葫芦藓及其配子体发育调控的初步研究pdf

目录Content目录--------------------------------------------------------------------------------------1 题目、作者、指导老师等-----------------------------------------------------------2原创性声明、摘要、关键词、引言-----------------------------------------------3 1材料与方法---------------------------------------------------------------------------4 2实验步骤------------------------------------------------------------------------------5 3结果与结论---------------------------------------------------------------------------7 4讨论-----------------------------------------------------------------------------------15 答谢-------------------------------------------------------------------------------------18参考文献-------------------------------------------------------------------------------19葫芦藓及其配子体发育调控的初步研究（生科院“飞”动植物艺术协会）位光山冯强楠赵文涛盖万霞高宁指导教师叶宝兴、姚建职称副教授、实验师论文完成日期2009.10.30 论文答辩日期The initial research on Funaria hygrometrica Hedw and regulating of its gametophyte developmentbyWeiguangshan Fengqiangnan Zhaowentao Gaiwanxia Gaoning(Life Science College)Thesis Supervisor: Professor Ye baoxing YaojianOct. 2009大学生优秀科技论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：本论文是在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果，撰写成学术论文“葫芦藓及其配子体发育调控的初步研究” 。

除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开发表或未公开发表的成果。

本声明的法律责任由本人承担。

论文作者签名：导师签名：日期：年月日摘要葫芦藓以孢子进行繁殖，本实验通过对葫芦藓生活环境的调查，探索对其孢子在无菌条件下进行实验室培养，对其生活史各阶段拍照，以阐明其发育过程，并设计变量以探索温度、光照、蔗糖浓度、激素（生长素、赤霉素）种类及浓度等因素对其孢子萌发、原丝体生长、芽叶的分化等影响。

本实验重在探索，摸索出了培养基制作、无菌操作、孢子灭菌、配制低浓度激素溶液、计算接种密度等方法，阐明了其发育过程，得到了温度、光照、蔗糖浓度、激素种类及浓度等因素对葫芦藓配子体发育的定性影响。

关键词：葫芦藓；孢子；生活史；配子体；芽体；叶引言关于环境条件对藓类植物配子体发育的调节作用的研究资料目前较少，在《植物学实验》中尚未开设该实验内容。

本项目的实施将为人们理解藓类植物配子体的发育提供新资料。

实验中拍摄了大量葫芦藓发育各期图片，得到了各影响因子对葫芦藓配子体发育各阶段的定性影响，并通过藓类植物的实验触类旁通，解释了一些现象，提出了蔗糖的运输方式，控制细胞形状、大小及分裂速率的方法，添加逆行刺激用在作物、园艺上以提高光合效率、加快其发育进程等想法，提出一系列新的研究课题，为下一步做更多更好的实验奠定基础。

1材料与方法1.1材料 成熟葫芦藓（09年4月下旬采自农大园艺实验站,将孢蒴保存在室温干燥处）、生长地土壤等。

1.2药品1.3仪器 电子天平（精确度为1/1000克）、电磁炉、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、量筒、100ml 容量瓶、大烧杯、三角瓶（容积250mL)、培养皿（直径d=90mm ）、玻璃棒、涂布棒、胶头滴管、医用注射器、微型细菌过滤器、移液器（0—1000uL,0-10uL ）、石蜡封口膜、精密pH 试纸或pH 计、普通棉花、纱布、棉绳、牛皮纸或普通报纸等。

1.4基本流程 预实验（生长地pH 测定、琼脂含量与硬度预实验、孢子萌发预实验蔗糖浓度的确定、生活地湿度的测定等）→配制培养基→灭菌→加抗生素、过滤灭菌的激素→倒平板→孢子灭菌→接种→分箱培养→观察记录。

1.5实验方法 运用植物组织培养中的无菌操作技术，借鉴微生物实验中的接种涂布方名称及规格用量 用途 Ca(NO3)2•4H2O （分析纯） 1g/L MgSO4•7H2O （分析纯） 0.25g/L KH2PO4（分析纯） 0.25g/L KCl （分析纯）0.125g/L 1%的FeCl3水溶液（质量浓度）1滴/L 琼脂粉（分析纯） 0.7%（质量分数）制固体”克诺普”培养基1%NaOH 溶液、1%HCl 溶液（质量浓度） 依情况而定，一般若干滴调节培养基pH蔗糖（分析纯） 0.5%、1、2%、10%、20%（质量浓度）探索不同浓度蔗糖对实验影响 吲哚乙酸（IAA ） 10-9、10-8、10-7（mol/L ）探索不同浓度生长素对实验影响 赤霉素（GA3）0.1、1.0、10(mg/L) 探索不同浓度赤霉素对实验影响 注射用青霉素钠（0.48g,80万单位）50单位/mL 培养基注射用硫酸链霉素（1g,100万单位）50单位/mL 培养基长期培养中用于防止细菌感染安替福民溶液（分析纯）有效氯10%，1.0mL对孢子进行灭菌蒸馏水若干升仪器润洗、配制培养基、制无菌水等法，设置对照组和平行组，控制单一变量，各组及平行组之间相互对照比较，通过一次实验进行多个变量的探索，从而缩短了实验周期，大大提高了实验效率。

借鉴给花粉灭菌的原理探索出了葫芦藓孢子灭菌的新方法，观察采用目视比较法和制玻片显微观察法有机结合。

2实验步骤2.1生长地土壤pH测定将土壤放于30℃恒温箱中干燥后研磨、过筛。

用天平称取25.0g研磨后样品于50mL 烧杯中，加煮沸冷却后或用1mol/LnaOH或H2SO4调pH为7.0的去离子水25.0mL，间断搅拌约30min 后静置，用精密pH试纸或pH计测上清液pH即为生长地土壤pH。

2.2琼脂含量与硬度预实验按”克诺普”培养基中药品比例关系配制约400mL溶液，调节溶液pH至6.4，用电子天平分别称取0.25g、0.35g、0.40g、0.45g、0.50g、0.75g、1.00g琼脂粉分装于八个盛有50mL溶液的小烧杯中，依次做好标记，琼脂质量分数分别为0.5%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.5%、2.0%，加热煮沸并不断搅拌使琼脂熔化，注意补充水份至50mL，冷却后，试并选择合适硬度。

2.3孢子萌发预实验将成熟葫芦藓孢蒴在光滑的纸面弄破，除去朔壁，将孢子均匀撒在铺有湿纱布的培养皿中加盖，共两皿，一皿放于25℃光照周期为12h的恒温培养箱中，另一皿于25℃完全黑暗的恒温培养箱中培养并定期补充水分，观察记录萌发状况。

2.4蔗糖浓度的确定分别对生活葫芦藓的孢子、叶片细胞、根细胞做质壁分离实验，蔗糖质量分数分别为30%、20%、10%，以清水组做对照组，一段时间后，染色并进行显微观察，以确定质壁分离浓度。

作为确定添加蔗糖浓度的依据之一。

2.5生活地湿度的测定选择晴朗的一天，在园艺实验站葫芦藓生长地选择两处相对避风处用湿度计每隔15min左右测定一次湿度，记录，以作为培养环境的湿度参考值。

2.6一个孢蒴中孢子数目的测定（稀释反推法）选择长势均匀的孢子两个，将其放入1.5mL洁净离心管中，用解剖针捣碎，用移液器精确吸取1000微升洁净水，盖紧盖子，充分振荡均匀，再精确吸取100微升悬液，放于烧杯中用移液管精确量取10.00mL洁净水，充分摇匀，用移液器精确吸取10微升悬液制成玻片（要将载玻片放端正），在10×10倍的显微镜下观察计数，共做四组玻片。

2.7配制培养基用电子天平分别称取5g Ca（NO3）2、1.25g KH2PO4、1.25gMgSO4、0.625gKCl，先将Ca（NO3）2溶解，后将后三者溶解，之后混合加水稀释到1L，并滴加5滴1%FeCl3溶液搅拌,作为母液。

用量筒量取240mL母液加蒸馏水补充至1.2L，用精密pH试纸或pH计测其pH，后用1%NaOH或1%HCl溶液调至所需pH6.4。

用该液分别配制蔗糖质量浓度分别为0.5%、1%、2%、10%、20%琼脂含量为0.7%的培养基各80mL和不含蔗糖的培养基800mL。

（在各混合液中加入0.7%的琼脂后，置加热器上边搅拌边加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，然后补足水分。

）2.8分装，灭菌，加抗生素、激素，倒平板将培养基分装在锥形瓶中（分装量约占瓶容积的一半）做好标记，加棉塞后用牛皮纸封口扎紧，于高压蒸汽灭菌锅⑴中121℃灭菌20min待其冷却减压后取出，在恒温箱中冷却至约60℃后在超净工作台中加入抗生素⑵摇匀，并将经稀释成不同浓度(生长素浓度为10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L，赤霉素浓度为0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L)、过滤灭菌⑶的生长素、赤霉素⑷加入到相应培养基中摇匀后，倒平板，注意在培养皿上做好标记（可事先在灭菌前标记好）。

2.9孢子灭菌孢子灭菌方法：选择成熟未开裂较饱满的葫芦藓孢蒴十几个，放于1.5mL的小离心管中，用稀释一倍的安替福民溶液1mL灭菌5min后，用无菌带针头的注射器从底部吸去液体，注入无菌水⑸清洗4—5次，用同样的方法吸去液体，用无菌的镊子，将离心管中的孢蒴弄碎，加入1mL无菌水后盖紧盖子，充分摇匀后，用无菌注射器吸取悬液，注入另一无菌离心管中，即成无菌悬液，孢蒴壁留在原离心管中，达到灭菌、分离双重目的（在超净工作台中操作）。

2.10接种⑹、分箱培养将孢子悬液用无菌水稀释十倍，待琼脂冷却后，用移液器⑺（枪头已灭菌）吸取100uL 孢子悬液（吸前摇匀）均匀打在培养基上，并用燃烧灭菌后并冷却的涂布棒均匀涂开，接种完毕后用石蜡封口膜将培养皿缝隙封住。