细胞传代 SOP Cell C-003

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。

当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。

经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。

2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。

2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。

2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。

2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。

细胞传代操作步骤及注意事项

细胞传代操作步骤及注意事项细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。

当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。

因此，细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。

这一过程就叫传代。

细胞传代作为一种常规的实验操作，不但可以扩大细胞培养的数量，同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

所以为了让细胞保持在对数生长期，维持细胞旺盛的分裂能力，这时候就需要进行细胞传代。

细胞传代要在严格的无菌条件下进行，并且根据不同细胞采取不同的方法：☑贴壁生长的细胞用消化法传代；☑部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代；☑悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打传代。

上次讲了细胞复苏操作，今天来讲讲细胞传代的操作（适用于贴壁细胞的传代培养）！细胞复苏流程图细胞传代流程图01细胞传代前准备➡实验开始前，将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台，紫外线照射30min。

➡将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

➡倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。

02胰蛋白酶/EDTA消化➡弃去旧培养基，PBS洗去残留的旧培养基，重复洗两次。

注意：贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。

这一步的目的是为了去掉残余的培养基，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。

➡弃去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面（消化时间视具体细胞而定）。

➡显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。

SOP-SC-003-01组织样本RNAlater处理操作规程

上海生物样本库最佳实践规范及标准操作流程文件汇编（第二版）2010年5月上海生物样本库质量管理体系文件文件名称组织样本RNAlater处理操作规程编号 SOP-SC-003-01 批准人批准日期实施日期组织样本RNAlater处理操作规程1.目的规范组织样本的采集后进行RNAlater处理的操作。

2.适用范围适用于组织样本采集后进行RNAlater处理的操作流程。

3.定义和术语3.1组织样本组织样本是指由捐赠者提供的，专业人员采集的组织，包括肿瘤、病变组织和其它对照组织（包含近癌组织、癌旁组织、正常组织等）。

3.2 RNAlaterRNAlater是一种样品储存液，采样后将样品浸入这种溶液中，RNAlater可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解。

4.职责4.1样本管理员对切割的组织块进行RNAlater处理。

5.设备和器材5.1个人防护装备手套、口罩、实验防护服、护目镜及其它相关防护装备。

5.2容器无菌容器。

5.3操作台专用取材台。

5.4试剂RNAlater试剂。

6.主要流程6.1组织样本采集的过程参见《组织样本采集操作规程》中的具体流程。

6.2进行RNAlater处理的组织块厚度应小于0.5cm。

6.3在手术切除后尽快将组织样本浸没入装有RNAlater溶液的冻存管或其他保存容器中，RNAlater体积应至少是组织块体积的5-10倍，容器的大小应满足组织块完全浸没在RNAlater中。

6.4浸泡在RNAlater中的组织样本应放置于4℃的冰箱中过夜。

不同RNAlater 试剂操作应根据厂商给出的建议使用方法进行。

6.5过夜后将容器取出并贴上标签，转运储存在-20℃冰箱中，储存的过程和要求参见《样本储存控制程序》和《组织样本储存操作规程》。

7.相关文件《组织样本采集操作规程》 SOP-SC-002-01《样本储存控制程序》 SOP-SC-014-01《组织样本储存操作规程》 SOP-SC-015-018.参考标准与文献Biorepository Protocols, Australian Biospecimen Network, 2007Common Minimal Technical Standards and Protocols, WHO2008 Best Practices for Repositories·Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research, ISBER, 2008 Best Practices for Biospecimen Resources, National Cancer Institute, 2007。

细胞培养传代及冻存操作规程

细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。

②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。

⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。

其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。

SOP-003现场5S管理规定

1.目的：
通过5S的教育实施，保持办公场所、服务现场特别是服务设施处于清洁、有序的状态，提升企业形象，提高工作效率，使质量有保障。

2.范围:
公司内的所有从事对质量有影响的工作人员和工作环境。

3.定义:
3.1 整理(SEIRI)：物品集中归类
将工作场所的所任何物品区分为有必要和没有必要的,常用和不常用的,除有必要和常用的留下来外,其它都清除掉.。

3.2整顿(SEITON): 物品定位定量
把留下来的必要用的适量物品依规定位置摆放整齐并加以标示.
3.3清扫(SEISO): 定期保养打扫.
将工作场所内看得见与看不见的地方清扫干净,以保持工作场所干净,亮丽.
3.4清洁(SEIKETSU): 环境整洁有序.
维持前面3S的成果.
3.5素养(SHITSUKE): 养成良好习性.
遵守作业规则,培养主动积极的精神.
4.职责
4.1行政部：负责各部门新进员工的5S教育，并制订<5S年度稽核计划表>，及<5S检查表>，并按计划的安排依据检查表的内容进行各单位进行稽核，并开出<5S问题点改善一览表>给相关单位进行改善及追踪结案。

4.2各单位：各部门的相关管理人员利用早会（或晚会）对员工经常性地进行5S教育并实，并配合行政部5S相关工作，及问题点的矫正与预防措施报告的回复。

6. 相关文件
无
7.相关记录
7.1〈5S年度稽核计划表〉7.2〈5S稽核检查表〉
7.3〈5S问题点改善一览表〉
8.附件
无。

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。

可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。

首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。

细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。

而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。

一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。

最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。

细胞传代标准化步骤

细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。

（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。

SOP-PM-003标签和说明书的使用销毁规程

XXXXXX制氧有限公司工作标准
目的：建立标签和说明书的使用、销毁规程的文件。

范围：适用于生产车间内、外包装的标签、说明书。

责任：内、外包装操作人员、QA、车间主任。

内容：
1．使用
1.1标签、使用说明书按批指令向仓库计数领用，领用人与使用人签名并做好标签、使用说明书发放、使用记录。

1.2标签、使用说明书领用后暂存的标签专用柜内（外包所用标签和使用说明书）。

1.3标签应分别打印批号、生产日期、有效期后使用。

1.4操作人员使用时应检查核对，挑出有破损、污迹、变形、字迹不清的标签或使用说明书。

1.5无破损的未打印批号的标签、说明书计数退回仓库。

1.6标签、使用说明书在专用柜内存放时应上锁，专人管理。

1.7标签、使用说明书应叠放整齐、规范。

2．销毁
2.1操作结束后进行清场时销毁那些破损、有污迹、字迹不清的标签、说明书，置于塑料袋内。

2.2已打印批号等的标签不得退回仓库，也一并销毁。

2.3标签销毁前应进行物料平衡计算，标签使用数、破损数及剩余数之和等于领用，确保无误后，方可销毁。

2.4销毁时应计数，并在批记录上记录。

2.5销毁时必须在QA监督下销毁。

并做好标签、使用说明书销毁记录。

印有标签、使用说明书内容图案的包装按标签管理。

细胞传代过程及注意事项

细胞传代过程及注意事项
细胞传代是一种实验室中常用的技术，通过将培养细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿，使细胞恢复生长。

细胞传代的步骤一般如下：
1. 选择好培养基和培养皿。

培养基应当根据实验需要进行选择，一般为普通培养基或特殊培养基，培养皿应该选择防止氧化的培养皿，如玻璃、金属、塑料等。

2. 将细胞活化，并尽快用无菌操作法处理细胞。

在活化之前，需要检查培养细胞的情况，如果检测出来有病毒污染，则应立即处理，以避免病毒对后续实验造成影响。

3. 分离细胞。

将培养基中的细胞分离出来，一般使用0.25-0.05%的胰蛋白酶溶液，但也可以根据实验需要选择不同的分离液。

4. 传代细胞。

将分离的细胞添加到新的培养皿中，然后放置于37℃的培养箱中，细胞传代完成。

传代时应注意事项：
1. 细胞传代过程中，应保持操作环境无菌，以防止细胞污染。

2. 分离细胞时，应尽量减少细胞损伤，以确保细胞处于活性状态。

3. 在添加分离细胞时，应小心操作，以防止细胞受到外界冲击而死亡。

4. 传代细胞时，应检查培养皿的清洁度，确保无污染物。

QC SOP003-QC各类仪器的校正

1. 目的：建立QC各类检验仪器的校正程序，保证各类仪器的正常运行。

2. 范围：QC使用的各类检验仪器。

3. 责任者：QC主任及检验员对本SOP的实施负责。

4. 程序：4.1 QC检验所用的各类检验仪器应定期校正，自校周期见下表：如因特殊情况，对测试工作有妨碍时，除按上表规定的校正周期进行校正外，可在使用前再行校正，以保证测试的准确性。

4.2 可见/紫外分光光度计的校正：4.2.1 吸光度的准确度：可用重铬酸钾的硫酸溶液来检定。

取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合表中的规定。

4.2.2 杂散光的检查：可按下列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。

4.2.3 按SOP-QC-008规定开启可见/紫外分光光度计，将溶液置仪器中检测，在规定波长下的吸收系数或透光率应符合上表的规定。

4.3 高效液相色谱仪的校正：4.3.1 流动相流量：用一支量筒接收流动相，比较设定的流量与实际流量，误差应≤±1%。

4.3.2 梯度洗脱比例：用两支量筒盛流动相A、B，经洗脱一定时间后，测量两支量筒中流动相减少的量，计算后与设定的洗脱比例一致，若不一致，其误差应≤±1.0%。

4.3.3 系统适用性试验：每一品种测试时均应进行系统适用性试验，并符合相应规定。

4.4 旋光仪的校正：精密称取基准葡萄糖约10g，置100ml量瓶中，加水适量与氨试液0.2ml，溶解后用水稀释至刻度，摇匀，放置10分钟，在25℃时依法测定，比旋度应为+52.5°～+53.0°。

4.5 熔点仪的校正：4.5.1 升温控制：开启机器后升温，观察设定升温速度，应与实测升温速度一致。

4.5.2 用熔点标准物质测定熔点与已知熔点比较：选择表下中已知熔点的对照品3种以上，按熔点测定法进行测定，观察测定熔点与已知熔点的误差。

细胞传代培养

细胞继代培养1. 前言1.1 细胞生长至高密度时，即须收集细胞，分殖至新的培养瓶中，其稀释比例依细胞种类而异。

1.2 收集细胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、离心处理等，处理方法依细胞种类而异。

1.3 Trypsin-EDTA为收集吸附型细胞常用之方法。

Trypsin为胰蛋白酵素，其作用为分解细胞与瓶壁之附着蛋白， EDTA为chelating agent，其作用为去除Ca2+、Mg2+等离子，trypsin与EDTA二者共同作用，可使附着之细胞自瓶壁脱落。

除了trypsin-EDTA，亦可使用cell scraper(细胞刮勺)刮落细胞。

1.4 Trypsin-EDTA作用时间勿太久，否则可能对细胞造成伤害或死亡。

敲拍培养瓶不可太过猛烈，避免对细胞造成伤害或造成培养瓶裂痕而污染。

2. 材料：2.1 Dulbecco's phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free2.2 trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na)：若为大体积包装，建议将其以少量分装于无菌试管中，保存于-20℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

使用前放在37℃水槽中回温。

2.3 新鲜培养基2.4 无菌吸管/离心管/培养瓶3. 步骤：3.1 附着型细胞(adherent cell)3.1.1 吸掉旧培养液。

3.1.2 用Dulbecco's phosphate-buffered saline洗涤细胞一至二次。

3.1.3 加入trypsin-EDTA溶液(1ml/T-25 flask, 2ml/T-75 flask)：3.1.3.1 方法一：37℃或室温作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量之新鲜培养基，与脱落之细胞或细胞团块混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。

细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一: 细胞传代培养材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等1、步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（SKOV-3）2、打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中, 细胞成梭形连接, 贴壁良好）, 弃旧培养基, PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入, 然后放平培养瓶, 使贴壁细胞与trypsin充分接触, 置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长, 以免损伤细胞）。

4.往培养瓶中加入1640 1~2ml, 随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中, 离心1000 r/min, 5min。

5.弃上清液, 加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装, 按1:2~3传代, 每瓶4~5ml。

倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形, 细胞间隙等距）, 标记。

7、放入CO2培养箱中培养, 第二天观察生长状况。

总结: 1.在用离心机时, 看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。

2.在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后, 须知用少量培养液清洗一下培养瓶, 并将清洗液移入离心管中。

3、每取用一个容器, 拧开或者拧上盖子时, 注意在酒精灯上旋转一圈。

另外, 记住用酒精棉球经常擦拭台面。

4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中, 动作轻柔, 避免产生气泡等。

实验二: 细胞冻存材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1.打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

细胞传代标准操作规程

细胞传代标准操作规程-细胞传代培养SOP（消化法）1. 传代前准备：1.1 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

1.5 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

1.6从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

1.7打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

2. 胰蛋白酶-EDTA消化：2.1 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

3. 吹打分散细胞：3.1吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.3平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

4. 分装稀释细胞：4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。

注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。

最后要做好标记。

5. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。

传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。

SOP-CK-003产品留样管理制度

制作部门仓库XXXXXXXXX有限公司文件编号SOP-CK-003生效日期2014.02.10产品留样管理制度版本号 A修订日期页次1/11、目的为确保公司产品质量，便于对每批产品质量状况的可追溯提供客观依据2、范围适用于检验合格后产品的留样和观察。

3、职责：检验员收集、考察样品，留样管理员管理样品，质量主管负责对留样管理工作的监督、检查。

4、产品留样4.1、常规留样：成品均需每批作常规留样，原料首次进货（包括改版后的首次进货）必须留样，常规留样为留样备查品，作为样品检验出现异常、产品在贮存期间或销售过程中出现异常时复检用样。

4.2、长期留样4.2.1首次生产品种的首三批作长期留样，其余正常生产品种不同规格每年留三批作长期留样。

4.2.2生产工艺、方法变动的供应商时，作长期留样4.2.3更新设备或任何变动可能引起内在质量变化时，作长期留样。

4.2.4长期留样检验周期及项目4.2.4.1一般按0、12、24、36、48个月的检验周期全检观察，直到产品有效期后一年。

4.2.4.2检验项目：按产品要求的物理性能、化学性能。

5、留样数量与环境要求5.1、留样数量：常规留样一般应不低于一次全检量的1倍；长期留样根据样品性质和留样时间确定，一般不低于一次全检量的5倍；特殊情况下根据各品种不同、采购量少而另外制定。

5.2 环境要求留样柜存放于通风、干燥、避光处，条件与库房基本一致，室内有温湿度计。

5.3 样品的接收：检验员将样品交留样管理员办理样品交接，填写《收样记录》5.4 样品保存审批制定制作部门仓库XXXXXXXXX有限公司文件编号SOP-CK-003生效日期2014.02.10产品留样管理制度版本号 A修订日期页次1/1 成品留样的包装形式应与市场销售的最小包装相同。

每个留样柜内的品名、规格、批号、来源、留样数量、编号及留样日期应贴在标签上，并易于识别，同时在《留样登记表》上登记。

6、贮存期限6.1 成品：永久保存。

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。

第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。

第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。

第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。

确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。

第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。

培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。

细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。

细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。

第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。

定期检查细胞的形态和生长状态。

第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。

确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。

第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。

冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。

细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。

细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。

降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。

第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。

定期检查液氮罐的液位和温度。

第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。

检查培养箱、显微镜等设备是否正常。

第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。

快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。

细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。

离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。

细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。

传代细胞的冻存与复苏SOP

1. 目的规范细胞的保存与复苏方法。

2. 范围各种细胞的保存与复苏3. 职责3.1.质量管理部：负责本程序的起草。

3.2.质量管理部QC人员：负责本程序的操作。

3.3.总经理：负责本程序的审批。

4. 定义无5. 引用标准无。

6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1. DMEM培养基6.1.2. 细胞消化液6.1.3. 二甲基亚砜6.2. 仪器设备低速离心机、液氮罐6.3. 器械、用具细胞冻存管、小试管7. 流程图无8. 内容8.1. 细胞保存8.1.1. 将细胞按常规进行消化。

8.1.2. 将消化好的细胞加入小试管中。

8.1.3. 500～1000rpm离心10分钟资料整理8.1.4. 倒掉上清，加入已配制好的细胞保存液中（含10%二甲基亚砜的细胞生长液）8.1.5. 轻轻吹打将细胞悬起，倒入细胞冻存管中。

8.1.6. 做好标记（包括细胞名称、细胞代数、冻存日期）。

将冻存管放入带绳的纱布袋中。

8.1.7. 将纱布袋放入4℃冰箱中预冷2小时。

8.1.8. 再放入-20℃冷冻柜中预冻2小时。

8.1.9. 然后放入液氮中。

做好记录。

在绳上做好标记。

8.2. 细胞的复苏8.2.1．配制细胞生长液8.2.2．准备一杯40℃左右的温水8.2.3．将准备复苏的细胞管从液氮中取出快速放入40℃左右的温水，使其以最短的时间融化。

8.2.4．500～1000rpm低速离心10分钟。

8.2.5. 倒掉上清，用已配制好的细胞生长液将细胞悬起。

8.2.6．转入细胞培养瓶中。

37℃培养。

8.2.7．于次日细胞贴壁后，换掉液体。

9. 注意事项9.1．随时注意观察液氮罐中液氮液面，少于三分之一时及时添加。

9.2．从液氮中取出细胞时，注意不要冻伤。

9.3．把握细胞慢冻快融的原则，细胞复苏后的存活率比较高。

10. 附录及派生记录10.1. 无11. 相关文件无12. 修订记录。

细胞传代标准操作规程

细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。

这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。

在一代中，细胞倍增3～6次。

细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。

（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

将实验所需培养基置37℃下预热。

3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。

4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。

细胞培养传代步骤

细胞培养传代步骤下面是细胞培养传代的一般步骤：1.准备传代所需的材料和设备细胞培养需要一系列的材料和设备包括无菌培养基、细胞培养器皿、细胞培养酶/胰酶等。

2.准备新的培养皿使用消毒或灭菌方法对新的培养皿进行处理。

常见的培养皿有培养瓶、培养皿、96孔板等。

消毒方法包括紫外线辐射、酒精擦拭或高温高压灭菌。

3.滴加细胞培养酶/胰酶将细胞培养酶/胰酶溶液滴加到培养皿中，以去除细胞附着在培养皿上的细胞外基质。

酶的浓度和作用时间可以根据细胞类型的不同进行调整。

4.监测细胞的去附着程度将培养皿放置在显微镜下，并观察细胞的去附着程度。

当大部分的细胞离开培养皿表面时，说明细胞已经准备好进行传代操作。

5.停止细胞酶的作用加入足够的预温的无血清培养基来停止细胞酶的作用。

继续向培养皿中加入足够的无血清培养基，将细胞进行悬浮，使细胞较容易分散。

6.分散细胞使用移液器等工具将培养皿中的细胞分散均匀。

可以轻轻地轻拍培养皿来帮助细胞分散。

7.将细胞转移到新的培养皿中将细胞溶液转移至新的培养皿中。

取出新的培养皿，将细胞溶液均匀地滴到培养皿的表面上。

8.添加足够的培养基加入足够的预暖的培养基以覆盖整个培养皿的表面。

培养基的加入量应适量，以满足细胞的需求和培养条件。

9.培养条件将新的培养皿放回培养箱中，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

培养时间可以根据细胞类型和实验目的的不同而有所不同。

10.细胞分离和定期传代当细胞在新的培养皿中达到80-90%的密度时，即可进行下一次的传代。

细胞密度的过高或过低都会影响细胞的生长和传代效果。

以上是一般的细胞培养传代的步骤，但具体操作中还应根据细胞类型、培养基的需求以及实验目的进行相应的调整。

同时，细胞培养传代过程中需要遵守无菌操作的原则，确保细胞的生长环境没有被外界的污染物所影响。

此外，传代后的细胞可以用于进一步的实验和应用，如细胞增殖分析、细胞治疗等。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏.

1.细胞传代培育的原理及操作步骤2.3.(一原理:细胞在培育瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能持续生长,同4.时也将细胞数目扩大,须进行传代再培育。

传代培育也是一种将细胞种保留下去的5.方法。

同时也是利用培育细胞进行各样实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶便可6.以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

7.8.(二细胞传代培育详细操作9.10.1、细胞:贴壁细胞株11.12.2、操作步骤13.14.将长满细胞的培育瓶中本来的培育液弃去。

15.16.加入0.5-1ml0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。

17.18.瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下察看细胞。

跟着时间的推移,原贴壁的细胞渐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培育液停止消化。

19.20.察看消化也能够用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔缝隙时停止消化。

一般室温消化时间约为1-3分钟。

21.22.4用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到此外两到三瓶中,实践培育液塞好橡皮23.塞,置37℃下持续培育。

次日察看贴壁生长状况。

细胞冻存24.25.实验前准备:细胞室及工作台紫外线照耀15min;培育液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用;采集对数生长久细胞,在冻存前一天最好换液2.用吸管吸出培育瓶中的细胞培育液,PBS冲洗2遍吸出冲刷液,加入适当胰蛋白酶消化。

合时去掉胰蛋白酶,加入少许新培育液。

吸管汲取培育液吹打瓶壁上的细胞,使其成为平均分别的细胞悬液。

用吸管将培育液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟。

去上清液,加入与细胞悬液等量的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞平均冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜---液氮槽vaporphase长久储存。

-20℃不行超出1h,以防备胞内冰晶过大,造成细胞大批死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率略微降低一些。

细胞培养传代标准操作规程

1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。

为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。

2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。

4、Vero细胞培养传代操作规程4。

1试药与试液1、细胞：Vero细胞。

2、液体：0。

25%胰蛋白酶溶液；7。

5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。

4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。

4。

3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。

2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。

0℃±0。

5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。

5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。

先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。

7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

4。

3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。