微生物生产抗生素

二级种子：
豆饼粉 2.2 ％、葡萄糖 3 ％、淀粉 4 ％、蛋白胨 0.5 ％、 酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠 0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.3％ 35℃，24h，接种量10％ 二、发酵罐培养
发酵培养基：
豆饼粉 2.4 ％、葡萄糖 3 ％、 3.5 ％、蛋白胨 0.5 ％、 酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠 0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.15％，丙酸0.6％（分 次加入）
类健康作了出巨大贡献。
概 述

第二次世界大战期间 ,英美科学家在早年 Fleming发现青 霉素的基础上 ,共同进行了青霉素的开发 ,用紫外光照射 处理低产菌种 ,提高其产青霉素的能力 ,采用玉米浆作为 培养基的氮源 ,从而成功地开始了青霉素的工业生产 ,并 建立了深层发酵技术 ,这是发酵工业的一次革命 ,成为抗 生素生产的开端。 抗生素的工业化生产主要是利用微生物发酵法，极少数抗 生素如磷霉素可用法学法生产。此外还用天然产生的抗生 素进行化学结构改造，制造各种衍生物。
六、红霉素的发酵生产
一、斜面培养： 淀粉1％，硫酸铵0.3％、玉米粉0.6～1.0％、氯 化钠0.3％、蛋白胨0.2％、琼脂2％、pH7.0～ 7.2 37℃培养7～10d，成熟的孢子灰色略带微红色。 一级种子培养： 豆饼粉 2.5 ％、葡萄糖 3 ％、淀粉 4 ％、蛋白胨 0.5 ％、酵母粉 0.5 ％、硫酸铵 0.5 ％、 ％、玉 米粉 0.2 ％、氯化钠 0.3 ％、磷酸氢二钾 0.06 ％、 硫酸镁0.025％、豆油0.3％ 35 ℃培养72h，菌丝密集
(4)青霉素的提取工艺
1. 青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活 2. 水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定 3. 易溶于有机溶剂，水中溶解度很小 4. 青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性
5. 防止降解，条件温和、快速
青霉素的提取工艺
活性炭
发酵液预处理→萃取→脱色→反萃取→过滤洗涤→ 干燥
（发酵液中，青霉素浓度较低 10-30kg/m3） ①发酵液预处理：浓缩目的产物，去除大部分杂志， 改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化 过程 a. 加絮凝剂使蛋白质沉淀 b. 过滤（鼓式真空过滤机）
概 述
抗生素是某些生物产生的具有生物活性的物质，它不
但可以抑制其他微生物的发育与代谢，有的还可以抑制癌
的发育与代谢，及具有抗血纤维蛋白溶酶作用。 抗生素是人们使用最多的药物，也是制药工业中利润 最高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约 400 种， 广泛应用的仅 120种，其他主要是毒性大、成本高，无商 业应用价值。 抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一，世界 产量超过 35000 吨，不但在经济上占有重要位置，且为人
可在孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。
（2）种子罐培养工艺 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝 培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、
消沫剂等。
接种量： >200亿孢子/吨培养基 空气流量：1：3 （m3/m3·min） 搅拌转速：300-350 r/min pH：自然
温度：27±1℃
2、菌种
为了提高产黄青霉菌的青霉素产量，使用诱
变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、 亚硝酸、X射线等。
生产菌种按其在深层培养
中菌丝形态分为：丝状菌 和球状菌；根据丝状菌产 生孢子的颜色又分为黄孢 子丝状菌和绿孢子丝状菌。 常用菌种为绿孢子丝状菌， 如产黄青霉菌。
3、当前青霉素的生产工艺流程
结晶
洗涤 干燥
成品
1、发酵液预处理 0.1～0.2％甲醛：杀菌使蛋白凝集变性
4～6硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤
并用碱液调节pH8.2～8.8，稳定红霉素
2、滤液处理
计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节pH10～ 10.5，30～33℃左右，红霉素溶解于有机溶剂中。
气流干燥 80-90º C
3、醋酸丁酯液处理：
异构化、重排，β -内酰胺环是功能性。
b) 温度：加热会加快其降解反应 c)
工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率 越低。
d) 微生物污染：杂菌：β -内酰胺酶和青霉素酰胺酶 e) 萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min。
(5)青霉素的精制
制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水 中的稳定性差，水解快。 1)结晶工艺： A 、 醋酸丁酯中直接结晶： 加入醋酸钾 -- 乙醇 -- 碳酸钾、
青霉素发酵工艺流程及发酵控制
孢子培养 25℃,7天 孢子培养 25℃,7天
冷冻管
斜面母瓶
大米孢子
种子培养 27℃,50h 1:3vvm
发酵液
变温发酵 26-24℃ 200h
二级 种子培养液
种子培养 25℃,14h
1:(0.7~1.8)vvm
1:(1~1.5)vvm
一级 种子培养液
（1）孢子制备
先将保存在砂土中的菌种孢子取出，在由甘油、葡 萄糖以及蛋白胨所制备而成的培养基中进行斜面培养， 经传代和活化。培养温度控制在26℃左右（最利于菌种 孢子传代活化的适宜温度）。培养7d左右，得到单菌落 之后，再传斜面，以同样的方式培养7d。然后就可以将 所获得的斜面孢子移植到优质小米或大米固体培养基上， 25 ℃，相对湿度45%-50%，培养7d，得到最终的生产孢 子。所获得的生产孢子应该经过摇瓶试验后，确定其效 价与杂菌情况均符合相关规定后方可用于下一环节生产。

二、抗生素的生物来源
微生物产生抗生素
1、放线菌产生的抗生素：
链霉菌属：放线菌素、链霉素等。
小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基
环醇类）
诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素
放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多，诺卡菌属较 少。
2、细菌产生抗生素
芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌
假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）
杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。
3、真菌产生抗生素
青霉属：青霉素、灰黄霉素。
头孢菌属： 头孢霉素
其他生物（动植物）产生抗生素

植物产生的抗生素，如地衣和藻类植物产生的地 衣酸和绿藻酸，从被子植物如蒜和番茄等植物的 组织或果实中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如 银杏、红杉等也能产生抗生物质。
②萃取工艺过程：二级逆流萃取 A、萃取原理： 分配定律，青霉素在水中溶解度小，易溶于醋酸 丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不 溶于有机溶剂。 青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯， 溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.87.4，形成盐转入水相中，实现反萃取。
B、影响萃取因素
a) pH ：反复调节 pH ，青霉素不稳定，易发生降解、
前期：主间歇搅拌，少加油
中期：搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时，少
量多次)
后期：尽量少加消沫剂
青霉素的发酵过程控制十分精密，一般 2 小
时取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、青 霉素效价等指标，同样取样做无菌检测，发现染 菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后 pH波动大，青霉素在几小时内就会被全部破环。
丁醇--水真空共沸蒸馏。
B、丁醇-水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇 中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带 出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。
2)过滤、洗涤、干燥
结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用 真空双锥旋转干燥器
(6)溶媒回收
采用立式传质塔蒸馏回收。
五、青霉素的发酵工艺
1、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性

作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉 连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障 碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生 溶解而死亡。

抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性
细菌。

稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳 定，pH5-7，6最稳定。
一般而言，青霉素的生产工艺流程需要有四个环节 。 第一个环节是通过培养基配制、蒸汽灭菌等工艺手段将原 料加工为 一级种子罐 。与此同时，还要将青霉素菌、 斜面母瓶、米孢子等经过相应处理后加入到一级种子罐中。 第二个环节是利用培养基配制和蒸汽灭菌等处理手段将原 料培养成二级种子罐 。第三个环节是在第二个环节的基 础上加上发酵罐的处理，形成 发酵液 。最后一个环节则 是将上述所获得的发酵液放在带放罐中，获得最终的发酵 液，完成青霉素的发酵制备 。
60h前35℃，60h后33 ℃
菌丝繁殖期：
接种45h后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用N、C， 菌丝体密集成网状。
红霉素分泌期：
45h ～ 150h ，菌丝体生长减弱，并达到平衡， pH 在 7.2左右，c源利用较快，红霉素持续分泌。
菌丝自溶期：
菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大， pH上升7.5，氨基氮上升。
① 10 ％醋酸调节 pH5 ～ 5.5 ，分层，去除醋酸丁酯
液 ， 在 酸 性 环 境 下 溶 于 水 溶 液 中 分层过滤
动物的多种组织能产生溶菌酶或一些抗生素，如 从动物的心、肺、脾、肾、眼泪、涎水中可提取 出色素，有抗菌及抗病毒等作用。

三、抗生素产生菌的选育
1、抗生素产生菌的分离 2、抗菌性试验 3、抗生素产生菌的改良
1)人工诱变
2)原生质体融合 3)体外DNA重组
体外DNA重组
四、抗生素的提纯
微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，
微生物生产抗生素类药
资料收集： PPT制作： PPT演讲：
目录
红霉素的发酵生产
F
E
青霉素的发酵工艺
抗生素的提纯
D C
抗生素产生菌的选育
抗生素的生物来源
B A
抗生素定义
一. 抗生素定义
传统的定义：抗生素（ antibiotic ）是微生物细胞 产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化 学物质。
现代定义：抗生素是生物细胞（包括某些微生物﹑ 植物和动物）产生的能以低浓度抑制其他生物细 胞生长或功能的化学物质。
时间：40h
（2）种子罐培养工艺 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖
培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等 接种量：10% 空气流量： 1：1-1.5 （m3/m3·min） 搅拌转速： 250-280 r/min
pH：自然
温度：25±1 ℃ 时间：10-14h
（3）生产罐培养工艺
三级罐：发酵罐
培养基： 花生饼粉、葡萄糖、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰 胺、碳酸钙、玉米油、硅油 温度控制：变温控制，不同阶段不同温度 较高温度（ 26 ℃），缩短生长时间；降低温度（ 22 ℃）， 利于青霉素合成。 pH：6.4-6.6左右 根据pH补糖（补糖可是pH上升） 空气流量: 1:0.8-1.5 （m3/m3·min） 搅拌速度：150-200r/min
三、红霉素的提取和精制
红霉素是一种有机碱化物，在碱性条 件下溶于有机溶剂中，在酸性条件下溶于 水中。
提取工艺
发酵液
加甲醛、硫酸锌
pH8.2～8.8
ຫໍສະໝຸດ Baidu
过滤
调节pH10～10.5
分层、离心 (26000 r/ml)
滤液
醋酸调节pH5～5.5
静止分层 5℃加丙酮
加氢氧化钠静止 酸化液 碱化
酸化液
冷冻结晶
发酵罐示意图
加料口
电动机 pH检测及 控制装置 排气口 冷却水出口 培养液
搅拌器
冷却水进口 无菌空气 放料口
菌丝生长速度与形态、浓度
发酵稳定期，湿菌浓度可达 15%-20% ，丝状 菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。在发酵中后 期一般每天放液一次，每次放掉总发酵液的 10% 左右。
消沫
天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌
包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养
基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使
用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必 须经过精制。
抗生素的提纯
⑴抗生素提纯的基本步骤和原则
3个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制
4个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适 宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。 ⑵提取方法： 吸附、萃取、离子交换、沉淀、色谱分离、分子 筛过滤、透析等。
2、菌种

青霉素作为第一个具有临床应用价值的抗生素，
1928 年被发现， 1943 年在美国被首次实现工业生 产。

最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，
生产能力很低，发酵单位2U/mL，不能满足工业生
产要求，所以被淘汰。现在主要采用的是产黄青 霉菌，目前国际上青霉素生产最高发酵单位 80000-90000U/mL.