTACTAA GGAGATAGCA ATGGCGCGTCGTAGCAATGACAA-CAG扩增R2-MA-tCPR的上游引物CP R-R CGCCGAGCTCGAATTCGGATCCTTACCAAACATCGCGGAGGT 扩增tCPR的下游引物VBamHI-F TAAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTVNcoI-R CGCCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAAC线性化载体DONd-F GGGAATTCCATATGAAAGGGACATACTATDOKp-R CGGGGTACCTTAGTCCGTTTTTTGAGTAGT扩增DOD 注：N-端修饰序列用下划线表示，RBS序列用红色表示．2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·937·1.3 表达载体构建本文主要采用PCR扩增、酶切和连接方法，构建的基因表达载体如表1所示．利用开源网站TMHMM Server v. 2.0(http：// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，对CYP76 AD1LL 和CPR进行跨膜区预测，截去膜结合序列，将N-端改造序列设计在引物中．PCR扩增截短改造的两个基因片段，分别克隆到pACYCDuet-1的两个启动子之后，得到单顺反子表达载pHYN9、pHYN10、pHYN11．将RBS序列设计在引物中，采用重叠延伸PCR，将MA-CYP76AD1L、R1和MA-tCPR串联起来．利用同源重组试剂盒，将MA-CYP76AD1L-R1-MA-tCPR与线性化的载体pACYCDuet-1进行组装，得到双顺反子质粒pHYN12．相似地，构建其他双顺反子表达载体pHYN13～17．PCR扩增DOD基因，用酶切连接的方式构建到pACYCDuet-1或pHYN14的第2个T T7启动子后，得到表达载体pHYN24、pHYN25．1.4 培养基与发酵方法LB培养基：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨 10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min．M9培养基：Na2PO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，调节pH值至7.2，121℃灭菌20min．发酵培养基配制：向25mL的M9培养基加入灭菌的1mol/L MgSO4 125µL，1 mol/L CaCl2 2.5µL，抗生素20mg/L，2.5mmol/L抗坏血酸，5g/L葡萄糖.发酵：取过夜活化的菌液接种到含有25mL 发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、220r/min下培养3～4h至OD600值为0.8～1.0．加入0.5mmol/L IPTG诱导，同时加入500mg/L L-酪氨酸，30℃、220r/min培养24h．发酵结果取3次重复的平均值(标准偏差)．1.5 检测与分析使用Primaide高效液相色谱(HPLC)测定L-多巴、L-酪氨酸、甜菜醛氨酸和甜菜黄素等代谢物．质谱检测使用带有ACQ UITY UPLC system的Synapt G2-Si Q-TOF质谱仪(Waters)．在500μL样品中加入等体积的1mol/L盐酸进行溶解，离心后上清液用孔径0.22µm水系滤膜过滤，用于HPLC分析检测L-多巴、L-酪氨酸．使用4.6mm×250mm C18色谱柱，流动相组成为95%甲醇-5%水-1.5%磷酸，流速1mL/min；紫外检测波长230nm，进样量10µL．标准曲线至少利用4、5个点标定，相关系数R2大于0.99．发酵液样品直接离心后上清液用孔径0.22µm 水系滤膜过滤，用于HPLC检测甜菜醛氨酸及甜菜黄素．使用4.6mm×250mm C18色谱柱；流动相组成是A液为0.1%甲酸水，B液为0.1%甲酸甲醇；等梯度洗脱，0～30min，(95%A∶5%B)～(45%A∶55%B)；流速1mL/min，进样量10µL；甜菜醛氨酸检测波长405nm，甜菜黄素检测波长470nm．甜菜醛氨酸的质谱检测使用BEH C18(2.1mm×100mm)1.7µm粒径色谱柱；流动相组成是A液为0.1%甲酸水，B液为0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱，0～3min，(95%A∶5%B)～(5%A∶95%B)；3～4min，5%A∶95%B；4～5min，95%A∶5%B；流速0.25mL/min，进样量2µL，柱温45℃．2 结果与讨论2.1 N-端改造对L-多巴合成的影响来源于甜菜的CYP76AD1的双突变体CYP76AD1W13L F309L(标记为CYP76AD1LL)更有利于甜菜黄素合成[6]．首先对CYP76AD1LL和CPR共表达的大肠杆菌BDP1进行发酵，但没有检测到L-多巴(图2(a))．这与在酵母中表达的结果相反[6]，表明未改造的CYP76AD1LL在大肠杆菌中表达不适合.推测可能的原因是大肠杆菌细胞缺乏P450酶锚定的膜系统，使其没有功能．截除P450酶的膜结合序列，使其表达在细胞质中，有利于实现催化功能，该策略已经应用合成大豆苷元[7]、氧化紫杉烷等[8]产物．通过生物信息学分析，发现CYP76AD1LL的第7～29位氨基酸为跨膜区域，从第31～37是一段脯氨酸残基聚集区域，对蛋白质的正确折叠起着关键作用，其后是蛋白的C-端催化功能域[9]．于是，将处于膜外的N-端1～22位氨基酸进行截除，由于第13位的亮氨酸被截去，标记为tCYP76AD1L．CPR的N-端第26～48氨基酸残基为跨膜区，处于膜外，与C-端催化功能域较远，因此对N-端1～48位氨基酸进行截除，标记为tCPR．在对目标蛋白截短的同时，N-端起始序列的合理设计有助于在大肠杆菌内实现酶的催化功能[10].蛋白质序列第2位氨基酸为丙氨酸(Ala)时，更有利于P450酶在大肠杆菌内的翻译[11]．人工设计的疏水性N-端序列MALLLA VF(标记为17A)和亲水性N-端序列MAKKTSS(标记为2B1)分别实现了牛的CYP17A[12]和CYP2B亚家族酶[13]的大肠杆菌表达．用这两段序列修饰的植物源P450酶在大肠杆菌·938·天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷第9期中实现催化功能[8,14]．由于CPR起辅助作用，只设计了一种N-端改造方式，对tCYP76AD1L设计了3种N-端改造方式(图2(a))．利用低拷贝pACYCDuet-1 构建单顺反子表达载体，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得工程大肠杆菌BDP2-4(图2(b))．（a）CYP76AD1和CPR的N-端改造设计（b）单顺反子表达载体示意图2N-端改造P450酶和CPR的单顺反子表达载体Fig.2Monocistronic expression vector of N-terminal-modified P450 and CPR 对菌株BDP1-4添加前体L-酪氨酸，发酵24h后，HPLC检测结果如图3所示．3种N-端改造P450酶均产生了正效应，在菌株BDP2-4的发酵液中检测到了L-多巴．使用2B1序列(MAKKTSS)的菌株（a）菌株BDP1和BDP4发酵液及标准品的高效液相色谱（b）tCYP76AD1L N-端改造蛋白单顺反子菌株发酵合成L-多巴图3N-端改造P450酶和CPR的单顺反子表达对L-多巴合成的影响Fig.3Effect of monocistronic expression of N-terminal-modified P450 and CPR on L-dopa productionBDP4合成L-多巴最多，产量为28.56mg/L．其次是使用MA序列，菌株BDP2的L-多巴产量为9.33mg/L，而17A序列(MALLA VF)的菌株BDP3合成L-多巴最少，为1.05mg/L．本研究中，亲水性2B1序列及MA的改造效果比17A序列要好，这与文献[8]报道的相反．在大肠杆菌合成氧化紫杉烷时，使用17A序列改造CYP725A4的效果优于序列MA和2B1．这可能是不同P450酶需要进行不同N-端改造，以获得最佳效果．2.2 双顺反子调控L-多巴合成在植物中P450酶与CPR比例约为15∶1，即1个CPR可以对应多个P450酶[15]．在工程酿酒酵母异源表达P450酶时，降低CPR的表达强度，提高了青蒿酸的产量[16]．为了弱化tCPR的表达，在MA-tCPR基因之前设计核糖体识别序列R1 (AAGGA-GATATACC)或R2(GGAGATAGCA)[17]，使tCPR和tCYP76AD1L共用一个启动子，构建了多个双顺反子表达载体pHYN12～17，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得工程大肠杆菌BDP5-10(图4(a))．菌株BDP5-10的发酵结果如图4(b)所示，双顺反子表达策略的L-多巴产量均高于单顺反子．在tCYP76AD1L蛋白改造方式相同的条件下，核糖体识别序列R1和R2的影响差异不明显．tCYP76AD1L蛋白N-端改造为2B1时，菌株BDP7和BDP10的L-多巴产量最高，菌株BDP10达到40.42mg/L，比单2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·939·顺反子表达菌株BDP4产量提高41.53%. tCYP76AD1L蛋白N-端改造为MA时，菌株BDP5和BDP8的产量分别为23.96mg/L和26.80mg/L，是单顺反子表达菌株BDP2的2.57～2.87倍．双顺反子表达模式有利于合成更多的L-多巴，且P450的N-端改造与CPR的表达模式有组合效应．最佳组合模式的菌株BDP7和BDP10，合成L-多巴的产量是在酵母中产量的10倍[6]．（a）双顺反子表达载体的设计（b）双顺反子表达菌株合成L-多巴的产量图4双顺反子表达对L-多巴合成的影响Fig.4Effects of bicistronic expression of N-terminal-modified P450 and CPR on L-dopa production 2.3 甜菜醛氨酸的合成在酵母细胞中共表达紫茉莉来源的多巴双加氧酶DOD与CYP76AD1时，合成甜菜醛氨酸[18]．为了验证在大肠杆菌中是否有功能，将DOD的表达载体pHYN24导入BL21(DE3)中，得到菌株BTA10，添加L-多巴，进行发酵．结果如图5(a)和(b)所示，培养液变成显著的黄色．取上清液进行HPLC液相色谱检测，18.9min出现特征新峰．进行质谱分析，质核比为212.06，确认为甜菜醛氨酸．这表明DOD在大肠杆菌细胞中能催化L-多巴合成甜菜醛氨酸．利用酶切连接的方式将DOD基因克隆建到质粒pHYN14的第2套T T7启动子后，得到表达载体pHYN25，并导入BL21(DE3)细胞，获得菌株BTA11，添加L-酪氨酸，进行发酵．如图5(c)所示，菌株BTA11发酵上清液呈现出黄色．进行HPLC分析，有甜菜醛氨酸生成，表明BTA11能以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸．（a）菌株BTA10以L-多巴为底物合成甜菜醛氨酸的液相色谱（b）菌株BTA10以L-多巴为底物合成甜菜醛氨酸的质谱（c）菌株BTA11以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸图5工程大肠杆菌合成甜菜醛氨酸Fig.5Bioproduction of betalamic acid using engineeredE. coli2.4 甜菜黄素的合成甜菜醛氨酸能与氨基酸或胺类自发席夫碱缩合反应，生成甜菜黄素．为此，在工程大肠杆菌BTA11的培养基中，添加前体L-酪氨酸的同时，添加不同氨基酸或胺类化合物，进行发酵．如图6(a)所示，添加吲哚啉和对氨基苯甲酸(PABA)，发酵液呈红色，而添加L-组氨酸、L-亮氨酸和酪胺、吡咯烷的发酵液为黄色．对上清液进行HPLC分析，均出现新的特征·940· 天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷第9期峰，生成了对应的甜菜黄素(图6(b ))，表明菌株BTA11具有合成多种甜菜黄素的能力．对氨基苯甲酸和吲哚啉的芳香环结构产生了附加的电子共振系统，促进了吸收光谱中的深色偏移[19]，使生成的甜菜黄素呈现红色，而不是天然的黄色．（a ）菌株BTA11添加6种氨基酸和胺类物质发酵液上清的颜色甜菜黄素的特征峰用“*”标注图6 工程大肠杆菌BTA11合成多种甜菜黄素Fig.6 Bioproduction of betaxanthins using engineered E.coli BTA113 结语微生物发酵是取代天然产物植物提取的新兴方法，本研究在大肠杆菌中构建立了一个甜菜素生物合成平台．优化了植物P450酶CYP76AD1LL 和CPR 在大肠杆菌中的表达，合成了L-多巴，并与多巴双加氧酶DOD 共表达，合成了甜菜黄素的生色骨架甜菜醛氨酸．利用该生物合成平台，外源添加氨基酸和胺类，实现了天然和非天然甜菜黄素的异源微生物合成.N-端截短和改造，有利于植物P450酶和还原酶在大肠杆菌中实现功能．对CPR 截去跨膜序列后，改造为MA-tCPR ；对CYP76AD1LL 截短后，使用 N-端亲水性序列(MAKKTSS )优于疏水性序列(MALLLA VF )和MA 序列，改造为2B1-tCYP76AD1L ，合成L-多巴的效果最好．首次实现了在大肠杆菌中P450酶CYP76AD1催化L-酪氨酸合成L-多巴，最高产量达28.56mg/L ．CPR 的表达方式对P450酶的功能有显著影响．使用双顺反子表达策略，弱化CPR 的表达，有利于强化P450酶催化功能．两种核糖体识别位点序列AAGGAGATATACC (R1)和GGAGATAGCA (R2)均可用于双顺反子下游基因的表达，L-多巴产量最高可达40.42mg/L ，比单顺反子表达提高了41.53%．共表达多巴双加氧酶DOD ，构建甜菜醛氨酸工程大肠杆菌BTA11，实现了以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸．通过在发酵培养基中添加6种氨基酸和胺类物质，合成了6种颜色不同的甜菜黄素．参考文献：［1］ Contreras-Llano L E ，Guerrero-Rubio M A ，Lozada-Ramirez J D ，et al. 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