药用野生稻复合体ITS1和ITS2序列变异及其系统进化分析
ITS2二级结构系统发育信息在茄属药用植物DNA条形码鉴定中的应用价值
ITS2二级结构系统发育信息在茄属药用植物DNA条形码鉴定中的应用价值ITS2是中药鉴定的核心DNA条形码之一，基于ITS2的中药鉴定方法已被纳入《中国药典》，但分辨力不足仍是制约其推广应用的主要因素，因此需要进一步挖掘其有助于中药鉴定的遗传信息。
在细胞内，ITS2以二级结构形式发挥功能，这种结构所蕴含的丰富遗传信息是核酸序列所无法体现的。
该研究以茄属Solanum 26个物种的40个样本为研究对象来探究ITS2二级结构在茄属药用植物鉴定中的价值。
作者利用PicXAA-R，MASTR和LocARNA软件来比对二级结构，利用RNAstat软件将二级结构信息转为系统发育信息，最后利用最大简约法进行建树分析。
研究结果表明将ITS2二级结构转化为系统发育信息后信息位点增加了88.57%，物种关系树上50%，75%，90%以上支持率的支系分别增加了19.05%，66.67%，66.67%，从而很好地解决了茄属几种药用植物的鉴定问题。
鉴于以上结果，作者建议将ITS2二级结构信息作为系统发育信息的有益补充加入到目前DNA条形码分析中。
标签：DNA条形码；ITS2二级结构；药用植物；茄属[Abstract]Internal transcript spacer 2 （ITS2）is one of the broadly used standard core barcodes and also the only nuclear barcode in identification of Chinese traditional medicine. Although the DNA barcode method based on ITS2 is popular and has been used in Chinese Pharmacopoeia，its low discriminatory efficiency is still a problem to its extensive application. Therefore，further study is still necessary to explore its phylogenetic information for medicinal plants identification. In cells，ITS2 activity is based on its secondary structure. The secondary structures are particularly useful in phylogenetic analysis because they include information not found in the primary sequence. In this study ITS2 secondary structure of 40 samples from 26 species were predicted and used to explore their utility in addressing the identification problems of Chinese traditional medicine in Solanum. The secondary structures were predicted and aligned，and their consensus models were generated using the three different software of LocARNA，MASTR and PicXAA-R. RNAstat software was used to transform the secondary structures into 28 symbol code data for maximum parsimony （MP）analysis. The results showed that the phylogenetic information increased 88.57% after ITS2 secondary structure information has been added，and then the support values above 50%，75% and 90% in the tree increased 19.05%，66.67% and 66.67%，respectively，indicating that the identification of Solanum medical plants has been well resolved. Thus，our analysis suggests that ITS2 secondary structure information should be incorporated into the current DNA barcoding analysis as a beneficial supplement of phylogenetic information.[Key words]DNA barcode；ITS2 secondary structure；medical plants；SolanumDNA條形碼技术作为一种新兴的分子鉴定技术，近年来受到广泛的关注。
基于ITS2序列探讨兰属的DNA条形码鉴定和系统发育关系
基于ITS2序列探讨兰属的DNA条形码鉴定和系统发育关系巫伟峰;陈孝丑;陈发兴;陈春;张毅智【摘要】兰属中许多类型具有极高的观赏和经济价值,并在兰花产业中占据重要地位.由于兰属植物复杂的演化、遗传历史,f直以来分类鉴定困难,存在诸多分类学争议.近年来,快速发展的DNA条形码技术为兰属植物的分类鉴定提供了新的思路.该研究利用12个兰属本地样品和250条GenBank下载的兰科ITS2序列(其中81条属于兰属),通过BLAST1、遗传变异、建树法等分析评估了ITS2序列用于兰属植物分子鉴定的可行性,并基于建树结果探讨了兰属的系统发育关系.BLAST1结果显示,ITS2序列可以准确鉴定12个本地兰属样品的属、亚属划分,鉴定成功率达到100％;在组水平也具有较好的鉴定能力,鉴定成功率为92％,但在物种水平上的鉴别能力较差,鉴定成功率仅17％.参考库(GenBank下载的250条兰科ITS2序列)遗传变异分析结果显示,兰属ITS2序列具有很高的遗传多样性(变异率为74.9％),在属、亚属水平上能较好地区分,但在组或组下的物种水平,由于组内和组间变异、种内和种间变异存在较大重叠,鉴别能力较差.建树结果显示,ITS2序列可以将兰属中的建兰亚属、兰亚属和大花亚属明显区分开,建兰亚属与兰亚属亲缘较近,两者与大花亚属亲缘较远,同还发现莲瓣兰与春兰在系统发育树中关系紧密,结果支持DuPuy&Cribb的3亚属划分,并暗示莲瓣兰可能是春兰下的f个变种或品种(支持率为69％).综上所述,ITS2序列在兰属植物的分子鉴定上具有f定的应用价值,可作为兰属植物DNA条形码鉴定的辅助条形码.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2019(031)008【总页数】10页(P1295-1304)【关键词】ITS2;兰属;DNA条形码;系统发育关系;兰科【作者】巫伟峰;陈孝丑;陈发兴;陈春;张毅智【作者单位】福建省林业科技试验中心,福建南靖 363600;贵州省植物园,贵州贵阳 550000;福建省林业科技试验中心,福建南靖 363600;福州植物园,福建福州350000;福建农林大学园艺学院,福建福州 350000;;福建省林业科技试验中心,福建南靖 363600;福建省林业科技试验中心,福建南靖 363600【正文语种】中文【中图分类】S682.31兰属(Cymbidium)是兰科(Orchidaceae)植物中最著名且分布范围最广的一类[1]，全世界约有70种，中国约有49种[2]。
ITS2二级结构在植物中的进化规律及系统学意义
ITS2二级结构在植物中的进化规律及系统学意义ITS2是植物物种鉴定的核心条形码,也是系统发育分析最常用的基因之一,在药用植物鉴定和保护、入侵物种的防治等领域发挥着不可或缺的作用。
因此,充分和正确使用其遗传信息至关重要。
ITS2转录后以“一环四臂”的二级结构参与核糖体的组装过程,由于功能约束,它在整个真核生物界都十分保守。
在功能与高级结构联系更加密切的前提下,其功能约束下的进化模式及其潜在的系统发育意义目前依然不够清晰。
因此本研究(1)首先分别从大类群(门)、目、科和属不同类群进化框架下,通过拆分计数、序列比对、碱基定位、形状量化等方法从二级结构的各部位组成、碱基配对频率、保守序列位置、及结构形状的保守性几个方面探索ITS2二级结构的进化是否具有方向性和相应的规律。
(2)为找到ITS2二级结构在进化中表现出的保守性和变化性的内在动力,本文还利用PHASE工具包的mcmcphase功能对二级结构碱基和配对的替换过程和特点进行了追踪和统计,最终得出以下结论:ITS2二级结构保守性:(1)在已知的ITS2二级结构共性的基础上,对植物类群中该结构的保守性特点有新的发现:ITS2碱基的GC含量高(61.26%),整体G>C>U>A;在不同区域,CG含量有一定的偏好:配对区的GC含量为(69.88%),远高于非配对区的CG含量(46.54%);在以配对为主的区域里,鸟嘌呤G 的含量明显偏高,而腺嘌呤A的含量明显偏低,非配对区则相反,尿嘧啶U和碱基C的含量在不同的区域比较恒定;在不同的组成部分中,嘌呤数和嘧啶数均占50%左右;比对后,ITS2核酸序列中的保守序列区域(conserved subsequences)与二级结构的位置有关。
ITS2二级结构变化性:(2)首次对ITS2二级结构在不同阶元的进化方式进行了探索,发现无论取样分类水平的高低,ITS2二级结构在发挥正常功能的前提下,变异并未随着类群的进化表现出明显的方向性。
东乡野生稻叶绿体基因组拼接及系统进化分析
东乡野生稻叶绿体基因组拼接及系统进化分析中国科技论文在线东乡野生稻叶绿体基因组拼接及系统进化分析林张翔，王营营，付菲，叶楚玉，樊龙江 5 (浙江大学农业与生物技术学院农学系，浙江省作物种质资源重点实验室，杭州 310058) 摘要: 叶绿体基因组序列对于研究植物物种的起源、进化演变及不同物种间的亲缘关系等具有重要意义。
高通量测序技术的快速发展，推动了植物叶绿体基因组的测序工作。
但传统的叶绿体基因组测序方法需要建立在分离纯化叶绿体 DNA 的基础上，操作繁琐，耗时较长。
为了优化叶绿体基因组 DNA 序列的获取和拼接方法，以东乡野生稻(Oryza rufipogon)嫩绿10 叶为材料，不需分离叶绿体 DNA，利用高通量测序获得的全基因组短序列(reads)及叶绿体基因组高度保守的特性，与参考序列进行比对，从而组装拼接出叶绿体 DNA 序列，并同时利用生物信息学手段和 PCR 扩增进行补洞。
最终获得东乡野生稻完整叶绿体基因组序列，大大小为134537bp，(LSC) 小、 (SSC) 单拷贝区和反向互补重复区 (IR) 大小分别为 80585bp、12346bp 和 20803bp，共注释叶绿体基因 152 个。
基于获取的东乡野生稻及其他叶序列，通过构建进化树分析，结果显示在禾本绿体基因15 组科中水稻与麻竹 ( Dendrocalamus latiflorus)和黍亚科(Panicoideae)亲缘关系最近，粳稻与中国普通野生稻的亲缘关系较近，粳稻与籼稻并非同时驯化出现。
关键词:作物遗传学;东乡野生稻;叶绿体基因组;高通量测序;嫩绿叶中图分类号:S511.920 Assembly and phylogenetic analysis of Dongxiang wildrice chloroplast genome LIN Zhangxiang WANG Yingying FU Fei YE Chuyu FAN LongjiangDepartment of Agronomy College of Agriculture and Biotechnology Zhejiang Key Laboratory25 of Crop Germplasm Zhejiang University Hangzhou 310058 China Abstract: Complete chloroplast genome sequence is very useful for studying the evolution of species. The rapid development of high-throughput sequencing technology promotes the plant chloroplast genome sequencing. For traditional chloroplast genome sequencing method it is necessary to isolate and purify the chloroplast DNA before sequencing. Due to low concentration of chloroplast DNA it is30difficult to separate it from nuclear genome DNA. Therefore chloroplast DNA isolation-based method is tedious and time consuming. This study employed a simple and rapid method for chloroplast genome sequences acquisition without isolation of chloroplast DNA. Based on conservationof chloroplast genomes the whole genome short reads generated byIllumina Hiseq 2000 were directly used to map against chloroplast reference genomes. Subsequently the aligned reads were collected and further did35 de novo assembly. Finally the chloroplast genome sequence of Dongxiang wild rice was obtained. The chloroplast genome is 134537bp in size and has a typical quadripartite structure with the large LSC 80585bp and small copy SSC 12346bp regions separated by two copies of an inverted repeat IRs 20803bp each region. In total 152 chloroplast genes were successfully annotated. The phylogenetic tree of Dongxiang wildrice and 14 Poaceae chloroplast genomes shows that Dongxiang wild rice has a40 closer relationship with Dendrocalamus latiflorus and Panicoideae. Furthermore we build a phylogenetic tree based on SNPs of Dongxiang wild rice and other 22 Oryza chloroplast genomes. The result illustrates that indica has a closer relationship with wild rice-I while japonica are closer to wild rice-III suggesting that indica and japonica were domesticated during different periods Key words: crop genetics donxiang wild rice chloroplast genome high-throughput sequencing fresh45 green leaf 作者简介:林张翔1991-女硕士生物信息学通信联系人:樊龙江1965-男教授生物信息学. E-mail: -1- 中国科技论文在线 0 引言叶绿体是具有半自主遗传体系的细胞器，是绿色植物进行光合作用的重要场所。
ITS2 序列在植物DNA 条形码鉴定中的应用（综述）
收稿日期：2014-09-05基金项目：云南省教育厅科学研究基金重点项目( 2012Z066)资助作者简介：费希同，硕士研究生，从事林木遗传育种研究。
E-mail: 798657293@注：辛培尧为通讯作者。
E-mail: xpytgyx@ITS2序列在植物DNA 条形码鉴定中的应用(综述)费希同，巨苗苗，林 源，李 斌，李德龙，辛培尧（西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224）摘 要：DNA 条形码技术的迅速发展极大地推动了植物的鉴定工作，随着鉴定工作的不断进行和新序列的不断发现，利用ITS2序列进行鉴定已成为目前较为广泛使用的鉴定技术。
本文根据ITS2序列的特点和性质，介绍ITS2序列鉴定的一般过程，并分析其特点和存在问题，以期为植物鉴定方面的研究提供参考。
关键词：ITS2序列；植物鉴定；DNA 条形码；研究进展Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2014.04.017中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2014)04-0339-04Application and Research Progress of ITS2 Sequence in Plant IdentificationUsing DNA BarcodingFEI Xi-tong, JU Miao-miao, LIN Yuan, LI Bin, LI De-long, XIN Pei-yao(College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan China)Abstract: The rapid development of DNA barcoding technology has greatly promoted the work of plant identification. With the increase of identification work and newly discovered sequences, the technology of ITS2 sequence has become a widely used identification at present. In order to provide certain theoretical reference of plant identification, this study introduced the ITS2 sequence identification process and analyzed the characteristics and problems occurred in the process, based on the characteristics of ITS2 sequence.Key words: ITS2 sequence; plant identification; DNA barcoding; research progress通常情况下，人们通过植物形态以及总结的一些经验对植物进行鉴定分类，这种分类手段误差比较大，尤其是许多植物的外部形态极其相似，给鉴定工作带来较大困难。
its2 its1 植物分类
its2 its1 植物分类植物分类是生物学中一个重要的研究领域，它帮助我们对植物进行系统的组织和归类。
根据国际植物学会（International Association for Plant Taxonomy）制定的植物分类系统，我们可以将植物分为不同的类别和层级。
ITS2和ITS1是两个重要的植物分类标记，它们常被用于分子系统学研究中。
ITS2是核糖体DNA的内转录间隔区域，ITS1是核糖体DNA的外转录间隔区域。
这两个区域的序列变异较大，可以用来研究不同植物种类之间的遗传关系。
植物分类的目的是为了更好地理解和研究植物的多样性。
通过对植物进行分类，我们可以更好地了解植物的特征、生态习性、进化关系等方面的信息。
植物分类的基本原则是根据植物的形态、生理特征以及遗传信息将其归类。
这些分类标准可以是形态学特征，也可以是分子标记，如ITS2和ITS1。
根据植物分类系统，植物被分为不同的门、纲、目、科、属和种。
门是最大的分类单位，包含了不同的纲。
纲是门下的一个分类单位，包含了不同的目。
目是纲下的一个分类单位，包含了不同的科。
科是目下的一个分类单位，包含了不同的属。
属是科下的一个分类单位，包含了不同的种。
种是属下的最小分类单位，代表了一个独立的生物种类。
植物分类的历史可以追溯到古希腊时期。
当时的植物分类是基于植物的形态特征进行的。
随着现代科学的发展，植物分类方法也得到了不断的改进和完善。
现代植物分类不仅考虑植物的形态特征，还包括了分子生物学和遗传学的信息。
分子系统学研究的发展使得我们能够更准确地了解植物的亲缘关系。
ITS2和ITS1作为分子标记，在植物分类研究中发挥了重要的作用。
通过对ITS2和ITS1序列的测定和比对，我们可以确定不同植物种类之间的遗传差异。
这些遗传差异可以用来构建植物的亲缘关系树，从而更好地理解植物的演化历史和亲缘关系。
除了ITS2和ITS1，还有其他的分子标记可以用于植物分类研究，如核基因、线粒体基因等。
ITS序列分析。
摘要关于水稻与近缘稻种关系的研究方法，生物学上已有多种学说，由于目前国内外的近缘水稻rDNA的（internal transcribed spacers,ITS）以及他们的二级结构并未进行很多研究，所以本研究拟选取ITS序列作为一个分子分析指标，对他们的亲缘关系进行探索。
我们用PCR扩增的方法获得了ITS，并进行PCR产物的克隆测序。
材料选取包括广陆矮四号稻、药用野生稻、宽叶野生稻、高杆野生稻四种。
对以上四种稻的rDNA内IT S（ITS1+ITS2）以及5.8s rDNA序列进行测定和分析。
最后，本文还用软件对栽培稻与这几种野生稻ITS2的二级结构进行了预测。
关键词野生稻；ITS序列；PCR1 前言稻属（Oryza）是种子植物门，单子叶植物纲，禾本目，包括20余个野生种。
中国是世界上水稻栽培历史最悠久的国家，据浙江余姚河姆渡发掘考证，早在六七千年以前这里就已种植水稻，比泰国还早千余年。
目前，我国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。
栽培历史已有6000～7000年。
为重要粮食作物；不仅如此，我国的稻种类型繁多。
目前中国收集保存的水稻种植中，来自国内的就占87.84%[1]，其中地方品种占81.26%[1]。
在如此众多的品种中，如何区分判断不同稻种之间的亲缘关系，利用更有效的方法研究优良遗传性状，这是水稻资源研究的重要内容之一。
目前人们对植种亲缘关系的研究方法有很多,例如非常成熟的杂交法。
从整体上看，遗传多样性的研究方法从个体形态学水平、细胞学水平、生理生化水平发展到了分子水平,研究层次也随之深入。
论述了植物遗传变异的来源,总结并分析比较了不同水平的遗传多样性研究方法[12]。
进入21世纪现代生物学基因技术飞速发展，从分子水平认识和了解水稻间的亲缘关系成为一种潮流，成为生物学的新的研究领域。
在基因方面的研究中，人们发现植物的rDNA中的ITS（internal transcribed spacers）序列有着非常丰富的遗传学信息。
赖草属物种的its序列变异及其系统推断
赖草属物种的its序列变异及其系统推断赖草属（Poaceae）是禾本科的一个大属，包括了众多具有重要经济价值和生态意义的物种。
ITS序列（Internal Transcribed Spacer）是植物核糖体DNA（rDNA）中的一个关键区域，具有种间和种内变异。
研究赖草属物种的ITS序列变异对于了解其系统发育关系和分类具有重要意义。
目前已经有很多研究对赖草属物种的ITS序列进行了分析。
这些研究主要集中在以下几个方面：1. 序列变异分析：通过对不同物种的ITS序列进行PCR扩增和测序，发现赖草属物种间的ITS序列存在一定的变异。
这些变异可用于鉴别不同物种，并为物种的分类和系统发育提供依据。
2. 分子系统学分析：基于ITS序列的分子系统学研究揭示了赖草属物种的进化关系。
例如，研究发现赖草属可分为若干个分支，而这些分支之间的亲缘关系与形态学、生态学等特征密切相关。
3. 遗传多样性分析：通过对ITS序列变异的研究，可以了解赖草属物种的遗传多样性。
这对于种质资源保护和遗传改良具有重要意义。
4. 物种鉴定：ITS序列变异可用于物种鉴定，尤其在赖草属这类形态特征相近的物种中，ITS序列分析具有较高的准确性。
然而，ITS序列研究也存在一些局限性。
例如，由于序列长度较短，ITS序列变异有时不足以明确划分物种。
此外，不同物种间的序列变异程度也可能存在差异，导致部分物种难以区分。
因此，在研究赖草属物种的ITS序列变异时，需结合其他分子标记和形态学等证据，以更准确地揭示其系统发育关系。
总之，赖草属物种的ITS序列变异及其系统推断研究对于理解该属物种的进化关系、分类和种质资源保护具有重要意义。
然而，还需进一步探讨其他分子标记和多种数据来源的整合，以提高研究准确性。
野生稻优良基因资源的研究与应用进展
野生稻优良基因资源的研究与应用进展李莉萍;应东山;张如莲【摘要】野生稻是栽培稻的野生近缘种，作为重要的基因资源，具有诸多的优良性状，如野生稻对病虫害的抗性、对各种逆境的耐受性以及胞质雄性不育等，已被广泛应用于现代栽培稻的育种改良，成为栽培稻遗传改良的丰富基因源和不可替代的物质基础。
本文综述了野生稻优良基因的发掘和种质资源的利用现状，总结了野生稻保护和利用目前存在的问题，并对其在水稻育种中的应用潜力做出了展望。
%Wild rice is the closely related wild relatives of cultivated rice. As an important genetic resource of rice, it exists a number of elite genes, such as resistance to diseases and insect pests, tolerance to different kinds of stresses and its cytoplasmic male sterility, which have been widely used in cultivated rice breeding. Wild rice is considered to be a rich gene pool and unreplaced basic material for rice genetic improvement. This paper reviewed the discovery of favorable genes and the utilization of germplasm resources in rice breeding, the problems of current research in wild rice were summarized, the utilization potential in rice breeding were prospected for future.【期刊名称】《热带农业科学》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】8页(P34-41)【关键词】野生稻;优良基因;应用;进展【作者】李莉萍;应东山;张如莲【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室海南儋州 571737;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室海南儋州 571737;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室海南儋州 571737【正文语种】中文【中图分类】S511.9稻属(Oryza L.)属于禾本科(Poaceae)的稻亚科(Oryzoideae)。
药用野生稻(CC)-栽培稻(AA)异源单体附加系MAAL8的遗传分析
ｐ ａ ｔ ．５ ｐａ ｔ ｄ ｔ ｅ ｎ ｒ ｌｒｌｅ ｅ ｖ ｓ ｎ ｌｎｓｈ ｄ ｔ ｅｅ ｔｅ ｌ ｏｌｄ ｌａ ｅ ． Ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｅ ｆａ ｅ ｖ ｓ １ ｏ ｐ ｅ ｆＳＳ ｌｎ ｓ ｌｎｓｈａ ｏｍａ ｏｌｄ ｌａ ｅ ．ａ ｄ ２ ｐａ ｔ ａ ｈ ｘ ｍｅｙ ｒ ｌ ｅ ｖ ｓ ｈ ｅ ｔｈ ｄ ｔ ｔｌａ ｅ ． ４ ｃ ｕ ｌｓｏ Ｒ ｈ ｒ ｅ ｈ ｉ
安徽农 业科学 。 ｕ ａ ｏ Ａ ｈ ｉ ｇ ．Ｓｉ ０ １ ３ （７ ：０３ １ １２ １ １６ Ｊ ｒ ｌ ｆ ｎ ｕ Ａ ｎ ｃ ２ １ ， １ ） １ １９— ０ ４ 。 ４ ｏ ｎ ． ９ ０
责任编辑
乔利利
责任校对
卢瑶
药 用 野 生稻 （ Ｃ） Ｃ 一栽 培 稻 （ Ａ） 源 单体 附加 系 ＭＡ Ｌ Ａ 异 Ａ ８的遗 传分 析
Ｕ ｉｅｓｔ ｆｒＮ ｔ ｎ ｉｅ ，Ｗｕ ａ ，Ｈｕ ｅ ３ ０ ４） ｎｖ ｒｉ ａｉ ａ ｔ ｓ ｙｏ ｏｌ ｉ ｈｎ ｂｉ ０７ ４
基于ITS2序列鉴定中药材升麻及其混伪品
基于ITS2序列鉴定中药材升麻及其混伪品该研究选用ITS2序列对升麻及其混伪品进行分子鉴定，从而确保用药安全。
实验采用DNA条形码技术，对升麻及其混伪品的ITS2核基因片段进行扩增并双向测序，经CodonCode Aligner V3.7.1拼接后，利用MEGA 5.0软件对相关数据分析，构建邻接（NJ）系统聚类树进行鉴定分析。
结果表明升麻药材的3个基原物种：大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia、升麻 C. foetida、兴安升麻 C. dahurica，其ITS2序列长度分别为217，219，219 bp，3个基原物种ITS2序列与混伪品的种间平均K2P距离大于其种内平均K2P距离，ITS2系统发育树显示，升麻的3个基原物种均各自聚为一单系分支，并与其他混伪品明显分开。
ITS2序列能够有效准确地鉴别中药材升麻及其混伪品。
标签：DNA条形码；ITS2；升麻；鉴定升麻始载于《神农本草经》，为处方中常用药材。
《中国药典》2010年版规定升麻为毛莨科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom. 、兴安升麻 C. dahurica（Turcz.）Maxim.或升麻C. foetida L.的干燥根茎，具有发表透疹、清热解毒、升举阳气的功效[1]。
我国升麻资源比较丰富，同属植物混用、误用现象比较明显，随着资源的逐渐枯竭，新的混伪品也不断涌现[2-5]。
因此，如何准确鉴定升麻药材是当前迫切需要解决的问题。
DNA条形码技术是基于分子生物学发展起来的技术，它是利用一段短的、标准的基因片段对物种进行快速、准确鉴定的方法[6-8]。
此技术对中药材鉴定准确，同时具有不受药材的形态特征以及发育阶段影响等优点。
在药用植物鉴定方面，陈士林等通过对6 000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，提出以ITS2为核心，psbA-trnH为补充序列的药用植物条形码鉴定体系[9-14]。
不同悬钩子属植物ITS_序列的多态性分析
不同悬钩子属植物ITS 序列的多态性分析高柱1,郭芙蓉2,杨静远2,汪琪2㊀(1.安徽国科检测科技有限公司,安徽合肥230041;2.安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036)摘要㊀以13份悬钩子属植物DNA 为模板,用PCR 技术克隆获得其ITS 序列㊂测序结果分析表明,ITS 序列总长在462~464bp ,其中5.8S ㊁ITS1和ITS2序列长度分别为164㊁208~210㊁254~255bp ㊂序列差异比对分析表明,5.8S 序列相对保守,不同悬钩子属植物仅有1个碱基差异;ITS2序列变异较大,GC 含量在53.73%~55.12%,存在32个变异位点,其中单核苷酸差异位点14个㊂基于ITS2序列的系统进化树分析表明,13份悬钩子种质资源可分为4簇,其中簇Ⅰ包含掌叶覆盆子种质资源A9㊁A29和甜叶覆盆子种质资源GH14,簇Ⅱ为HH2㊁W5和JF9等山莓种质资源,簇Ⅲ为红树莓及黑莓种质资源,簇Ⅳ为TW1㊁GA1㊁S 和GB3等插田泡种质资源㊂ITS2序列聚类分析的结果与形态特征分类的结果是一致的,表明外缘标准的ITS2序列对悬钩子属植物资源进行物种分类和鉴定是可靠的㊂关键词㊀悬钩子属;ITS 序列;克隆;分子鉴定中图分类号㊀S 663.2㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀0517-6611(2023)19-0095-05doi :10.3969/j.issn.0517-6611.2023.19.020㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID):Polymorphism Analysis of ITS Sequences in Different Rubus GeneraGAO Zhu 1,GUO Fu-rong 2,YANG Jing-yuan 2et al㊀(1.Anhui Guoke Testing Technology Co.,Ltd.,Hefei,Anhui 230041;2.School of Life Sciences,Anhui Agricultural University,Hefei,Anhui 230036)Abstract ㊀Thirteen germplasm resources in the genus Rubus were used as materials for internal transcribed spacer (ITS)sequence cloning by PCR methods.Sequence alignment analysis revealed that the full length of ITS sequences ranged from 462to 464bp.The sequence lengths of 5.8S,ITS1and ITS2were 164bp,208-210bp and 254-255bp,respectively.The comparative analysis of sequence differences showed that the 5.8S sequence was relatively conservative,with only one base difference among different rubus genera.ITS2sequence was highly varia-ble,with GC content ranging from 53.73%to 55.12%,and there were 32variation sites,including 14single nucleotide difference sites.Phy-logenetic tree analysis based on ITS2sequence showed that the germplasm resources collected can be divided into four sub-clusters.Among these germplasm resources,the genetic distance between Rubus chingii Hu A9,A29and Rubus suavissimus S.Lee GH14were divided into sub-cluster Ⅰ.Rubus corchonfolius L.F.HH2,W5and JF9were divided into sub-cluster Ⅱ,and red raspberries and black berries were di-vided into sub-cluster Ⅲ.And Rubus coreanus Miq.TW1,GA1,S and GB3were divided into sub-cluster Ⅳ.The ITS2analysis is consistent with the results of morphological feature classification,indicating that the ITS2sequence is reliable in the classification and identification of species in the genus Rubus .Key words ㊀Rubus ;ITS sequence;Cloning;Molecular identification基金项目㊀安徽省科技重大专项(202103a07020003);安徽省重点研究与开发-标准化专项项目(202104h04020036);安徽省重点研究与开发-面上攻关项目(202104a07020013);安徽省重点研究与开发-生态环境专项项目(202104i07020006)㊂作者简介㊀高柱(1981 ),男,安徽长丰人,工程师,从事食品质量分析及开发研究㊂收稿日期㊀2023-07-18㊀㊀悬钩子属(Rubus )为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇亚科(Rosoideae)中的一个属,落叶稀常绿灌木㊁半灌木或匍匐草本,多年生宿根植物㊂据统计,该属植物目前已发现700余种,分布于全世界,主要产地在北半球温带,少数分布到热带和南半球,我国有204种104变种[1]㊂悬钩子植物在我国西南地区,特别是四川㊁广东㊁广西㊁福建及云南等[2]地区有较多分布,占目前全国总悬钩子属植物种数的60%以上㊂多数悬钩子属植物的果实㊁种子㊁根及叶可入药,具有驱寒祛湿㊁止血止痛㊁清热解毒㊁活血化瘀及固肾涩精等功效[3];有些种类的果实多浆,味甜酸,可供食用[4]㊂悬钩子属植物种类繁多[5],植物分类学家对其分类进行了大量研究工作,但不同学者在悬钩子属植物的范围划分和亚属的分类方面有不同见解㊂1979年刘金[6]将悬钩子属植物分为实心莓亚属㊁刺毛莓亚属㊁空心莓亚属㊁大花莓亚属和软枝莓亚属5个亚属㊂俞德浚等[7-9]以悬钩子属植物主要器官性状特征及细胞学资料为依据,将已发现的194种悬钩子属植物分为8组24亚组,其中,空心莓组(Sect.Idaeobatus )和木莓组(Sect.Malachobatu )植物包含种类较多㊂空心莓组(Sect.Idaeobatus )植物又分为11个亚组,共83种50个变种;木莓组(Sect.Malachobatu )植物又分为13个亚组,85种35个变种㊂亚组之间的分类主要依据该植物的叶型㊁花序及叶片性状等生物学特征[10]㊂近年来,我国植物学工作者在各国家和地区又陆续发现许多新种,如腺果悬钩子(R.glandulos-ocarpus )㊁武夷悬钩子(R.jiangxiensis )㊁铅山悬钩子(R.yans-hanensis )㊁少花悬钩子(R.spananthus )和九仙莓(R.yanyu-nii ),补充并完善了我国悬钩子属植物的分类系统[11-14]㊂悬钩子属植物因其种类繁多,变异性大,类型复杂,而且存在无融合生殖现象,并伴有多倍体出现,仅依据外部形态特征进行分类比较困难㊂笔者利用DNA 条形码技术,探索悬钩子属植物ITS 序列的特征,揭示其系统进化关系,为悬钩子属植物的分类鉴定提供科学依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料㊀用于ITS 分析的13份悬钩子属核心种质资源分别采集自安徽㊁贵州㊁浙江㊁广西㊁江西和湖南,定植于安徽农业大学国家高新技术农业园,种质信息见表1㊂1.2㊀悬钩子属植物DNA 的提取㊀研钵㊁枪头㊁离心管等器材均经高温灭菌处理,利用植物DNA 提取试剂盒(艾德莱生物公司,北京)提取悬钩子属植物的基因组DNA,具体操作安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(19):95-99㊀㊀㊀参照试剂盒说明书㊂检测合成DNA 样品于-20ħ保存备用㊂表1㊀不同悬钩子属种质资源所属种类与产地Table 1㊀Species and habitats of germplasm resources in the genus Ru-bus种质资源编号Germplasm resource number种类Category 产地Producing areaA9掌叶覆盆子安徽宣城A29掌叶覆盆子安徽宣城B1-1红树莓美国B2-1黑莓美国B3-1黑莓美国W5山莓贵州安顺S 插田泡浙江丽水GH14甜叶覆盆子广西贺州JF9山莓江西抚州HH2山莓湖南怀化GB3插田泡安徽潜山TW1插田泡安徽潜山GA1插田泡安徽潜山1.3㊀悬钩子属植物ITS 序列的克隆㊀克隆ITS 序列所用的PCR 引物分别为ITS -F:GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG㊁ITS -R:CTTTTCCTCCGCTTATTGATATG,引物委托公司合成㊂PCR 反应体系参照2ˑTaq Master Mix 说明书(擎科生物科技有限公司,南京)㊂反应程序为98ħ预变性3min,变性10s;55ħ复性10s;72ħ延伸10s,35个循环;72ħ延伸2min㊂胶回收采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 试剂盒(宝生物工程有限公司,大连),胶回收产物委托公司测序㊂1.4㊀悬钩子属植物ITS 序列的生物信息学分析㊀采用基于隐马尔科夫模型的注释方法(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de /),去除测序序列的5.8S 和ITS1序列,获得ITS2间隔区序列㊂利用NCBI 网站BLAST 工具,对ITS2序列进行比对检验㊂利用DNAMAN 软件对5.8S㊁ITS1和ITS2序列进行比对;利用BioEdit 7.0软件对ITS2序列单个碱基进行分析;利用MEGA7软件对ITS2序列进行分析,利用邻接法(Neighbor Jioning,NJ)构建系统发育树㊂构建ITS2系统进化树的近缘植物的相关序列见表2㊂表2㊀蔷薇科近缘植物的ITS2序列Table 2㊀The ITS2sequences of the Rosaceae family种类TypeNCBI 登录号NCBI login numberGC %掌叶覆盆子Rubus chingii HuLC515681.156.46山莓Rubus corchorifolius L.f.JF708203.155.50欧洲木莓Rubus caesius L.sp.KU881049.157.42插田泡Rubus coreanus Miq.MT078683.157.89草莓Fragaria ananassa Duch.MN601853.165.24拟南芥Arabidopsis thalianaKM892660.154.94苹果Malus domesticaAF186480.170.30沙梨Pyrus pyrifoliaEU150028.171.962㊀结果与分析2.1㊀悬钩子属植物基因组DNA 的ITS 序列克隆及鉴定㊀选取不同悬钩子属种质资源13份,开展基因组DNA 的ITS 克隆和分析㊂以不同供试材料DNA 为模板,进行了ITS 序列的PCR 扩增,将克隆的产物进行琼脂糖凝胶回收检测,结果见图1㊂由图1可知,核心种质资源均获得单一的PCR 条带,条带大小约500bp㊂注:1~13.A9㊁A29㊁S㊁GH14㊁JF9㊁HH2㊁GB3㊁TW1㊁GA1㊁W5㊁B1-1㊁B2-1㊁B3-1㊂图1㊀13份悬钩子属种质资源ITS 序列的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1㊀Agarose gel electrophoresis of ITS sequences of thirteen germplasm resources in the genus Rubus㊀㊀对供试材料PCR 产物进行纯化回收,对测序结果进行5.8S㊁ITS1和ITS2序列分析(表3)㊂结果显示,13份悬钩子属种质资源ITS 区域的长度在462~464bp㊂ITS1的序列长度在208~210bp,GC 含量为55.29%~58.17%;ITS2的序列长度在254~255bp,GC 含量为53.73%~55.12%;13份悬钩子属种质资源的5.8S 序列相对保守,长度均为164bp,GC含量为54.27%或54.88%㊂2.2㊀悬钩子属植物5.8S 序列㊀用DNAMAN 软件对ITS 序列的5.8S 区域进行分析,结果表明,悬钩子属植物的5.8S 序列是高度保守的一个变异位点(124位的碱基A 变成G)㊂其中,A9㊁A29㊁W5㊁GH14㊁JF9㊁HH2的5.8S 区域序列一致为TAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGA-TGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAG-AATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC-A AAGCCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC;B1-1㊁B2-1㊁B3-1㊁S㊁GB3㊁TW1㊁GA1的序列一致为TAAAC-GACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAG-AACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC-CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC G AAG-CCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC㊂2.3㊀悬钩子属植物ITS2序列㊀利用BioEdit 7.0和DNA-MAN 软件对悬钩子属植物的ITS2序列进行比对和差异分析69㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年(图2)㊂结果显示,13份悬钩子属种质资源的ITS2序列变异较大,存在碱基缺失的现象㊂其中JF9㊁GB3和TW1在+14bp 处存在1个碱基缺失,B1-1㊁B2-1和B3-1在+86bp处存在1个碱基缺失㊂另外,除了A29㊁B1-1㊁S 和HH2之外,其余种质资源在+123bp 处均存在1个碱基缺失㊂ITS2含有223个保守位点,32个信息位点,其中变异位点18个,单个核苷酸差异位点14个㊂表3㊀13份悬钩子属种质资源ITS 序列的长度及GC 含量Table 3㊀Sequence length and GC contents of ITS among thirteen germplasm resources in the genus Rubus种质资源编号Germplasm resource number5.8S长度Lengthʊbp GC %ITS bpITS1长度Lengthʊbp GC %ITS2长度Lengthʊbp GC %A916454.2746420956.4625553.73A2916454.2746420956.6725553.73B1-116454.8846220857.8925455.12B2-116454.8846220857.2125455.12B3-116454.8846220857.2125455.12W516454.2746320955.5025454.33S 16454.8846421057.6225454.72GH1416454.2746420956.9425554.12JF916454.2746220855.2925454.33HH216454.2746421055.7125454.33GB316454.8846220857.6925454.33TW116454.8846220857.6925454.33GA116454.8846220858.1725454.33图2㊀13份悬钩子属种质资源ITS2序列比对Fig.2㊀Comparison of ITS2sequences among thirteen germplasm resources in Rubus2.4㊀悬钩子属植物ITS2序列系统发育㊀用MEGA7对13份悬钩子属种质资源的ITS2序列进行Kimura 2-parameter 遗传距离分析㊂并利用相关植物的ITS2序列作为内参,构建NJ 系统发育进化树㊂由图3可知,供试的悬钩子属植物与草莓亲缘关系较近(70%的自展支持率),与苹果㊁梨和拟南芥分属不同的进化支㊂不同悬钩子植物可以分为4个亚簇㊂其中,簇Ⅰ由空心莓组的掌叶覆盆子A9㊁A29和甜叶悬钩子GH143个种质资源组成,簇Ⅱ由空心莓组的山莓HH2㊁JF9和W53个种质资源组成,簇Ⅲ由悬钩子组的欧洲木莓B1-1㊁B2-1和B3-13个种质资源组成,簇Ⅳ由空心莓组的插田泡GA1㊁S㊁GB3和TW14个种质资源组成,分别获得87%㊁85%㊁96%㊁58%的自展支持率㊂7951卷19期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀高柱等㊀不同悬钩子属植物ITS 序列的多态性分析图3㊀基于ITS2序列构建的悬钩子属植物及常见植物的系统发育树Fig.3㊀Phylogenetic tree of plants in Rubus and common plants based on ITS2sequences㊀㊀通过对4种标准外缘序列进行比对,发现不同悬钩子植物ITS2序列在16~18和181~183位点上存在碱基差异,其他位置序列相对保守㊂由图4可知,掌叶覆盆子㊁山莓㊁欧洲木莓和插田泡的16~18位碱基分别为AAC㊁AAT㊁AAA 和AAC,其181~183位碱基分别为CGA㊁CGA㊁CAA 和TGA㊂因此,不同悬钩子ITS 序列的16~18位㊁181~183碱基可作为悬钩子属植物分类的候选差异位点㊂由进化关系可知,GH14与掌叶覆盆子为同缘植物,在16~18位点上与掌叶覆盆子一致,但在181~183位点上由掌叶覆盆子的CGA 变成了CGG,推测GH14可能是掌叶覆盆子与另一种悬钩子属植物的杂交或变异后代㊂遵循相同的判断依据,A29在16~18上与掌叶覆盆子一致,在124~126位点上与掌叶覆盆子不一致,而与HH2一样,HH2为山莓,推测A29可能为掌叶覆盆子与山莓的杂交后代㊂图4㊀悬钩子属植物ITS2区域的物种鉴定Fig.4㊀Identification of species in the ITS2region of plants in the Rubus3㊀讨论分子标记技术分为很多种,如RAPD 标记㊁SCAR 标记㊁DNA 序列分析㊁特殊基因引物的PCR 等技术,每种技术的用途不同㊂DNA 分子标记技术与形态学标记㊁细胞学标记和蛋白质标记等传统的标记技术相比,具有其独特性和优越性,因为它不会受到季节㊁环境等条件的限制,在植物发育的不同时期,均可便捷地获得DNA 样本[15]㊂另外,分子标记技术能够鉴别出目标DNA 的基因型是否为杂交,也可为任何植物提供较为完整的遗传信息[16]㊂因此,DNA 分子标记技术在悬钩子属植物种间种内鉴定中具有较广的应用前景,可提89㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年高悬钩子品种选育的效率㊂ITS序列共包含3个部分,分别是ITS1㊁5.8S和ITS2,其中5.8S序列保守,ITS2应用最为广泛,特别适用于植物种属之间的系统发育分析㊂Chen等[17]对6000余份样本进行测序分析,指出序列中ITS2的分辨率高达92.7%;若以属为基础,ITS2的分辨率甚至可达到99.8%㊂我国传统中药材由于长期贮藏引起材料中DNA部分降解,ITS2具有较高的PCR 扩增和测序效率,性能稳定,广泛应用于多个科属植物及药材的鉴定中[18-19]㊂例如,以ITS2为基础,针对药用植物DNA 条形码鉴定的方法也被2010版和2015版的‘中国药典“纳入[20]㊂对于药用植物中,利用ITS分析可应用于药材真伪品的鉴定上,构建药材的DNA指纹图谱[21]㊂例如,用来自全国26个不同地方的牛蒡和4个伪品为材料,ITS序列可准确将牛蒡和伪品区别开[22]㊂悬钩子属植物资源丰富,进化历程相对复杂,在进化中经历了广泛的杂交[23]㊁多倍化[24]和基因渐渗[25]等㊂因此,悬钩子属植物种间区分和进化关系亟待深入研究㊂笔者在13份悬钩子属种质资源基因组DNA提取的基础上,开展了其ITS序列克隆㊁测序和鉴定㊂研究发现,不同悬钩子属植物5.8S区域的序列相对保守,仅有一个兼并碱基(14位A 变为G)差异㊂不同悬钩子属种质资源的ITS2序列差异较大,具有区别不同品系的潜在优势㊂NJ进化树分析表明,13份悬钩子属种质资源与同为蔷薇科的草莓亲缘关系较近,分为掌叶覆盆子组㊁山莓组㊁欧洲木莓组和插田泡组4个亚簇㊂针对不同亚族间ITS2序列差异碱基,挖掘到ITS2序列在16~18和181~183位点存在种间差异,可作为候选位点区分不同亚族的品系㊂基于以上特点,该研究鉴定的ITS2序列作为属中种间的物种鉴别是可行的㊂该研究的供试种质资源包括悬钩子属栽培品种及课题组收集的地方种质资源,对其ITS序列进行了克隆和分析,为今后研究该属植物的遗传多样性和系统发育奠定了基础㊂参考文献[1]李吉进,郝晋珉,邹国元,等.高温堆肥碳氮循环及腐殖质变化特征研究[J].生态环境,2004,13(3):332-334.[2]宣景宏,张春艳,孟宪军,等.悬钩子属植物种质资源开发利用研究进展[J].北方园艺,2006(5):61-63.[3]南京中医药大学.中药大辞典.附篇[M].上海:上海科学技术出版社, 2009.[4]桂明珠,胡宝忠.小浆果栽培生物学[M].北京:中国农业出版社,2002.[5]蒋明,李嵘嵘,管铭,等.悬钩子属植物rDNA ITS序列的克隆与分析[J].中草药,2013,44(15):2143-2149.[6]刘金.果树植物种质资源研究的新成果:俞德浚著‘中国果树分类学“出版[J].园艺学报,1979,6(2):98.[7]俞德浚.中国植物志:第36卷[M].北京:科学出版社,1974.[8]俞德浚.中国植物志:第37卷[M].北京:科学出版社,1985.[9]俞德浚.中国植物志:第38卷[M].北京:科学出版社,1986.[10]李玲,汤浩茹,段娟,等.中国悬钩子属植物的分类鉴定与开发利用[J].安徽农业科学,2006,34(8):1513-1516,1570.[11]聂敏祥.江西悬钩子属一新种[J].植物研究,1989,9(3):43-45.[12]俞志雄.江西悬钩子属新分类群[J].云南植物研究,1991,13(3):254-256.[13]吴泽民,程增林.安徽蔷薇科植物新资料[J].植物研究,1991,11(4): 53-56.[14]张永田,陈丽云.福建悬钩子属一新种[J].广西植物,1995,15(1):1-2.[15]杨燕林,唐开学,和加卫,等.悬钩子属植物分子标记技术和基因组研究进展[J].中国农学通报,2008,24(8):93-98.[16]张俊卫,包满珠.分子标记在观赏植物分类中的应用[J].北京林业大学学报,1998,20(2):85-89.[17]CHEN S L,YAO H,HAN J P,et al.Validation of the ITS2region as a no-vel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One, 2010,5(1):1-8.[18]陈士林,郭宝林,张贵君,等.中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(8):1043-1055.[19]韩建萍,宋经元,姚辉,等.中药材DNA条形码鉴定的基因序列比较[J].中国中药杂志,2012,37(8):1056-1061.[20]陈士林,宋经.中草药DNA条形码物种鉴定体系[J].药学进展,2017, 41(2):87-88.[21]谢晖,晁志,霍克克,等.9种柴胡属植物的核糖体ITS序列及其在药材鉴定中的应用[J].南方医科大学学报,2006,26(10):1460-1463. [22]许亮,窦德强,王冰,等.牛蒡子及其伪品的ITS序列分子鉴定研究[J].中国中药杂志,2011,36(3):338-341.[23]ALICE L A,ERIKSSON T,ERIKSEN B,et al.Hybridization and gene flow between distantly related species of Rubus(Rosaceae):Evidence from nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region sequences[J]. Systematic botany,2001,26(4):769-778.[24]THOMPSON M M.Survey of chromosome numbers in Rubus(Rosaceae: Rosoideae)[J].Annals of the missouri botanical garden,1997,84(1):128 -164.[25]LIM K Y,LEITCH I J,LEITCH A R.Genomic characterisation and the detection of raspberry chromatin in polyploid Rubus[J].Theoretical&ap-plied genetics,1998,97(7):1027-1033.9951卷19期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀高柱等㊀不同悬钩子属植物ITS序列的多态性分析。
一种ITS2序列扩增通用引物、鉴定中药材的方法及试剂盒[发明专利]
![一种ITS2序列扩增通用引物、鉴定中药材的方法及试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2ea7edd1f80f76c66137ee06eff9aef8941e48c5.png)
专利名称：一种ITS2序列扩增通用引物、鉴定中药材的方法及试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：石林春,刘金欣,孔维军,冯继承,何志一,唐先明,马宏宇
申请号：CN201911203122.X
申请日：20191129
公开号：CN110747290B
公开日：
20220517
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种ITS2序列扩增通用引物，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示；并公开了该ITS2序列扩增通用引物在中药材鉴定中的应用。
本发明还公开了一种鉴定中药材的方法及试剂盒。
本发明克服了当前采用的ITS2条形码扩增引物ITS2F/ITS3R在通用性上存在的局限性，将引物的通用性提高达20％，在中药材鉴定领域具有重要价值。
申请人：中国医学科学院药用植物研究所,黑龙江省药品审核查验中心,哈尔滨市食品药品检验检测中心
地址：100193 北京市海淀区马连洼北路151号
国籍：CN
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基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法[发明专利]
![基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d51ee3055ef7ba0d4b733b72.png)
专利名称：基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法专利类型：发明专利
发明人：刘育辰,郝杰,刘刚,李悦,袁思文,金文渊
申请号：CN201710587759.8
申请日：20170718
公开号：CN107227367A
公开日：
20171003
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，包括对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定。
本发明能对甘草属内甘草物种进行鉴定，使得各种甘草物种容易被区分，为甘草药用情况混乱的情况，保证甘草临床用药的有效性和安全性提供了支撑。
申请人：贵阳中医学院
地址：550025 贵州省贵阳市花溪区大学城栋青南路
国籍：CN
代理机构：北京联创佳为专利事务所(普通合伙)
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水稻与药用野生稻、宽叶野生稻、高杆野生稻的ITS序列分析
水稻与药用野生稻、宽叶野生稻、高杆野生稻的ITS序列分析郑言;覃瑞【期刊名称】《生命科学仪器》【年(卷),期】2008(006)006【摘要】关于水稻与近缘稻种关系的研究方法,生物学上已有多种学说,由于目前国内外的近缘水稻rDNA的(internal transcribed spacers, ITS)以及他们的二级结构并未进行很多研究,所以本研究拟选取ITS序列作为一个分子分析指标,对他们的亲缘关系进行探索.我们用PCR扩增的方法获得了ITS,并进行PCR产物的克隆测序.材料选取包括广陆矮四号稻、药用野生稻、宽叶野生稻、高杆野生稻四种.对以上四种稻的rDNA内ITS(ITS1+ITS2)以及5.8s rDNA序列进行测定和分析.最后,本文还用软件对栽培稻与这几种野生稻ITS2的二级结构进行了预测.【总页数】11页(P30-40)【作者】郑言;覃瑞【作者单位】河南省医药学校专业科,开封,475100;中南民族大学国家民委生物技术重点实验室,武汉,430074【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.利用C基因组对高杆野生稻和宽叶野生稻基因组的比较分析 [J], 刘凤麟;赵侯明;李刚;吴绮;覃瑞;刘虹2.利用C基因组对高杆野生稻和宽叶野生稻基因组的比较分析 [J], 刘凤麟;赵侯明;李刚;吴绮;覃瑞;刘虹3.利用水稻C0t-1 DNA和基因组DNA对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组的比较分析 [J], 蓝伟侦;何光存;吴士筠;覃瑞4.水稻×野生小粒稻（O.Minuta）及水稻×药用野生稻（O.officinalis）种间杂交种的不正常胚发育及有效的胚拯救 [J], PannaneeRodrangboon;邱敦莲;等5.Bph15在非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻中的BAC-FISH比较物理定位[J], 蓝伟侦;柳哲胜;李刚;覃瑞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于ITS2条形码的人参属物种鉴定研究
基于ITS2条形码的人参属物种鉴定研究孙涛1，2，孔德英1，2，滕少娜1，2，蒋丹3，邓朝晖1，2，陆丽华1，2，何玲1，2【摘要】摘要：人参属植物种类繁多，多数具有重要的生物学及药用价值。
采用植物DNA条形码候选序列之一的ITS2片段鉴定人参属药用植物。
结果表明，ITS2基因区通用性强，序列在人参属物种间差异较大，属内变异位点为41个，保守位点189个，种内遗传距离为0～0.004，种间遗传距离为0.006～0.098，平均遗传距离为0.044。
基于K2P模型构建的系统发育树（NJ树）显示，同一物种均聚为一类。
因此，ITS2作为DNA条形码能够有效地区别人参属物种，为人参属药材及其伪混品的鉴定提供基础。
【期刊名称】湖北农业科学【年(卷),期】2016(000)019【总页数】3【关键词】人参属；DNA条形码；ITS2；鉴定人参属（Panax sp.）植物种类多样，全世界共有12个种，分布于亚洲东部、中部和北美洲，中国有7个种（包括1个外来种）、3个变种［1］。
人参属植物多数具有重要的药用及生物学价值，一直受到人们的重视，中国2010版药典记载入药的人参属植物有6个种，但其功效有一定差异，且价格相差较大。
国家食品药品监督管理总局于2013年7月对中国5个大型中药材市场的暗访摸底调查显示，商陆根、紫茉莉根、沙参等冒充人参，生晒参掺入西洋参等假冒伪劣、掺杂使假的现象屡见不鲜。
对人参属药用植物进行准确鉴别是开展相关研究的基础，对植物资源保护和药用植物安全合理利用具有重要意义。
有关人参属植物的检验鉴定，传统方法一般是基于形态性状的基源鉴定、显微鉴定和理化鉴定［2］，但由于这些性状特征与环境紧密相关，时而发生变化，且制成中成药后更难对其进行鉴别。
随着分子生物学的发展及应用，RAPD、AP-PCR、RFLP等技术已应用于部分人参属物种及其伪混品的研究［2］。
虽然每一种分子鉴定技术都有其特定的优势及应用范围，同时多数研究都集中于人参、西洋参、三七等几类药材的鉴别，但在通量及通用性上尚有欠缺，没有标准的国际化平台，难于大范围推广。
基于ITS2条形码序列鉴定中药材佩兰及其混伪品
基于ITS2条形码序列鉴定中药材佩兰及其混伪品邬兰;陈科力;孙伟;胡志刚;涂媛;马孝熙;林韵涵;周红【期刊名称】《世界科学技术：中医药现代化》【年(卷),期】2013(015)003【摘要】目的：对中药材佩兰及其混伪品进行ITS2条形码鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。
方法：提取佩兰的DNA,利用PCR技术扩增其ITS2序列,双向测序,所得序列经过CodonCodeAligner拼接后,用软件MEGA5进行相关数据分析,计算其种内、种间遗传距离,并构建系统发育树。
结果：佩兰药材的ITS2序列长度为218 bp;佩兰种内最大K2P距离为0.009,与混伪品种间最小K2P距离为0.024。
ITS2序列的NJ系统聚类树可明显区分佩兰药材及其混伪品,表现出良好的单系性。
结论：ITS2条形码序列能够成功鉴定中药材佩兰与其混伪品,为保障临床安全用药提供了新的技术方法。
【总页数】5页(P410-414)【作者】邬兰;陈科力;孙伟;胡志刚;涂媛;马孝熙;林韵涵;周红【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】R282.5【相关文献】1.基于ITS2条形码序列鉴定中药材续断及其混伪品 [J], 雷美艳;陈晓辰;马晓冲;钱齐妮;竭航;易思荣;宋经元2.基于ITS2条形码的中药材威灵仙与其易混伪品的鉴定 [J], 曾旭;李莉;业宁;姚辉;刘志华;秦民坚3.基于ITS2条形码序列鉴定中药材两头尖及其混伪品 [J], 任伟超;马伟;安超;马孝熙;邬兰;孙伟4.基于DNA条形码(ITS2)的中药材防风与其混伪品的鉴定 [J], 林好;钱洁颖;李斯璐;欧辉鸿;夏海珊;刘镛5.基于ITS2条形码序列鉴定中药材佩兰及其混伪品＊ [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定
基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定高婷;朱珣之【摘要】目的:通过DNA条形码鉴定技术区分中药材藤梨根及其常见混伪品.方法:对采集的中药材藤梨根样品及其常见混伪品进行DNA提取,PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner 3.5.7对所获ITS2序列进行拼接.应用MEGA 5.0软件计算藤梨根及其常见混伪品的Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离,并构建NJ(邻接)系统聚类树,最后分析种间ITS2序列的二级结构差异.结果:中药材藤梨根两种基原植物的平均种内K2P遗传距离分别为0.001和0.002,远小于藤梨根与其常见混伪品之间的平均K2P遗传距离0.120;藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异;NJ树显示藤梨根的基原植物聚在一起,与混伪品可明显区分,但无法区别所有猕猴桃属植物.结论:ITS2序列可高效区分藤梨根及其常见混伪品,弥补了传统鉴定方法的不足,提高了鉴定效率及准确性.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2016(018)002【总页数】7页(P214-220)【关键词】中华猕猴桃;DNA条形码;ITS2序列;分子鉴定【作者】高婷;朱珣之【作者单位】青岛农业大学生命科学学院山东省高校植物生物技术重点实验室青岛266109;青岛农业大学生命科学学院山东省高校植物生物技术重点实验室青岛266109;江苏科技大学生物技术学院镇江212018【正文语种】中文【中图分类】R282.5藤梨根Radix Actinidiae别名圆枣子、藤梨、洋桃藤，为猕猴桃科猕猴桃属植物中华猕猴桃Actinidia chinensis Planch.或软枣猕猴桃Actinidia arguta Planch.的干燥根[1]。
藤梨根味甘、咸寒、微涩，具有清湿热、降血脂、治黄疸、促进食欲、畅通乳络的功效，在中国分布广泛，应用历史悠久[2]。
现代药理研究表明，藤梨根具有明显的抗肿瘤活性和调节免疫功能，尤其对肠道癌疗效甚佳[3,4]。
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植物遗传资源学报2011，12（3）：442-
447J o ur na l o f P l a nt G e ne t i c R e s o ur c e s
药用野生稻复合体I
T S 1和I T S 2序列变异及其系统进化分析
龚汉雨，刘如亮，董正伟，刘 虹，覃 瑞，李 刚
（中南民族大学生命科学学院/国家民委生物技术重点实验室，湖北武汉430074）
摘要：通过P
C R 扩增并测序分析稻属药用野生稻复合体5个野生稻种基因组完整的I T S 区及5.8S 区，并与栽培稻I T S 序列进行比较，构建分子系统进化树，探讨了稻属药用野生稻复合体内不同种间的亲缘关系和系统进化。
结果表明，I
T S1和I T S2均有较高的G /C 含量，I T S1序列的长度多态性相对较高，I T S2序列的碱基突变频率较高。
药用野生稻和高秆野生稻亲缘关系很近，而与栽培稻亲缘关系较远；短药野生稻、斑点野生稻、澳洲野生稻与药用野生稻亲缘关系渐近，处于进化的过渡阶段。
关键词：药用野生稻复合体；系统进化分析；I T S 序列P h yl oge n e t i c A n al ys i s of O r y z a of f i c i n al i s C om p l e x
B as e donR i b os om e I T S 1an dI T S 2S e q u e n c e s
G O N GH a n-y u ，L I UR u-l i a ng ，D O N GZ he ng -W e i ，L I UH o ng ，Q I NR ui ，L I G a ng
（K e y Lab o r at o r y o f St at e E t hni c A f f ai r s C o m m i s s i o n f o r B i o l o gi c al T e c hno l o gy /C o l l e ge o f Li f e Sc i e nc e s ，
So ut h-C e nt r al U ni v e r s i t y f o r N at i o nal i t i e s ，W uhan 430074）
A b s t r ac t ：F i v e w i l d r i c e s pe c i e s i n t he O .o f f i c i nal i s c o m pl e x a nd t w o c ul t i v a t e d r i c e v a r i e t i e s w e r e phy l o g e ne t -i c a na l y z e d ba s e d o n t he r i bo s o m e I T S1a nd I T S2s e que nc e s .T he i r c o m pl e t e I T S a nd t he 5.8S s e que nc e s o n t he r i -bo s o m e r e g i o n w e r e a m pl i f i e d by po l y m e r a s e c ha i n r e a c t i o n t e c hni que a nd w e r e a na l y z e d by o nl i ne s o f t w a r e C L U ST -A LW （2.0.12）M ul t i pl e Se que nc e A l i g nm e nt s a nd N e i g hbo r J o i ni ng .T he r e s ul t s s ho w e d t he I T S s e que nc e s a l l ha d hi g h G /Cc o nt e nt s .
B y c o m pa r i s o n ，t he I T S1ha d r e l a t i v e l y hi g h s e que nc e l e ng t h po l y m o r phi s m a nd t he I T S2ha d m o r e ba s e m ut a t i o ns .O .o f f i c i nal i s a nd O .al t a w e r e c l us t e r e d t o g e t he r i n t hephy l o g e ne t i ct r e ea nd t he yw e r ef a r f r o mt he c ul t i v a t e d r i c e s pe c i e s .T he O .aus t r al i e ns i s ，O .p unc t at a a nd O .b r ac hy ant ha w e r e l o c a t e d be t w e e n t he s e t w o c l us t e r s a nd t he y w e r e o n t he i nt e r i mpha s e o f r i c e e v o l ut i o n.
K e y w or d s ：O .o f f i c i nal i s c o m pl e x ；I T S ；P hy l o g e ne t i c a na l y s i s
收稿日期：2010-
08-17 修回日期：2010-11-02基金项目：中南民族大学青年基金（Y Z
Q 05002）；湖北省自然科学基金（2008C D B 392）；中南民族大学自然科学基金（y z z 08005）作者简介：龚汉雨，硕士，主要从事植物分子细胞遗传研究。
E -
m a i l ：g o ng ha ny u@m a i l .s c ue c .e du.c n 通讯作者：李刚，博士，讲师，主要从事植物遗传与资源开发研究。
E -m a i l ：l g 863@y a ho o .c o m .c n 在稻属（O r
y z a ）中，栽培稻有亚洲栽培稻（O .s a-t i v a L .）和非洲栽培稻（O .gl ab e r r i m a St e ud ）两个种；而野生稻有20多个种，包含了A A 、B B 、C C 、B B C C 、
C C
D D 、
E E 、
F F 、
G G 、
H H J J 和H H K K 共10个不同类型的基因组[1-3]。
稻种在世界范围内的分布广而复杂，植株性状在种间变异较大，而且种间杂交事件和多倍体普遍存在。
为了便于稻属中种的界定和合理
体现各个种间的关系，V a ug ha n 等[4-5]把稻属分成4个复合体，即栽培稻复合体（O .s at i v a c o m pl e x ）、药用野生稻复合体（O .o f f i c i nal i s c o m pl e x ）、马来野生稻复合体（O .r i dl e y i c o m pl e x ）、疣粒野生稻复合体（O .m e y e r i ana c o m pl e x ）。
药用野生稻复合体是稻属中最大的复合体，有10个种，包含B B （斑点野生稻，O .p unc t at a ），C C （药用野生稻，O .o f f i c i nal i s ），E E （澳洲野生稻，O .aus t r al i e ns i s ）、F F （短药野生稻，O .b r ac hy ant ha ）等二倍体和C C D D （高秆野生稻，O .al -。