病原物的分离培养与纯化(讲解)

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实验二植物病原菌的组织分离

实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。

二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。

病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。

（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。

期间融化培养基备用。

（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。

在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。

（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。

（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。

（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。

倒置于25—28℃恒温箱内培养。

（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。

一植物病原真菌的分离培养及纯化技术11[可修改版ppt]

灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌Βιβλιοθήκη 过滤灭菌化学灭菌、以及辐射灭菌等。
高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
滤膜孔径主要有0.22 µm和0.45µm两种。过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
5、斜面、平板培养基的制作
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
二、真菌分离
植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培养基。
三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。
或三角瓶中。
➢试管分装时，使用玻璃漏斗。
➢装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。

植物病原真菌的分离培养及纯化技术详解演示文稿

切取组织的大小要适宜，一般可将较大的组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭菌水洗过以后培养。
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植物病原真菌的组织分离的技术与步骤：
1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成 5mm×5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。
注: 选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
般3～5分钟。消毒后用无菌水冲洗3～4次。
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第22页，共59页。
（3）次氯酸钠NaClO3 由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目
前多改用次氯酸钠. 消毒所用的浓度一般是3%-5%的水溶液，消毒时
间5-15分钟。幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死
其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗8
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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二、真菌分离
植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
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第12页，共59页。
真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。

一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。切取组织的大小要适宜，一般可将较大的组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌化学灭菌、以及辐射灭菌等。高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。

病原物的分离与及培养

病原物的分离与及培养病原物的分离与培养一、实验目的1．学会制作普通的培养基。

2．掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。

二、讲解要点柯赫氏法则（Koch's Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。

其基本步骤如下：1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。

全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。

包括培养基的制作和病原物的分离、培养及纯化。

（一）培养基的制作真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。

不同类群的微生物对营养条件的要求不同。

因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。

培养基就是按照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用人工的方法配制的基质。

1．常用培养基的配制植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。

（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基这是使用最频繁的培养基，简称PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌的培养。

配方为：马铃薯200g 葡萄糖（蔗糖）10～20g 琼脂17～20g 水1000mL配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。

）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。

再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。

测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。

实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。

植物病原细菌的分离

植物病原细菌的分离、纯化及鉴定1实验目的及意义植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。

2实验材料及准备2.1 实验材料：新发病的植物组织2.2 培养基准备（LB培养基）：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%，pH7.0-7.2，121℃灭菌20 min，备用。

2.3 实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿（Φ9cm），斜面培养基，灭菌水，1% NaClO，打火机。

3 实验方法及步骤3.1 植物样品的采集选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入纸袋保存或邮寄，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d），长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。

3.2 发病组织的显微检查准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切取约2×4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜(4×，10×)检查，看到白色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的菌体，证明的确为细菌性病害。

3.3 病原物的分离和培养选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干；（以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1×4mm的大小，1%的次氯酸钠消毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min，让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB平板上划线。

28℃温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、菌落大小、颜色、形态。

3.4 病原物的纯化和保存3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。

若仍然生长不纯，则需多次纯化。

病原实验报告

病原物的分离培养和纯化病原物的分离和纯化摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在pda培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。

关键词：分离培养、炭疽病、pda培养基、灭菌前言柯赫氏法则(koch’s rule)又称柯赫氏假设(kochs postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。

如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。

诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。

鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。

有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。

但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。

如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。

柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性【1】状与接种物相同”。

如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。

但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。

侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家都应能熟练地运用。

柯赫氏法则同样也适用来对非侵染性病害的诊断，只是以某种怀疑因子来代替病原物的作用，例如当判断是否缺乏某种元素而引起病害时，可以补施某种元素来缓解或消除其症状，即可确认是某元素的作用。

1. 材料、仪器与用具1.1实验材料柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、pda培养基（自制）1.2仪器用具超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 2. 内容与方法2.1培养基的配制“培养基按成分及对成分了解程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方法【2】不同。

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。

一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。

所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。

病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。

灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。

在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。

但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。

通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。

此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

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4.1.1 斑点病病原真菌的分离
从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用
70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液
中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移臵在琼脂培养基平板上培养。
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4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离
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从根茎维管束组织
分离病菌，可先将寄主
病部表面用70％酒精擦
抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长
的环境，从而得到纯菌株。
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（一）目的意义
观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而作出诊断。
同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的腐生性真菌。因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。
一真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌专业资料4专业资料522制作步骤?马铃薯洗净去皮称200g切块条?1000ml水煮沸30min?用双层纱布滤去薯块?加入1520g琼脂加热熔化再加20g葡萄糖?待完全溶解后趁热用双层纱布再过滤?补水并定容到1000ml分装于三角瓶或试管中?塞好棉塞并包上牛皮纸扎紧后高压灭菌
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平臵、凝固即成。
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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3、培养基的分装
根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管
或三角瓶中。

病原菌的分离培养和纯化

普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。

(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。

二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。

为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。

植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。

最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。

病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。

（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。

(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。

(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。

(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。

（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。

(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。

植物病原微生物的分离与纯化

植物病原微生物的分离与纯化一、实验目的1、掌握培养基的制备方法，学习灭菌与消毒的操作方法2、掌握分离与纯化病原微生物的基本原理与方法二、实验原理植物病原微生物的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

植物患病组织内的微生物，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原微生物的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真微生物与其它微生物相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原微生物于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病微生物的分离培养。

植物病原真微生物的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

三、实验材料、试剂芒果炭疽病叶、酒精灯，剪子，镊子，牛肉膏蛋白胨，培养皿，小烧杯，大烧杯，灭菌水，75%酒精瓶、0.1%升汞瓶四、实验步骤1、培养基的配置取无菌平皿，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

2、植株挑选用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。

任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

3、分离①病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下②取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟。

③消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。

④用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。

用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。

每皿4——5块，排放均匀。

⑤将培养皿倒置，于23—25℃培养⑥3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。

植物病理学实验十四植物病原菌物的分离和培养图文

在10ml 培养基中加3滴25%的乳酸，可使大部分细菌受到抑制。
培养环境；分离材料；病原物的类型
2.4 病原真菌的纯化
保证所用菌种是从单个细胞或单个孢子繁殖而来的纯种。
• 稀释法பைடு நூலகம்
A 水洋菜平板稀释法一将纯净的水洋菜培养基，倒入培养皿中凝固，然后在灭
菌的载玻片上放入一滴水，加入孢子，配成浓度适当的悬浮液，用三角涂抹玻棒，蘸上孢子悬浮液，涂抹于水洋菜培养基表面，然后用低倍显微镜擦培养皿的反面检查孢子，用蜡笔做一个记号，再用灭菌后的刀子或接菌针将这一块培养基切下，移置在适宜的培养基上生长。操作过程在接菌台上，保持无菌状态。
水洋菜平板稀释法二
将菌种上产生的分生孢子用灭菌水洗下，稀释到每滴在低倍显微镜下每视野大约有25个孢子左右。取灭过菌的试管，一支含有一毫升无菌水，另一支含有9毫升WA培养基（大约45℃）。给无菌水的试管加一滴孢子悬浮液(在低倍镜下，每滴孢子悬浮液在视野含有大约25个孢子)，然后把孢子悬浮液到入含有WA培养基的试管中，振荡后倒入灭过菌的培养皿中，等凝固后，用低倍显微镜擦培养皿的反面检查孢子，用蜡笔做一个记号，再用灭菌后的刀子或接菌针将这一块培养基切下，移置在适宜的培养基上生长。
•干针挑取法：干针挑取法：即用细缝衣针在低倍镜下直接挑取单个孢
子。此方法最适用于分离开的真菌孢子，如黑粉菌的厚坦孢子、锈菌的夏孢子及一些担子菌的担子孢子。先将孩子放在灭菌的载玻片上，用食指和大拇指握住缝衣针，在低倍镜下检视，当针尖接触孢子时，孢子即离开载玻片而附着于针尖上，然后移殖培养。
适合于分生孢子较大，颜色较深的孢子分离。
2.2 组织表面消毒 (surface sterilization) 和消毒剂

病原物的分离培养和纯化

病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。

该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。

设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。

长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。

在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。

关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。

然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。

分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。

通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。

1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。

1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。

病原物分离培养实验报告

四川农业大学《普通植物病理学》实验论文病原物的分离培养和纯化病原物的分离和纯化摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在PDA培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。

关键词：分离培养、炭疽病、PDA培养基、灭菌前言柯赫氏法则(Koch’s Rule)又称柯赫氏假设(Koch's postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。

如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。

诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。

鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。

有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。

但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。

如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。

柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同”【1】。

如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。

但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。

侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家都应能熟练地运用。

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义;分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术..一方面;在一个新的病害研究中;通过分离与培养获得病原物的纯培养;完成柯氏法则;以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环侵染、病程等等..所谓病原物的分离;即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养;即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上;从而获得其纯培养..病原物的分离与培养;需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养..－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念..灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子..消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体;在植物病理学实验中;需要进行纯培养;不能有任何杂菌污染;因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌..消毒与灭菌的方法很多;一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法..一热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类..1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关..在菌体受热时;当环境和细胞内含水量越大;则蛋白质凝固就越快;反之含水量越小;凝固越慢..因此;与湿热灭菌相比;干热灭菌所需温度高160～170℃;时间长1～2 h..但干热灭菌温度不能超过180 ℃;否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦;甚至引起燃烧..干热灭菌使用的仪器是烘箱..干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种..火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等;无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌..涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌..通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气160～170℃进行灭菌..此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌..进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤;以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板;以防包装纸烤焦起火；在升温过程中;如果红灯熄灭;绿灯亮;表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前;切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂..2 湿热灭菌1 高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内;0.1MPa;121℃保持15～30 min进行灭菌..时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化;以达到彻底灭菌..这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等;也可用于玻璃器皿的灭菌..2 常压蒸汽灭菌在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法..对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌..这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行;也可用普通蒸笼进行灭菌..由于常压;其温度不超过100℃;仅能使大多数微生物被杀死;而芽孢细菌却不能在短时间内杀死;因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌;达到彻底灭菌的目的..常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内;每天加热100℃;30 min;连续3 d;第一天加热后;其中的营养体被杀死;将培养物取出放室温下18～24 h;使其中的芽孢发育成营养体;第二天再加热100℃;30 min;发育的营养体又被杀死;但可能仍留有芽孢;故再重复一次;使彻底灭菌..二过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法;—均会被热破坏;因此采用过滤除菌的方法..应用最广泛的过滤器有：1 蔡氏过滤器该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属银或铝漏斗组成;分上、下两节..过滤时;用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间;然后将溶液置于滤器中抽滤..每次过滤必须用一张新滤板..根据其孔径大小;滤板分为3种型号：K型最大;作一般澄清用；EK滤孔较小;用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小;可阻止大病毒通过..使用时可根据需要选用..2 微孔滤膜过滤器这是一种新型滤器;其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜..微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成..出口处可连接针头;入口处可连接针筒..使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间;旋紧盖盒;当溶液从针筒注入滤器时;此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面;从而达到除菌的目的..根据待除菌溶液量的多少;可选用不同大小的滤器..此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分..但由于滤量有限;所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌..实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm;但若要将病毒除掉;则需更小孔径的微孔滤膜..微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：①组装、灭菌将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中;旋紧..压平;包装灭菌后待用0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min..连接..将灭菌滤器的入口在无菌条件下;以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上;将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中..②压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中..滤毕;将针头拨出..压滤时;用力要适当;不可太猛太快;以免细菌被挤压通过滤膜..提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染;过滤时应避免各连接处出现渗透现象..三辐射灭菌紫外线灭菌是用紫外线灯进行的..波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力;其中以260 nm的杀菌力最强..在波长一定的条件下;紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比..紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联;从而抑制了DNA的复制..另一方面;由于辐射能使空气中的氧电离成O;再使O2氧化生成臭氧O3;或使水氧化生成过氧化氢H2O2..O3和H2O2有杀菌作用..紫外线穿透力不大;所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌..注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用;对皮肤有刺激作用;故不能直视紫外线灯光;更不能在紫外线灯光下工作..紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜..此外;采用60Co-γ射线灭菌;也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜;各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌..γ射线灭菌的最大优点是穿透力强;可在厚包装完好条件下灭菌..四化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法..能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂;如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能;使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂;如磺胺类及大多数抗生素等..化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关..植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液来苏尔、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等..消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术;而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值..根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法..附: 高压灭菌1、目的要求学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围;学习高压蒸汽灭菌的操作方法..2、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内;通过加热;使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽..待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀;继续加热;此时由于蒸汽不能溢出;而增加了灭菌器内的压力;从而使沸点增高;得到高于100℃的温度;导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时;锅内冷空气的排除是否完全极为重要..因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压;所以;当水蒸气中含有空气时;在同一压力下;含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度..灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变..例如含糖培养基用0.06 MPa、112℃灭菌15 min;但为了保证效果;可将其他成分先行121℃灭菌20 min;然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液..又如盛于试管内的培养基以0.1MPa;121℃灭菌20 min；即可;而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa、122℃灭菌30 min..实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种..其结构和工作原理相同;本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例;介绍其使用方法..全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后;加温、放气、灭菌、干燥可一次完成;使用方法可参照厂家说明书..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯葡萄糖培养基PDA..仪器与用具培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等..4、操作步骤1 首先将内层锅取出;向外层锅内加入适量的水;使水面与三角搁架相平为宜..提示：切勿忘记加水;同时加水量不可过少;以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故..2 放回内层锅;并装入待灭菌物品..提示：注意不要装得太挤;以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果..三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触;以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞..3 加盖并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内..再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓;使螺栓松紧一致;勿使漏气..4 用电炉加热并同时打开排气阀;使水沸腾以排除锅内的冷空气..待冷空气完全排尽后;关上排气阀;让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升..当锅内压力升到所需压力时;调节电炉控温旋钮;维持压力至所需时间..本实验用0.1Mpa l21.5℃;20 min灭菌..提示：灭菌的主要因素是温度而不是压力..因此;锅内冷空气必须完全排尽后;才能关上排气阀;维持所需压力..5 灭菌所需时间到后;切断电源;让灭菌锅内温度自然下降;当压力表的压力降至“0”后;打开排气阀;旋松螺栓;打开盖子;取出灭菌物品..提示:压力一定要降到“0”后;才能打开排气阀开盖取物..否则会因锅内压力突然下降;使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口;造成棉塞沾染培养基而发生污染..6 将取出的灭菌培养基放入25℃温箱培养48 h;经检查若无杂菌生长;即可待用..二、培养基的制作1、目的要求了解培养基的配制原理;掌握培养基的制备方法..2、基本原理在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基..培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养;用人工方法配制而成的营养基质..其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等..微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好;因此;对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围..－般而言;真菌调节到微酸;细菌调节到微碱..培养基的种类很多;不同的微生物所需要的培养基不同..依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种..固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂;半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂..琼脂agar 起凝固作用;一般微生物均不能分解利用..根据营养物质来源的不同;培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类..天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成;如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等..半合成培养基中既有一些天然的有机物质;又有一些成分简单或明确的化合物..如常用的马铃薯葡萄糖培养基PDA、肉汁胨培养基NA等..合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的;无任何成分不明确的物质;常用于研究微生物的生理生化性状;如查氏Czapek培养基等..根据培养基用途不同;可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等..在植物病理学研究中;最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基;主要用于分离培养病原真菌..在培养基配制完之后;必须经过灭菌;以便彻底杀死其中原有的一切微生物..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯..试剂葡萄糖、琼脂等..仪器与用品高压蒸汽灭菌锅、pH试纸或酸度计、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等..4、操作步骤PDA培养基马铃薯葡萄糖培养基马铃薯去皮200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ;自然pH..在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖;这样配制的培养基也称为PSA培养基..1 称量称量去皮马铃薯200 g;葡萄糖20 g;琼脂15～20 g..提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量;质量好的15 g就够了;质量差的应适当增加..另外;在夏天气温较高时;适当增加用量..2 将马铃薯切成小块;放入锅中;加水1000 ml;煮沸30 min..用纱布滤去马铃薯残渣..3 将马铃薯滤液放回锅中;加入琼脂;加热熔化..提示：在琼脂熔化的过程中;需要用玻璃棒不断搅拌;并控制火力不要使培养基溢出或烧焦..4 加入葡萄糖葡萄糖溶解后;加入适量的水以补充加热过程中损失的水分;定容至1000 ml..提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度;如1 000 ml、2000 ml等;在定容时直接将水加至已标记的刻度即可..5 分装根据不同的实验目的;可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内..分装试管;其量为管高的1／5;灭菌后制成斜面..分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜..6 加塞在管口或瓶口塞上棉塞..棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花;棉塞可过滤空气;防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发;故在植物病理学研究工作中普遍使用..正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合;过紧时妨碍空气流通;操作不便；过松则达不到滤菌的目的;且棉塞过小往往容易掉进试管内..正确的棉塞头较大;约有1／3在外;2／3在试管内..分装过程中注意不要使培养基沾染在管瓶口上以免浸湿棉塞;引起污染..7 包扎加塞后;将试管用线绳捆好;再在棉塞外包一层牛皮纸;以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞;其外再用一道线绳扎好..用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等..8 灭菌将上述培养基以0.1MPa;121℃;高压蒸气灭菌20 min..9 搁置斜面将灭菌的试管培养基竖置冷至50℃左右以防斜面上冷凝水太多;将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上;搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜..培养基经灭菌后;必须放在37℃温箱培养24h;无菌生长者方可使用..PDA培养基一般不需要调pH..对于要调节pH的培养基;一般用pH试纸测定其pH..如果培养基偏酸或偏碱时;可用l mol／L NaOH 或l mol／L HCl溶液进行调节..调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液;防止局部过酸或过碱破坏培养基成分..5、流程图培养基配制高压灭菌培养观察三、病原菌的分离培养和纯化1、目的要求1 了解分离与纯化微生物的基本原理及方法..2 掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术..3 掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法..2、基本方法植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种..最常用的方法是组织分离法;而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离..病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用;在有些情况下也采用稀释分离法..为了获得分离菌的纯培养;必须要进行分离菌的纯化;纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法..3、材料、仪器与用具3.1 材料1 稻瘟病叶、病节、病穗颈Pyricularia oryzae..2 柑桔炭疽病Colletotrichum gloeosporioides..3 黄瓜灰霉病Botrytis cineria..4 番茄灰霉病果Botrytis cinerea..5 黄瓜菌核病果Sclerotinia sclerotiorum..6 黄瓜细菌性角斑病叶Pseudomonas syringaepv．1achryrnans ..7 水稻白叶枯病叶Xanthomonas campestris pv．oryzae ..8 白菜软腐病叶Erwinia carotovora subspp．carotovora..3.2．培养基PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等..3.3．仪器与用品超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等..4、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法其步骤为：1 取灭菌培养皿一个;置于湿纱布上;在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名..提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手;操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时;呼吸要轻;不要说话..2 用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴可减少细菌污染;然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中;每皿倒10～15 ml;轻轻摇动使之成平面..凝固后即成平板培养基..提示：加入25％乳酸1～2滴;可减少平板上出现污染细菌菌落..除乳酸外;在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长;也是常用的方法..加青霉素20μg／m1可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B5.0μg／ml..可以抑制G-细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／m1可以抑制大部分细菌的生长..除了氯霉素可在灭菌前加入外;其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右以手背触三角瓶感到烫;但尚可以忍耐为宜时加入..倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领;不必在火焰上方;一般很少污染..3 取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料;选择典型的单个病斑;用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处;切取小块每边长3～4 mm病组织数块..提示：选择新患病的组织作为分离的材料;可以减少腐生菌混入的机会..腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生;因此;一般斑点病害应在临近健组织的部分分离..4将病组织放入70％酒精中浸3～5s后;按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min 也可使用其他表面消毒剂;如植物组织柔嫩;则表面消毒时间宜短；反之则可长些..然后放入灭菌水中连续漂洗三次;除去残留的消毒剂..提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡;减少表面张力;70％的酒精亦用于表面消毒;处理的时间较短一般数秒至l min升汞溶液消毒的时间因材料而异;可自30s至30min不等;一般情况下;需时间3～5 min..5 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上;每皿内放4～6块..提示：在将病组织小块移放到平板表面之前;应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水;以大大减少病组织附近出现细菌污染..6 将培养皿倒置放入25℃左右恒温箱内培养..一般3～4 d后观察待分离菌生长结果..7 若病组织小块上均长出较为一致的菌落;则多半为要分离的病原菌..在无菌条件下;用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上;在25 ℃左右恒温箱内培养;数日后;观察菌落生长情况;如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种;便可置于冰箱中保存..提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外;还要在显微镜下检查;进一步确定..如果是对未知病原菌的组织分离;则要将长出的菌落分别转出;通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌..在组织分离工作中;如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实;在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上;完成分离工作..2. 稀释分离法1 取灭菌培养皿三个;平放在湿纱布上;编号;并注明日期、分离材料及分离人姓名..2 用灭菌吸管吸取灭菌水;在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml..3 用移植环蘸一滴孢子悬浮液;与第一个培养皿中的灭菌水混合;再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中;混合后再移三环到第三个培养皿中..4 将熔化并冷却到45～50℃的培养基;分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染;也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸;摇匀;凝固;要使培养基与稀释的菌液充分混匀..提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好;过热易将病原菌烫死而使分离失败;过冷则倒入培养皿中后难以形成平板;不利于分离..5 将培养皿翻转后置恒温箱25℃中培养;数日后观察菌落生长情况..6 挑菌将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取;接种到斜面培养基上;置25℃左右培养..待菌长出后;检查菌是否单纯;若有其他菌混杂;就要再一次进行分离纯化;直到获得纯培养..二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用..在进行分离之前;首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断;即经过镜检确认有喷菌现象以后;才对该病组织作分离工作..稀释分离法是最经典的标准分离法;方法同上述真菌分离..除去上述稀释分离法以外;较为方便的是划线分离法：1 预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中;凝成平板后;翻转放在30℃恒温箱中2～4 h;使表面无水滴凝结..也可凝成平板后直接使用..2 将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min;再用无菌水换洗3次后;放在灭菌培养皿中的灭菌水中;用灭菌玻棒研碎;并让组织碎块在水中浸泡20～60 min;让细菌释放到灭菌水中..3 用灭菌的接种铒;接种环；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线;尽量不要把平板表面划破..划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼;冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线..灭菌后再划第三次线..提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要;这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大..4 用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后;翻转培养皿;放在26～28℃恒温箱中培养..1～3 d后观察有无细菌生长;在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的..5 仔细挑取病原菌的单菌落;并移植到斜面培养基上..同时;再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离;经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致;并与典型描述的特征相一致时;即表明已获得纯培养..最好要经过连续三次单菌落的分离;才能确保纯化..三真菌、细菌培养性状。

病原物的分离培养与纯化(讲解)

实验二植物病原菌的组织分离

一植物病原真菌的分离培养及纯化技术11[可修改版ppt]

植物病原真菌的分离培养及纯化技术详解演示文稿

一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

病原物的分离与及培养

植物病原细菌的分离

病原实验报告

病原物的分离与培养

一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

病原菌的分离培养和纯化

植物病原微生物的分离与纯化

植物病理学 实验十四 植物病原菌物的分离和培养 图文

病原物的分离培养和纯化

病原物分离培养实验报告

病原物的分离与培养

植物病理学实验十四植物病原菌物的分离和培养图文