山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

动物医学进展，２０１４，３５（１２）：１０－１３Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重ＰＣＲ检测方法的建立　收稿日期：２０１４－０４－１６　基金项目：西南民族大学大学生创新创业训练计划（２０１３１０６５６０１３）　作者简介：亢宁宁（１９９１－），男（回族），河南沁阳人，本科，主要从事动物病原生物学研究。

＊通讯作者亢宁宁，刀筱芳，冯旭飞，虎　啸，马晓楠，杨发龙＊（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都６１００４１） 摘　要：为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重ＰＣＲ方法，本研究采用２对特异性引物，对退火温度和引物浓度比进行了优化，成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重ＰＣＲ方法。

结果显示，该方法具有很好的特异性，仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增，而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增；该方法对两种病原的检测限分别为３２ｐｇ和５０ｐｇ，与单独ＰＣＲ相同；２６份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为２３．１％，多杀性巴氏杆菌的检出率为２６．９％。

所建立的双重ＰＣＲ具有特异性好、灵敏度高的特点，为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种；多杀性巴氏杆菌；双重ＰＣＲ中图分类号：Ｓ８５２．６２文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００１０－０４ 呼吸道疾病是影响山羊养殖业的重要疾病之一，主要引起山羊群体性发病、死亡或生产性能下降，给山羊养殖户造成了严重的经济损失。

其中，山羊支原体山羊肺炎亚种（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍｓｕｂｓｐ．ｃａｐｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｃｃｐ）可引起山羊传染性胸膜肺炎，该病以严重的纤维素性胸膜肺炎为主要特性，是一种高度传染性、致死性的山羊呼吸道传染病，发病率可达到１００％［１－２］，该病在我国青海、甘肃等地发生并广泛流行［３－５］，近年报道其可引起藏羚羊的胸膜肺炎［６］。

多杀性巴氏杆菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌ－ｔｏｃｉｄａ）是存在于羊上呼吸道的条件致病菌，在长途运输、营养不良、过度拥挤以及其他支原体或病毒感染等条件作用下，迅速增殖而引起山羊肺炎的发生［７］。

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌可混合感染亦可继发感染［８－９］，给疾病的诊断和治疗造成困难。

传统的细菌分离培养及鉴定费时费力，此外，支原体在体外培养较为困难，且生长周期相对较长，一般需要１周～２周，因此不常作为常规手段用于病原的鉴定、疾病的诊断及流行病学调查。

而ＰＣＲ技术以其快速、灵敏等优点，已逐渐成为病原鉴定和疾病诊断的常规方法。

针对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌，Ｗｏｕｂｉｔ　Ｓ［１０］分别建立了特异性ＰＣＲ方法，并已广泛用于这两种病原的检测及其感染的诊断［６，１１］。

由于山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌均可引起山羊肺炎，且可以混合感染，因此有必要建立一种能够同时检测该两种病原的双重ＰＣＲ方法，从而为生产中快速、准确检测这两种病原及其感染的鉴别诊断和流行病学调查提供一种新手段。

１　材料与方法１．１　材料１．１．１　菌株及临床样品　丝状支原体山羊亚种Ｙ－ｇｏａｔ株、丝状支原体山羊亚种ＰＧ３株、无乳支原体ＰＧ２株、山羊支原体山羊肺炎亚种Ｃ８７－１株及绵羊肺炎支原体Ｙ－９８株均购自中国兽医药品监察所；金黄色葡萄球菌ＳＷ０７株、大肠埃希菌０１３株、沙门菌、多杀性巴氏杆菌及溶血性曼氏杆菌均为西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室分离鉴定并保存。

用于临床检测的２６份山羊鼻腔棉拭子均采集于四川省成都市青白江区某山羊场。

用于样品采集的山羊均有不同程度的呼吸道症状。

１．１．２　主要试剂　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ及１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ均为ＴａＫａＲａ公司产品；蛋白酶Ｋ为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；琼脂糖为英国ＯＸＯＩＤ公司产品；ＤＮＡ分子量标准Ｍａｒｋｅｒ　Ｉ和Ｇｏｌｄｖｉｅｗ核酸染料为天根生化科技有限公司产品。

１．２　方法１．２．１引物信息　本研究中用于双重ＰＣＲ建立的引物直接采用Ｗｏｕｂｉｔ　Ｓ［１０］和Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　Ｋ　Ｍ等［１１］所设计的山羊支原体山羊肺炎亚种特异性引物Ｍｃ－ｃｐ－Ｆ／Ｍｃｃｐ－Ｒ和多杀性巴氏杆菌特异性引物ＫＭＴ１／ＫＭＴ２，具体信息如表１。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表１　引物信息Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　引物名称　Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ产物大小／ｂｐＰｒｏｄｕｃｔ　ｓｉｚｅＭｃｃｐ－Ｆ　５′－ＡＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧ－３′３１６Ｍｃｃｐ－Ｒ５′－ＴＡＣＴＡＴＧＡＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＣＡＡ－３′ＫＭＴ１　５′－ＡＴＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧ－３′４６０ＫＭＴ２　５′－ＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＣＣＡＣ－３′１．２．２　ＤＮＡ的提取　在提取ＤＮＡ前，对不同的样品进行了相应的前处理：对于鼻腔棉拭子，浸入１ｍＬ无菌水中并反复挤压，将悬液经１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃上清，收沉淀；对于支原体培养物，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，收集沉淀；对于其他细菌培养物，则１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ后收集沉淀。

随后，采用常规酚－氯仿法提取基因组ＤＮＡ，并置于－２０℃保存。

１．２．３　双重ＰＣＲ反应体系及反应条件优化　将两对引物分别按不同比例混合进行引物浓度比例的优化，然后分别以４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８和６０℃为退火温度进行优化，所有ＰＣＲ均采用下列反应体系和条件进行扩增：１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　２μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２１．５μＬ，１０ｐｍｏｌ／μＬ上、下游引物（以不同的引物比），５Ｕ／μＬ　Ｔａｑ酶０．２μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，灭菌去离子水补足２５μＬ。

反应条件为：９５℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，退火（按上述温度梯度）３０ｓ，７２℃４５ｓ，共进行３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。

以扩增产物电泳条带亮度大、无非特异性扩增条带和引物二聚体少为标准选择最佳引物比例和退火温度。

１．２．４　双重ＰＣＲ的特异性评价　采用上述优化反应体系和反应条件，分别以山羊支原体山羊肺炎亚种Ｃ８７－１株、多杀性巴氏杆菌、丝状支原体山羊亚种Ｙ－ｇｏａｔ株、丝状支原体山羊亚种ＰＧ３株、无乳支原体ＰＧ２株、绵羊肺炎支原体Ｙ－９８株、金黄色葡萄球菌ＳＷ０７株、大肠埃希菌０１３株、沙门菌和溶血性曼氏杆菌ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增。

１．２．５　双重ＰＣＲ的敏感性评价　从山羊支原体山羊肺炎亚种Ｃ８７－１和多杀性巴氏杆菌的纯培养物中分别提取全基因组ＤＮＡ。

采用核酸蛋白检测仪测定其浓度，并进行１０倍系列稀释，将以每个稀释度的两种细菌ＤＮＡ等量混合作为模板进行ＰＣＲ扩增。

同时，将上述不同稀释度的模板分别进行单独ＰＣＲ检测。

１．２．６　双重ＰＣＲ对临床样品的检测　提取临床所采集的２６份鼻拭子的全基因组ＤＮＡ，同时应用所建立的双重ＰＣＲ方法和单独ＰＣＲ方法分别进行检测，比较两者的检出率。

２　结果２．１　双重ＰＣＲ条件优化结果经优化，最终获得双重ＰＣＲ反应的最佳退火温度为５２℃，山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌引物的最佳浓度为１０ｐｍｏｌ／μＬ和１０ｐｍｏｌ／μＬ。

２．２　双重ＰＣＲ的特异性分别以山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的基因组ＤＮＡ单独或以两者等量混合后作为模板进行双重ＰＣＲ扩增。

同时以其他多种常见非目的病原菌ＤＮＡ为模板，进行双重ＰＣＲ扩增。

结果表明，以单一病原ＤＮＡ为模板时，分别得到３１６ｂｐ或４６０ｂｐ的单一条带；将２种病原ＤＮＡ混合后作为模板，能得到预期大小的２个条带。

而对丝状支原体山羊亚种、无乳支原体、绵羊肺炎支原体、大肠埃希菌、沙门菌及金黄色葡萄球菌等均无扩增（图１）。

经３次重复试验，此结果稳定。

Ｍ．ＤＮＡ标准；１．山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌ＤＮＡ混合物；２～１１．多杀性巴氏杆菌、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠埃希菌０１３、沙门菌、金黄色葡萄球菌ＳＷ０７、丝状支原体山羊亚种Ｙ－ｇｏａｔ、丝状支原体山羊亚种ＰＧ３、绵羊肺炎支原体Ｙ－９８、无乳支原体ＰＧ２、溶血性曼氏杆菌；Ｎ．无模板对照Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．ＤＮＡ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍｓｕｂ－ｓｐ．ｃａｐｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ａｎｄ　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；２－１１．Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ　ｓｕｂｓｐ．ｃａｐｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｅ．ｃｏｉｌ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｍｙｃｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ．ｃａｐｒｉ　Ｙ－ｇｏａｔ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｍｙｃｏｉｄｅｓ　ｓｕｂｓｐ．ｃａｐｒｉ　ＰＧ３；Ｍｙ－ｃｏｐｌａｓｍａ　ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｙ－９８；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ　ＰＧ２；Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ；Ｎ．Ｎｏ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ图１　双重ＰＣＲ特异性试验Ｆｉｇ．１　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｄｕｐｌｅｘ　ＰＣＲ１１亢宁宁等：山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重ＰＣＲ检测方法的建立２．３　双重ＰＣＲ的敏感性分别对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的基因组ＤＮＡ进行１０倍系列稀释，将各稀释度的两种ＤＮＡ分别进行等量混合后作为模板，并进行双重ＰＣＲ和单独ＰＣＲ检测。

结果表明，双重ＰＣＲ对山羊支原体山羊肺炎亚种ＤＮＡ的最低检测限为３２ｐｇ，对多杀性巴氏杆菌的最低检测限为５０ｐｇ，其敏感性与采用一对引物的单独ＰＣＲ相同（图２）。

Ｍ．ＤＮＡ标准；１～７．山羊支原体山羊肺炎亚种ＤＮＡ浓度为１．６×１０－１μｇ／μＬ～１．６×１０－７μｇ／μＬ，多杀性巴氏杆菌ＤＮＡ浓度为２．５×１０－１μｇ／μＬ～２．５×１０－７μｇ／μＬ；Ｎ．无模板对照Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－７．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍｓｕｂｓｐ．ｃａｐｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＤＮＡ　ｗｅｒｅ　１．６×１０－１μｇ／μＬ－１．６×１０－７μｇ／μＬ　ａｎｄ　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ＤＮＡ　ｗｅｒｅ　２．５×１０－１μｇ／μＬ－２．５×１０－７μｇ／μＬ图２　双重ＰＣＲ的敏感性Ｆｉｇ．２　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｕｐｌｅｘ　ＰＣＲ２．４　临床样品的检测从患病山羊采集的２６份鼻拭子中提取总ＤＮＡ，然后分别用所建立的双重ＰＣＲ和现有的单独ＰＣＲ进行检测。