IDH1突变和MGMT基因启动子在脑胶质瘤中表达及关联度分析_朱潇鹏
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2 结果
2.1 IDH1 突变的检测结果 通过 DNA 测序发现， 133 例不同级别胶质瘤患者中检测出 IDH1 基因突 变 62 例，总突变率为 46.62%，其中 61 例样本存在 IDH1 基因的 R132H 突变，1 例样本存在 IDH1 基因 的 R132S 突 变 。 WHO I 级 中 无 IDH1 突 变 ，WHO II、WHO III、继发性胶质母细胞瘤和原发性胶质 母 细 胞 瘤 中 IDH1 突 变 率 分 别 为 75% 、51.11% 、 50%和 8.33%。经 χ2 检验，本实验组中 WHO II( χ2= 32.91，P<0.001)、WHO III( χ2=14.89，P<0.001) 和 继 发 性 胶 质 母 细 胞 瘤 中 ( χ2=4.29，P=0.038) IDH1 突 变率显著高于原发性胶质母细胞瘤。IDH1 各级 别 突 变 的 具 体 情 况 见 表 1。 典 型 的 IDH1 基 因 R132H 突变见图 1。 2.2 MGMT 基因启动子甲基化的检测结果 在 133 例患者中，MGMT 基因启动子甲基化患者 88 例（66.17%）。nMSP 法对 98 例样本进行 MGMT 基 因启动子甲基化检测，其中 65 例（66.33%）脑胶质 瘤组织中发生 MGMT 基因启动子甲基化（图 2）。 用 MSP-DHPLC 法对 35 例样本进行检测，其中 23 例（65.71%）存 在 MGMT 基 因 启 动 子 甲 基 化（图 3）。WHO I 级、WHO II 级、WHO III 级、WHO IV 级 原发性和 WHO IV 级继发性胶质母细胞瘤中 MG⁃ MT 基因启动子甲基化比率分别为 50%、77.27%、 64.44%、52.78%、83.33%。具体情况见表 1。 2.3 IDH1 突变与 MGMT 基因启动子甲基化的关 联分析 133 例脑胶质瘤样本中 IDH1 突变和 MG⁃ MT 基因启动子甲基化结果见表 2。运用 χ2检验进 行关联度分析，IDH1 突变与 MGMT 基因启动子甲 基 化 关 联 显 著（χ2=6.57，P=0.01），列 联 系 数 C= 0.217，二者低度相关。
Chin J Nerv Ment Dis Vol.41 , No. 2 February 2015
PCR 产物进样 DNASep 核酸分析柱（美国,Transge⁃ nomic），Navigator 软件分析结果。 1.5 统计学方法 数据采用 SPSS16.0 进行统计分 析。应用 χ2检验比较两组分子标记发生率之间的 差异及 MGMT 甲基化和 IDH1 突变关联度，检验水 准α=0.05。
112
级 45 例，WHO IV 级 42 例。 1.2 直 接 测 序 法 检 测 IDH1 基 因 突 变 根 据 EZ⁃ NA Tissue DNA Ki（t OMEGA，美国）的操作手册抽 提肿瘤组织 DNA。分光光度计衡量所提 DNA 纯 度和含量。选取 A260/280 在 1.7~1.9 的 DNA 进行下一 步实验。根据人 IDH1 基因组序列（GenBank 登记 号 ：NM005896）设 计 IDH1 引 物 ，上 游 引 物 序 列 ： 5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3'，下 游 引 物 序 列：5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3'。 退火 温度：60oC，PCR 产物长度：129bp。DNA 的纯化和 测序由英潍捷基公司生物技术有限公司完成。 1.3 巢 式 甲 基 化 特 异 性 PCR（nested methyla⁃ tion-specific PCR，nMSP）检测 MGMT 基因启动 子 甲 基 化 采 用 DNA 甲 基 化 试 剂 盒（EZ DNA MethylationTMKit）对 1μg 基因组 DNA 进行亚硫酸盐 修 饰 。 然 后 以 MGMT 启 动 子 区 引 物 MGMT-O 进 行第一轮 PCR 扩增。上游引物序列：5' GGATAT⁃ GTTGGGATAGTT 3'， 下 游 引 物 序 列 ： 5' CCAAAAACCCCAAACCC 3'。 以 第 1 轮 PCR 扩 增 出的 MGMT 基因启动子区目的条带的 PCR 产物为 模板，用 MGMT 基因甲基化引物（MGMT-M）和非 甲基化引物（MGMT-U）进行第 2 轮 PCR 扩增。甲 基化引物上游引物序列：5' TTTCGACGTTCGTAG⁃ GTTTTCGC 3'，甲 基 化 下 游 引 物 序 列 ：5' GCACTCTTCCGAAAACGAAACG 3'；非 甲 基 化 引 物上游引物序列：5' TTTGTGTTTTGATGTTTGTAG⁃ GTTTTTGT 3'，非甲基化下游引物序列：5' AACTC⁃ CACACTCTTCCAAAAACAAAACA 3'。 扩 增 产 物 经 2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光凝胶成像系 统下观察结果并拍照。仅 MGMT-U 引物扩增出 相应片段，判断为未甲基化；仅 MGMT-M 引物扩 增出相应片段或 MGMT-U 引物和 MGMT-M 引物 均扩增出相应片段，判断为甲基化。 1.4 甲基化特异性 PCR 结合变性高效液相色谱法 （MSP-DHPLC）检测 MGMT 基因启动子甲基化 常规脱水，制作石蜡切片，寄送中国人民解放军空 军航空医学研究所附属医院分子病理中心。石蜡 切片 DNA 的提取，DNA 的修饰，MSP 以及 DHPLC 结果分析都依托该中心完成 。 [8] MGMT-M 扩增产 物 和 MGM-U 扩 增 产 物 等 比 混 匀 ，取 5μL 上 样 。
中国神经精神疾病杂志 2015 年 第 41 卷 第 2 期
111
· 论 著·
IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化在脑胶质 瘤中表达及关联度分析☆
朱潇鹏* 唐军海* 黄国浩* 徐庆福* 臧振乐* 赵邦云* 王彬△ 吕胜青*
【摘 要】 目 的 探 讨 脑 胶 质 瘤 中 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 1(isocitrate dehydrogenases 1，IDH1) 突 变 和 O6- 甲 基 鸟 嘌
14
31
注：χ2=6.57，P=0.01，C=0.217
113
MGMT 作为一种人体细胞内普遍存在的 DNA 修复蛋白，能逆转烷化剂对 DNA 的损害，是胶质 瘤对烷化剂治疗效果较好的因素之一[2]，也是临床 上替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗药物敏感的 重要依据，MGMT 基因启动子高甲基化的患者对 TMZ 疗 效 明 显 。 [9] 本 组 133 例 脑 胶 质 细 胞 瘤 中 ， MGMT 基因启动子甲基化的总发生率为 66.17%。 WHO I、WHO II、WHO III、原发性胶质母细胞瘤、 继发性胶质母细胞瘤中的 MGMT 甲基化率分别为 50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。之前研究 发现，随着低级别星形胶质细胞瘤逐步演变为继 发 性 GBM，肿 瘤 中 发 生 甲 基 化 的 比 例 也 随 之 增 高。本组实验中 WHO III 级的 MGMT 突变率要低 于 WHO II 和继发性胶质母细胞瘤，这可能和本实 验未分肿瘤类型有关，也可能由于 MGMT 基因启 动子甲基化发生于肿瘤形成的早期阶段所造成。
3(8.33%)1） 3
MGMT 甲基化数 1
34(77.27%) 29(64.44%) 19(52.78%)
5
1）经 χ2 检验，与 WHO IV 继发性 IDH1 突变率比较，P＜0.05
表 2 IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化结果比较（χ2 检验）
MGMT
+ -
IDH1
+
Байду номын сангаас
-
48
40
1 材料和方法
1.1 研究对象 收集第三军医大学新桥医院神经 外科 2011 年 7 月至 2014 年 4 月期间手术切除并经 病 理 证 实 的 人 脑 胶 质 瘤 组 织 标 本 ，共 计 133 例 。 男 77 例 ，女 56 例 ，年 龄 7～87 岁 ，平 均（44.77 ± 15.88）岁。根据 WHO（2007）神经系统肿瘤分类标 准[7]，其中 WHO I 级 2 例，WHO II 级 44 例，WHO III
胶质瘤中伴有 IDH1 突变患者的存活时间明显长于 野生型 IDH1 患者[5]，提示 IDH1 突变是脑胶质瘤患 者预后重要指标。Molenaar RJ[6]对 98 例胶质母细 胞瘤患者分析发现：IDH1 突变和 MGMT 基因启动 子甲基化联合能更好的预测胶质母细胞瘤患者的 生存时间。MGMT 基因启动子甲基化和 IDH1 突变 之间是否相关，进而相互调控，对阐明两者在胶质 瘤发生发展及预后评估中具有重要意义。本研究 对 133 例脑胶质瘤患者 MGMT 基因启动子甲基化 及 IDH1 突变情况进行检测，进一步探讨分析他们 之间的关联性，以期为胶质瘤患者的诊治提供更多 理论依据。
3 讨论
中国神经精神疾病杂志 2015 年 第 41 卷 第 2 期
表 1 脑胶质瘤患者 IDH1 突变与 MGMT 甲基化情况
级别
n
WHO I
2
WHO II
44
WHO III
45
WHO IV 原发性 36
WHOIV 继发性 6
IDH1 突变数 0
33(75.00%)1） 23(51.11%)1）
（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）法检测脑胶质瘤中的 MGMT 基因启动子甲基化情
况，直接测序法检测脑胶质瘤中 IDH1 基因的突变情况。采用 χ2 检验进行 IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基
化关联度的统计分析。结果 133 例脑胶质瘤患者中 MGMT 基因启动子甲基化 88 例（66.17%），IDH1 突变 62 例
doi:10.3936/j.issn.1002-0152.2015.02.010 ☆ 国家自然科学基金（编号：81272783）和重庆市卫生局科研课
题（编号：2012-2-305）资助 ������ 第三军医大学新桥医院神经外科（重庆 400037） △ 重庆市永川区人民医院
通信作者（E-mail: wangb66@sina.com；lvsq0518@hotmail.com）
呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因启动子甲基化状态及二者之间的关
联性。方法 收集手术切除并经病理证实的脑胶质瘤组织 133 例，采用巢式甲基化特异性 PCR（nested methyla⁃
tion-specific PCR，nMSP）法和甲基化特异性 PCR（methylation specific PCR,MSP）法联合变性高效液相色谱分析
（46.62%）。IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化存在关联（P=0.01）。结论 脑胶质瘤中 IDH1 突变和 MGMT
基因启动子甲基化之间关联显著，提示两者在脑胶质瘤的发生发展中可能存在相互调节的作用；IDH1 突变和
MGMT 基因启动子甲基化是脑胶质瘤的重要疾病相关因素。
【关键词】 IDH1 突变 MGMT 甲基化 脑胶质瘤
【中图分类号】 R739.41
【文献标识码】 A
脑胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤。 研究显示：肿瘤耐药影响患者化疗疗效，是胶质瘤 患者预后不良的因素之一[1]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransfer⁃ ase，MGMT）作为人体细胞内普遍存在的 DNA 修复 蛋白，可通过还原 DNA 上的烷基化鸟嘌呤，逆转烷 化剂对 DNA 的损害[2]。研究显示：经替莫唑胺治疗 的胶质母细胞瘤中，MGMT 基因启动子甲基化组患 者生存时间明显长于非甲基化组，提示 MGMT 基因 沉默是胶质母细胞瘤化疗效果好的因素之一[3]。异 柠檬酸脱氢酶 1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1） 催化异柠檬酸氧化脱羧形成 a-酮戊二酸，是细胞三 羧酸循环能量代谢过程的关键酶[4]。在同一级别脑
2.1 IDH1 突变的检测结果 通过 DNA 测序发现， 133 例不同级别胶质瘤患者中检测出 IDH1 基因突 变 62 例，总突变率为 46.62%，其中 61 例样本存在 IDH1 基因的 R132H 突变，1 例样本存在 IDH1 基因 的 R132S 突 变 。 WHO I 级 中 无 IDH1 突 变 ，WHO II、WHO III、继发性胶质母细胞瘤和原发性胶质 母 细 胞 瘤 中 IDH1 突 变 率 分 别 为 75% 、51.11% 、 50%和 8.33%。经 χ2 检验，本实验组中 WHO II( χ2= 32.91，P<0.001)、WHO III( χ2=14.89，P<0.001) 和 继 发 性 胶 质 母 细 胞 瘤 中 ( χ2=4.29，P=0.038) IDH1 突 变率显著高于原发性胶质母细胞瘤。IDH1 各级 别 突 变 的 具 体 情 况 见 表 1。 典 型 的 IDH1 基 因 R132H 突变见图 1。 2.2 MGMT 基因启动子甲基化的检测结果 在 133 例患者中，MGMT 基因启动子甲基化患者 88 例（66.17%）。nMSP 法对 98 例样本进行 MGMT 基 因启动子甲基化检测，其中 65 例（66.33%）脑胶质 瘤组织中发生 MGMT 基因启动子甲基化（图 2）。 用 MSP-DHPLC 法对 35 例样本进行检测，其中 23 例（65.71%）存 在 MGMT 基 因 启 动 子 甲 基 化（图 3）。WHO I 级、WHO II 级、WHO III 级、WHO IV 级 原发性和 WHO IV 级继发性胶质母细胞瘤中 MG⁃ MT 基因启动子甲基化比率分别为 50%、77.27%、 64.44%、52.78%、83.33%。具体情况见表 1。 2.3 IDH1 突变与 MGMT 基因启动子甲基化的关 联分析 133 例脑胶质瘤样本中 IDH1 突变和 MG⁃ MT 基因启动子甲基化结果见表 2。运用 χ2检验进 行关联度分析，IDH1 突变与 MGMT 基因启动子甲 基 化 关 联 显 著（χ2=6.57，P=0.01），列 联 系 数 C= 0.217，二者低度相关。
Chin J Nerv Ment Dis Vol.41 , No. 2 February 2015
PCR 产物进样 DNASep 核酸分析柱（美国,Transge⁃ nomic），Navigator 软件分析结果。 1.5 统计学方法 数据采用 SPSS16.0 进行统计分 析。应用 χ2检验比较两组分子标记发生率之间的 差异及 MGMT 甲基化和 IDH1 突变关联度，检验水 准α=0.05。
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级 45 例，WHO IV 级 42 例。 1.2 直 接 测 序 法 检 测 IDH1 基 因 突 变 根 据 EZ⁃ NA Tissue DNA Ki（t OMEGA，美国）的操作手册抽 提肿瘤组织 DNA。分光光度计衡量所提 DNA 纯 度和含量。选取 A260/280 在 1.7~1.9 的 DNA 进行下一 步实验。根据人 IDH1 基因组序列（GenBank 登记 号 ：NM005896）设 计 IDH1 引 物 ，上 游 引 物 序 列 ： 5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3'，下 游 引 物 序 列：5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3'。 退火 温度：60oC，PCR 产物长度：129bp。DNA 的纯化和 测序由英潍捷基公司生物技术有限公司完成。 1.3 巢 式 甲 基 化 特 异 性 PCR（nested methyla⁃ tion-specific PCR，nMSP）检测 MGMT 基因启动 子 甲 基 化 采 用 DNA 甲 基 化 试 剂 盒（EZ DNA MethylationTMKit）对 1μg 基因组 DNA 进行亚硫酸盐 修 饰 。 然 后 以 MGMT 启 动 子 区 引 物 MGMT-O 进 行第一轮 PCR 扩增。上游引物序列：5' GGATAT⁃ GTTGGGATAGTT 3'， 下 游 引 物 序 列 ： 5' CCAAAAACCCCAAACCC 3'。 以 第 1 轮 PCR 扩 增 出的 MGMT 基因启动子区目的条带的 PCR 产物为 模板，用 MGMT 基因甲基化引物（MGMT-M）和非 甲基化引物（MGMT-U）进行第 2 轮 PCR 扩增。甲 基化引物上游引物序列：5' TTTCGACGTTCGTAG⁃ GTTTTCGC 3'，甲 基 化 下 游 引 物 序 列 ：5' GCACTCTTCCGAAAACGAAACG 3'；非 甲 基 化 引 物上游引物序列：5' TTTGTGTTTTGATGTTTGTAG⁃ GTTTTTGT 3'，非甲基化下游引物序列：5' AACTC⁃ CACACTCTTCCAAAAACAAAACA 3'。 扩 增 产 物 经 2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光凝胶成像系 统下观察结果并拍照。仅 MGMT-U 引物扩增出 相应片段，判断为未甲基化；仅 MGMT-M 引物扩 增出相应片段或 MGMT-U 引物和 MGMT-M 引物 均扩增出相应片段，判断为甲基化。 1.4 甲基化特异性 PCR 结合变性高效液相色谱法 （MSP-DHPLC）检测 MGMT 基因启动子甲基化 常规脱水，制作石蜡切片，寄送中国人民解放军空 军航空医学研究所附属医院分子病理中心。石蜡 切片 DNA 的提取，DNA 的修饰，MSP 以及 DHPLC 结果分析都依托该中心完成 。 [8] MGMT-M 扩增产 物 和 MGM-U 扩 增 产 物 等 比 混 匀 ，取 5μL 上 样 。
中国神经精神疾病杂志 2015 年 第 41 卷 第 2 期
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· 论 著·
IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化在脑胶质 瘤中表达及关联度分析☆
朱潇鹏* 唐军海* 黄国浩* 徐庆福* 臧振乐* 赵邦云* 王彬△ 吕胜青*
【摘 要】 目 的 探 讨 脑 胶 质 瘤 中 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 1(isocitrate dehydrogenases 1，IDH1) 突 变 和 O6- 甲 基 鸟 嘌
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注：χ2=6.57，P=0.01，C=0.217
113
MGMT 作为一种人体细胞内普遍存在的 DNA 修复蛋白，能逆转烷化剂对 DNA 的损害，是胶质 瘤对烷化剂治疗效果较好的因素之一[2]，也是临床 上替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗药物敏感的 重要依据，MGMT 基因启动子高甲基化的患者对 TMZ 疗 效 明 显 。 [9] 本 组 133 例 脑 胶 质 细 胞 瘤 中 ， MGMT 基因启动子甲基化的总发生率为 66.17%。 WHO I、WHO II、WHO III、原发性胶质母细胞瘤、 继发性胶质母细胞瘤中的 MGMT 甲基化率分别为 50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。之前研究 发现，随着低级别星形胶质细胞瘤逐步演变为继 发 性 GBM，肿 瘤 中 发 生 甲 基 化 的 比 例 也 随 之 增 高。本组实验中 WHO III 级的 MGMT 突变率要低 于 WHO II 和继发性胶质母细胞瘤，这可能和本实 验未分肿瘤类型有关，也可能由于 MGMT 基因启 动子甲基化发生于肿瘤形成的早期阶段所造成。
3(8.33%)1） 3
MGMT 甲基化数 1
34(77.27%) 29(64.44%) 19(52.78%)
5
1）经 χ2 检验，与 WHO IV 继发性 IDH1 突变率比较，P＜0.05
表 2 IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化结果比较（χ2 检验）
MGMT
+ -
IDH1
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Байду номын сангаас
-
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1 材料和方法
1.1 研究对象 收集第三军医大学新桥医院神经 外科 2011 年 7 月至 2014 年 4 月期间手术切除并经 病 理 证 实 的 人 脑 胶 质 瘤 组 织 标 本 ，共 计 133 例 。 男 77 例 ，女 56 例 ，年 龄 7～87 岁 ，平 均（44.77 ± 15.88）岁。根据 WHO（2007）神经系统肿瘤分类标 准[7]，其中 WHO I 级 2 例，WHO II 级 44 例，WHO III
胶质瘤中伴有 IDH1 突变患者的存活时间明显长于 野生型 IDH1 患者[5]，提示 IDH1 突变是脑胶质瘤患 者预后重要指标。Molenaar RJ[6]对 98 例胶质母细 胞瘤患者分析发现：IDH1 突变和 MGMT 基因启动 子甲基化联合能更好的预测胶质母细胞瘤患者的 生存时间。MGMT 基因启动子甲基化和 IDH1 突变 之间是否相关，进而相互调控，对阐明两者在胶质 瘤发生发展及预后评估中具有重要意义。本研究 对 133 例脑胶质瘤患者 MGMT 基因启动子甲基化 及 IDH1 突变情况进行检测，进一步探讨分析他们 之间的关联性，以期为胶质瘤患者的诊治提供更多 理论依据。
3 讨论
中国神经精神疾病杂志 2015 年 第 41 卷 第 2 期
表 1 脑胶质瘤患者 IDH1 突变与 MGMT 甲基化情况
级别
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WHO I
2
WHO II
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WHO IV 原发性 36
WHOIV 继发性 6
IDH1 突变数 0
33(75.00%)1） 23(51.11%)1）
（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）法检测脑胶质瘤中的 MGMT 基因启动子甲基化情
况，直接测序法检测脑胶质瘤中 IDH1 基因的突变情况。采用 χ2 检验进行 IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基
化关联度的统计分析。结果 133 例脑胶质瘤患者中 MGMT 基因启动子甲基化 88 例（66.17%），IDH1 突变 62 例
doi:10.3936/j.issn.1002-0152.2015.02.010 ☆ 国家自然科学基金（编号：81272783）和重庆市卫生局科研课
题（编号：2012-2-305）资助 ������ 第三军医大学新桥医院神经外科（重庆 400037） △ 重庆市永川区人民医院
通信作者（E-mail: wangb66@sina.com；lvsq0518@hotmail.com）
呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因启动子甲基化状态及二者之间的关
联性。方法 收集手术切除并经病理证实的脑胶质瘤组织 133 例，采用巢式甲基化特异性 PCR（nested methyla⁃
tion-specific PCR，nMSP）法和甲基化特异性 PCR（methylation specific PCR,MSP）法联合变性高效液相色谱分析
（46.62%）。IDH1 突变和 MGMT 基因启动子甲基化存在关联（P=0.01）。结论 脑胶质瘤中 IDH1 突变和 MGMT
基因启动子甲基化之间关联显著，提示两者在脑胶质瘤的发生发展中可能存在相互调节的作用；IDH1 突变和
MGMT 基因启动子甲基化是脑胶质瘤的重要疾病相关因素。
【关键词】 IDH1 突变 MGMT 甲基化 脑胶质瘤
【中图分类号】 R739.41
【文献标识码】 A
脑胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤。 研究显示：肿瘤耐药影响患者化疗疗效，是胶质瘤 患者预后不良的因素之一[1]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransfer⁃ ase，MGMT）作为人体细胞内普遍存在的 DNA 修复 蛋白，可通过还原 DNA 上的烷基化鸟嘌呤，逆转烷 化剂对 DNA 的损害[2]。研究显示：经替莫唑胺治疗 的胶质母细胞瘤中，MGMT 基因启动子甲基化组患 者生存时间明显长于非甲基化组，提示 MGMT 基因 沉默是胶质母细胞瘤化疗效果好的因素之一[3]。异 柠檬酸脱氢酶 1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1） 催化异柠檬酸氧化脱羧形成 a-酮戊二酸，是细胞三 羧酸循环能量代谢过程的关键酶[4]。在同一级别脑