HPLC技术讲座系列之色谱柱的日常维护及应用解决方案.ppt

有机无机杂化 硅胶基质
(pH1.0-12.5）
高或低pH下, 硅胶会溶解
化学修饰困难
柱效不够高
高柱效 高机械强度
宽PH
Welch公司反相色谱柱使用范围； Ultimate® 是1.5-10.0 CN填料是1.5-9.0 Xtimate® 是1.0-12.5 Welchrom® 是1.5-10.0
LP系列填料是1.0-8.0
常见缓冲盐的PH值
缓冲液
pKa
磷酸盐pK1
2.1
柠檬酸盐pK1 3.1
甲酸盐
3.8
柠檬酸盐pK2 4.7
乙酸盐
4.8
柠檬酸盐pK3 5.4
磷酸盐pK2
7.2
羟甲基甲胺
8.3
氨
9.2
硼酸盐
9.2
甘氨酸
9.8
1-甲基-哌啶 10.3
四氢化吡咯
10.5
二乙胺
10.5
三乙胺
10.7
磷酸盐pK3
12.3
pH范围 1.1~3.1 2.1~4.1 2.8~ 4.8 3.7~5.7 3.8~5.8 4.4~6.4 6.2~8.2 7.3~9.3 8.2~10.2 8.2~10.2 8.8~10.8 9.3~11.3 9.5~11.5 9.5~11.5 9.7~11.7 11.3~13.3
泵密封圈和管路磨损产生的固体颗粒物质
• 接保护柱 • 接在线过滤器
保护柱和在线过滤器
缓冲盐的析出
缓冲盐析是怎么析出的？ 怎样防止缓冲盐析出？
缓冲盐析出原理
A
有机溶剂/饱和缓冲液＝70/30
B
盐析出
C
100%有机溶剂 A + B＝ C
缓冲盐的正确使用方法
过渡流动相过渡 流动相走基线 进样
分析完成后用过渡流动 相反向冲洗40min
柱压升高
正 常 升 高
异 常 升 高
固体颗粒物质堵塞 缓冲盐析出 填料污染
柱效降低
固定相的流失 强保留物质的累积
什么是柱 压正常升
高？
缓慢升高
什么是柱压 的异常升高？
柱压在短时间 内快速上升
固体颗粒物质堵塞筛板
流动相和样品中的固体颗粒物质
• 流动相抽滤过0.45um滤膜 • 样品针筒过滤0.45um滤膜
HPLC技术系列讲座之----
色谱柱的日常维护及 应用解决方案
Welch Materials, Inc. 月旭材料科技(上海)有限公司
主讲人：陈再洁（技术部工程师）
概述
一 色谱柱的正确使用
二 色谱柱的维护 三 异常色谱峰产生的原因和解决方案 四 色谱柱使用的六大误区
一、色谱柱的正确使用
仔使细用阅 前读 的 准说备明工书作
1、禁止在色谱柱PH值要求 范围以外使用 2、避免在色谱柱临界PH值 处长期使用
液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区
中性组份 酸性组份
方法波动区(pKa+1.5)
方法稳定区
碱性组份
不同填料基质对PH不同的耐受表现
硅胶基质 （pH 2-7.5）
Al2O3· nH2O (pH1-14）
聚合物基质 (pH1-14）
正确的 流动相 的组成
各相之间良好的互溶性 合适的缓冲盐浓度
适宜的PH值范围
适宜的有机相比例
Fra Baidu bibliotek 相塌陷
甲醇水下的碳链形状 100%水下的碳链形状
普通C8柱 阿莫西林的检测： 0.1%的醋酸
水乙腈
0.1%的 醋酸
柱子加压
270bar 持续 10分钟
水/乙腈 (40/60) 1ml/min 30min
0.1%的 醋酸
使用缓冲盐时需要特别注 意置换，
不要使缓冲盐析出
色谱柱的正确连接
HPLC的色谱柱接头
螺母坡度不匹配，密封性差
如果伸出的管线长度过长，可能漏液
死体积区
如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积
HPLC常用色谱柱接头：
厂家 Welch Waters shimadzu Phenomenex Agilent dikma
管前端长 2.0 3.3
2.4
度/mm
2.0
2.33 2.3
1
10 mL 柱外体积
1
50 mL 柱外体积（管线）
3 2
4
3 2
4
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
样品:
1. 苯丙胺酸 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸 3. Asp-Phe 4. 天冬甜素
a、尽可能的除去样品杂质； b、使用流动相溶解样品； c、使用预处理柱（如：SPE小柱）除去样品中的强极性或与柱填
料产生不可逆吸附的杂质； d、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
二、色谱柱的维护
日常维护 色谱柱的维护 特殊维护
日常维护——每次分析完成后的色谱柱维护
正向使用 反向冲洗
特殊维护——色谱柱出现异常时的维护
用甲醇或乙腈水溶液反 向冲洗40min
过渡流动相：指有机相和水相比例与分析流动相相同，或者
水的比例”大于“分析流动相中缓冲盐溶液的比例
使用举例
× 甲醇/缓冲液＝70/30 —走基线
进样
分析完成后用甲醇或乙腈冲洗色谱柱
正确的温度范围
问：为什么色谱柱有温度要求？ 答：1、得到良好的时间重复性；
2、适当的提高柱温，可以减小流 动相的粘度，降低色谱柱背压；升高柱 效；
3、柱温过高，会加快填料的溶解， 缩短色谱柱使用寿命.
问:色谱柱的正确使用温度是多 少？
答：＜40℃ （正常寿命） ； ＞40℃ （缩短寿命） 。
良好的化学性能
<0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中<2.1mm内径色谱柱 0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6mm内径色谱柱 0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4mm内径色谱柱 0. 5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2mm内径色谱柱
正确的PH使用范围
在什么样的PH值范 围内使用色谱柱是正 确的？
正确安装 色谱柱
样品前处理 正确的保存
良好使的良用使好习用的惯习惯
正确的PH范围 正确的温度范围
正确的维护
正确的流动相 组成
使用前的准备工作
阅读使用说明书
按箭头方向连接色谱柱
按说明书要求活化色谱柱 用流动相走基线至平稳
特殊样品检测，需用样品溶 液进行色谱柱老化 进样
1）使用注意事项 2）pH使用范围 3）保存流动相
正确的保存
➢ 色谱柱内不含缓冲盐或离子对试剂 ➢ 长期保存80%左右有机相保存（甲醇或乙腈） （短期保存，可以用不含缓冲盐的流动相保存） ➢ 塑料堵头拧紧
典型的有机物分析流程图
采集
样品处理
仪器分析
收集
储存 提取 浓缩 分离 定性 定量
样品前处理 的重要性
提高检测限 提高选择性
保护仪器 色谱柱
样品前处理的一般原则：