带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究_彭金美 (1)

633 bp 720 bp 761 bp 977 bp
序列 Sequences
TCTGAATTCTGCTCCGCTGGGCCACGAACACC GGATCTAGAAGCTCAGGTAGCGCGACGTGTTG TTACTGCAGGCATGCCGGCATGGAGGTGACGGAGTC GAGAAGCTTCCGCGCGGTAAAAGTAGTACGG GTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GTCGACATAACTTCGTATAGCATACATTAT ACGAAGTTATATGCAGTGAAAAAAATGC CCAGTCCCAGGCCACCGTGAAGTG ATCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAAC ATGGATATCGCCACCATGGTGAGCAAG CGCAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCC GTCATGGCGGAAACAGCGGTTATC GACTATCCTGTCGTCATGGAAGTG TAATGAAGCGTGCGCCTGTTATTC GCATCAGGGTGCTGGCTTTTCAAG
拟在 TK 基因中插入 BAC 质粒，通过一步同源重组 方法获得带 BAC 质粒的重组伪狂犬病毒，为深入研 究 PRV 的细菌人工染色体奠定基础。
1 材料和方法
1.1 病 毒 和 细 胞 PRV 弱 毒 疫 苗 株 Bartha K61 以 及 Vero 细胞均由本实验室保存。 1.2 质 粒 和 菌 株 试 验 中 所 用 的 质 粒 pUC19、 pEGFP-N1、pBeloBACII 和菌株 E.coli DH5α 均由本 实验室保存。 1.3 工具酶和试剂 各种 DNA 限制性内切酶、带 GC buffer 的 LA Taq DNA 聚合酶、Klenow fragment、 T4 DNA ligase 均购于 TaKaRa 公司；磷酸钙转染试 剂盒购于 Promega 公司。 1.4 引 物 设 计 根 据 已 发 表 的 PRV 基 因 组 序 列 (GenBank 登录号 NC006151)分别针对 TK 基因和 gB基 因设计合成了 3 对引物 TKAU/TKAL，TKBU/TKBL， gBU/gBL；其他用于本试验的引物序列见表 1，斜体 部分为酶切位点。引物由上海博雅生物公司合成。
(1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 / 猪传染病研究室， 黑龙江 哈尔滨 150001； 2. 中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200232；3. 华中农业大学，湖北 武汉 430070)
摘 要：本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株 Bartha K61 株的部分 TK 基因作为同源
Key words: PRV; Bartha K61 strain; BAC; recombinant virus
*Corresponding author
收稿日期：2008-07-08 基金项目：863 项目(2006AA10A204)；国家科技支撑计划(2006BAD06A18)；973 项目(2005CB523200) 作者简介：彭金美(1976-)，女，湖北京山人，博士研究生，助理研究员，主要从事猪病毒性疾病的研究. * 通信作者：E-mail：gztong@
rv-PRVBAC 得到了稳定遗传。本研究成功获得了带 BAC 质粒的重组伪狂犬病毒 rv-PRVBAC，为进一步开展 PRV
的细菌人工染色体的构建奠定了基础。
关键词：伪狂犬病毒；Bartha K61 株；BAC；重组病毒
中图分类号：S852.659.1
文献标识码：A
文章编号：1008-0589(2009)01-0010-06
共转染 Vero 细胞，利用同源重组在 Bartha K61 株的 TK 基因中插入了 BAC 质粒和绿色荧光蛋白筛选标记，经过
11 轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带 BAC 质粒的重组伪狂犬病毒 rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定
等方法对重组伪狂犬病毒 rv-PRVBAC 的生长特性进行研究，结果发 现带 有 BAC 质 粒 及 筛 选 标 记 的重 组 病 毒
Construction of a recombinant pseudorabies virus with BAC plasmid insertion in the TK gene
PENG Jin-mei1, WANG Yu1,3, TIAN Zhi-jun1, ZHOU Yan-jun1, CHEN Jin1, AN Tong-qing1, TONG Guang-zhi1,2*
rv-PRVBAC 在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒 Bartha K61 株相比没有明显差别，说明大的基因片段的插入没
有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒 rv-PRVBAC 在 Vero 细胞上盲传 18 代，其绿色荧光蛋白仍能够稳定
表 达 ，通 过 PCR 鉴 定 可 以 检 测 到 插 入 的外 源 片 段 和 插 入 位 点 两侧 的 病 毒 基 因 序 列 ，表 明 所 获 得 的 重 组 病 毒
传统的构建重组病毒的方法是通过同源重组， 这种方法不仅重组效率低，而且转染产生的病毒往 往是亲本毒和重组病毒的混和体，纯化过程比较费 时、费力。如果能够建立病毒的感染性分子克隆， 在此基础上进行一些加工和修饰研究将是一个非常 理想的技术平台。对于基因组较小的病毒来说，通 过将病毒基因组克隆到普通的质粒载体就可以实现， 而 像 PRV 这种基因组长达 145 kb 的 病 毒 ，就 必 须 通 过 容 量 大 的 酵 母 人 工 染 色 体 (Yeast artificial chromosome，YAC)或细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome， BAC) 来 实 现 。 比 较 而 言 ， BAC 具 有 嵌合、重排频率低，外源 DNA 能 较稳定遗 传 ，转 化 效 率 高 等 优 点 受 到 了 更 广 泛 的 关 注 和 应 用 。 BAC 载体是建立在大肠杆菌 F 因子基础上的，天然的 F 因子是超螺旋闭环的 DNA 分 子，在宿主细胞中 只 有 1～2 个拷贝，自身大小约 100 kb，编码近百种蛋 白质。人工构建的 BAC 载体，只保留了与 F 因子自 主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相 关的基因，具有容量大、遗传特性稳定、易于操作 等优点，被广泛应用于大分子病毒的克 隆 。CMV、 MCMV、HSV-1、VAC、MDV 等都已经有成功获得 病毒的细菌人工染色体的报道 。 [4-8] 理论上，基因组 在复制过程中能够形成自身环化的复制中间体的病 毒都可以构建成病毒的细菌人工染色体。PRV 基因 组在病毒感染细胞后不久就在细胞核中由两端相互 融合而环化，形成复制中间体，接着以滚环复制的 模式进行复制，复制产生的 DNA 经裂解 后包装 成 病 毒 粒 子 ，因 此 PRV 也 适 合 于 构 建 细 菌 人 工 染 色 体，在 PRV 的细菌人工染色体的研究方面，目前只 有 Smith 等分别以 gG、Us9/Us2 基因的间 隔 区 为 插 入 位点获 得 了 PRV 的 细 菌 人 工 染 色 体 。 [9-10] 本 研 究
Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200232, China; 3. Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract: In this study, a transfer vector pUCTK-EGFP-BACII was constructed by inserting the EGFP expression cassette and BAC plasmid pBeloBACII into two homologous sequences of TK gene of PRV Bartha K61 strain. The recombinant virus (rvPRVBAC) was obtained by co-transfecting the transfer vector and PRV genome into Vero cell, followed by 11 passages of plaque purification based on EGFP expression. The rv-PRVBAC was shown to contain BAC plasmid and had similar growth profile in vitro as its parental virus Bartha K61, indicating the large fragment of BAC plasmid insertion in the TK gene didn't influence the replication of rv-PRVBAC in cell culture. The virus remained stable after 18 passages on Vero cell. The recombinant virus rvPRVBAC reported here could serve as foundation for further study on bacterial artificial chromosome of PRV.
(1. Division of Swine Infectious Diseases, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute of Chinese