3大肠杆菌感受态细胞制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理;二、原理一大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态;感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等;细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等;本实验为了把外源DNA重组质粒引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞;在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数;而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生;目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一;主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞;证据有：1发芽的芽孢杆菌容易转化；2大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化；3适量的溶菌酶能提高转化率;2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA 分子能进入细胞;证据是：1蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用；2细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现；3分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞;目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,但是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答;有人根据pBR322 质粒DNA对Ecoli K――12X1776菌株的转化结果,认为：近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在的100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来的水平;二重组DNA 的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新的遗传特性,并从中选出转化子;作为受体的大肠杆菌C600 或DH 5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常是rec基因缺陷型的突变体,同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株;这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解;保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性;制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷rk-mk-rec-同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感Ap;在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素Ap基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新的特性,即Ap 抗性;同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因lacZ,我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因lac Z,使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子;因pUC18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pU C18 DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活;此为初步的抗性筛选;pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个的编码序列;这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能; DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息;在各自独立的情况下,pUC18 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性;但在pUC18 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质;这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补;由α-互补产生的Lac 细菌较易识别,它在生色底物X-gal5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷存在下被IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导形成蓝色菌落;当外源片段T GFβⅠ插入到pUC18 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落;由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开;此为α-互补现象筛选;本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合,使其进入受体细胞;DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附――完整的双链DNA 分子吸附在受体菌表面;2、转入――双链DNA 分子解链,单链DNA 分子进入受体菌,另一链降解;3、自稳――外源质粒DNA 分子在细胞内又复制成双链环状DNA;4、表达――供体基因随同复制子同时复制,并被转录和翻译;对DNA 分子来说,能被转化进受体细胞的比率极低,通常只占DNA 分子的%,改变条件,提高转化率是很有可能的,一些研究表明下列因素可以提高转化率：1受体菌细胞与DNA 分子两者比例在×108 细胞：1毫微克DNA分子左右转化率较好；2DNA 分子与细胞混合时间为1小时最佳；3铺平板条件会影响转化率；4对不同转化菌株热处理效应不一致;除上述因素外,转化试验还注意如下问题：1、连接DNA 反应液与受体细胞混合时,一定保持在冰浴条件下操作,如果温度时高时低,转化效率将极差;2、热处理2 分钟后,要迅速加进1 毫升LB 以使表型表达,延迟加LB,将使转化率迅速降低;3、在平板上涂布细菌时;注容避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械压涂布将会使细胞破裂;影响转化率;三、材料一仪器与器皿恒温振荡器电动沉淀旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温锅恒温普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶刻度保温瓶酒精灯等二大肠杆菌C600 或DH5αrk rec mk三培养基与试剂液体培养基1% %酵母粉%NaCl ;2、100mmol/ L CaCl23.氨苄青霉素溶液50 毫克/毫升连接反应液储液20mg/ml: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃;储液200mg/ml: 在800μl水中溶解200mg IPTG后,用水定容至1ml,用μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃;7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板;8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;四、实验步骤一大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜;2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜约16 小时,必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染;3、用无菌条件下,取过夜培养液1 毫升,接种于新鲜的LB 中100毫升LB/250毫升三角瓶,接种量按菌液浓度而定,一般在1%左右,于恒温振荡器上37℃培养2―3小时;4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照,在751 上测OD550的光密度值,约为― 左右;5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入毫升EP 中应带盖并高压灭菌过,每组2 支;6、带菌液的置于冰上10 分钟,冷却菌液,平衡好,置于台式低速上,3500r/min 离心5 分钟;7、无菌条件下,倒去上清LB,倒斜,让LB 流干,留下沉淀菌体,加入预冷的100mmo l/L CaCl2溶液600微升,用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使其悬浮后,把2支管转为1支,摇匀后于冰浴中放置30分钟;8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速上,3500r/min离心10分钟,小心侧倒掉上清CaCl2,留沉淀菌体;9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液;此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高;10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal 储液和4μlIP TG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用;二重组DNA 转化1.取大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液的Eppendorf管,混匀,置冰浴中30 分钟;2.冰浴后,将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温槽内,保温2分种;3.热冲击处理后的细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1 毫升,无抗菌素LB 液,有助于基因表达马上置37℃1 小时,每10 分钟翻转1 次;4.用取毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,共涂布三个培养皿;5.用取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40 ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,作为受体菌对照;6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右,使涂布上的菌液干燥不会流动;然后倒置放于中37℃培养过夜;7.第二天取出培养皿,观察对照平皿和转化平皿菌落情况;对照平皿因受体菌对Am p 敏感,故不能在含Amp的培养基上生长;转化平皿是否有兰色和白色菌落生成如果长出兰色菌落,说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌,但目的基因没有接入载体;如果长出白色菌落,说明目的基因已接入载体,重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落;五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿,讨论转化成败原因.。
第3章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从—70℃或—20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。
3-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四：大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E·coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：（1）大肠杆菌受体菌培养时间为OD550=0.2—0.3（5—6107细胞/毫升）最好；（2）菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；（3）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；（4）菌体在pH 为6.0 的溶液悬浮时最为适宜。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6个月。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第5页
试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin Quan-Wen Lab at XMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中，可以准备两管。
37︒C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天：1．取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。
37︒C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。
2．将菌液在冰上预冷30分钟。
同时，开启离心机，预冷至4︒C。
3．随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4︒C，4000rpm离心15分钟。
4．弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。
4︒C，4000rpm离心15分钟。
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。
4︒C，4000rpm，离心15分钟。
6．弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。
4︒C, 4000rpm, 离心10min。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。
8．将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70︒C冰箱中保存。
9．检测转化效率：取100μl新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10μl (1%)和100μl (10%)涂板，估测转化效率。
大肠杆菌感受态细胞制备与转化
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
实验原理：带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作用下，会发生膨胀，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。
实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2 (0.1M)等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等实验步骤：1、取-70℃冰冻大肠杆菌DH5α菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。
2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
3、次日取菌液30 μL接种至含有3 ml LB培养基的试管中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。
4、当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中。
4℃,5000rpm离心5min。
弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
4、当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中。
4℃,5000rpm离心5min。
弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
制备感受态1、加200 μL冰预冷的0.1M CaCl2到离心管中，振荡混匀，使菌体悬浮，冰浴30min。
2、4℃，5000 rpm离心5分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上，吸干残留液体。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
板。
2、Amp母液：
称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤 器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞 时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞 可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基 因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表 现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计 转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg) （注：理想值可达5×106～ 2×107转化子/ μg DNA）
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所 有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于 0℃冰箱储存 .
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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（三）涂平板培养
1、取200 µ l，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（用玻璃 棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 2、菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱 内培养过夜（12-16小时） 3、观察结果
转化率
统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据 此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／ 涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质 粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体 积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
实验原理
外源DNA导入细菌的几种方法
（1）转化（transformation)
感受态细菌捕获质粒DNA的过程
（2）转染（transfection)
细菌捕获噬菌体DNA的过程
（3）转导（transduction）
借助噬菌体把外源DNA导入受体细菌的过程
实验原理
转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化 学试剂法 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( Transformant )。
Байду номын сангаасAmp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器
超净工作台
离心设备
台式高速冷冻离心机
恒温空气摇床
恒 温 培 养 箱
培 养 皿
实验试剂
大肠杆菌DH5α
LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒
实验步骤
菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化
菌，可使转化率提高100～1000倍。
影响转化率的因素
④质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小 质粒进行转化时发现，从2kb到3.2kb的转化效率上升，此后到 66kb转化效率线性下降。同时，开环状质粒只有超螺旋质粒转 化率的75％，线型质粒的转化率更要低100～1000倍，线型转化 率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因。 ⑤菌株基因型recA+与recA—的影响：recA基因是rec系列中最 主要的基因，编码同源重组蛋白。考虑到质粒DNA在recA+菌中 存在与细菌染色体DNA整合的可能，因而，通常在转化实验中都 选用recA—菌株作为宿主菌。
（一）大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）
1、从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于2 ml LB液体培养基
中，37℃ ×250 rpm振荡培养过夜。将该菌悬液以1:100～1:50转接
于20 ml LB液体培养基中，37℃ ×280 rpm振荡扩大培养3 ～4小时 2、每组取1个1.5 ml离心管，加入1.5ml菌液，在冰上冷却2 min后，于 4℃ × 5000 rpm离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行 ，且速度尽量快而稳） 3、弃上清液，加入1 ml冰冷的100mM CaCl2溶液，轻轻悬浮细菌，冰 上放置30 min
实验结果
影响转化率的因素
①生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成
感受态。转化时菌浓度应控制在不超过107／ml。 ②CaCl2法0℃放置时间的影响：细菌经0℃ CaCl2处理 后转化率随时间的推移而增加，24h达到最高，之后转 化率逐渐下降。 ③化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上，联合其 他二价金属离子(如Mn2+)、DMSO或还原剂等物质处理细
另一链则被降解。
（3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA （4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转 录及翻译。
实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2
处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共 保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的 基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉 的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体 细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上 培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞 则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到
含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落
转化的确切机制还不清楚
实验原理
● 质粒DNA转化的过程
（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。 （2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而
4、4℃ × 5000rpm离心5min
5、弃上清液，加入100µl冰冷的100mM CaCl2溶液，小心悬浮细菌，即 制成了感受态细菌悬液
（二）质粒DNA转化感受态细菌
1、取1 µ l质粒DNA加入到100 µ l感受态细菌中，轻轻混匀，冰上 放置30min 2、于42℃水浴中热休克90S，迅速取出放置冰上冷却2 min 3、向上述管中加入0.5 ml LB液体培养基，摇匀后于37℃ ×120 rpm振荡培养约45-60min
自前往后分别为：超螺旋、线性 及开环质粒DNA
实验四 大肠杆菌感受态制备及外源DNA 的转化
实验目的
1. 了解转化的概念及其在分子生物学研 究中的意义。 2. 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细 胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞 并筛选转化体的方法。
实验原理
转化( Transformation )是将异源 DNA 分 子引入另一细胞品系，使受体细胞获得 新的遗传性状的一种手段，它是微生物 遗传、分子遗传、基因工程等研究的基 本实验技术。
基 本 原 理
感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的 羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸 收DNA复合物