血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

凝胶层析的特点
1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。有 ．凝胶层析操作简便，所需设备简单。 时只要有一根层析柱便可进行工作。 时只要有一根层析柱便可进行工作。分离 介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样 介质 凝胶完全不需要像离子交换剂那样 复杂的再生过程便可重复使用。 复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出的是 ．分离效果较好，重复性高。 样品回收率高，接近100％。 样品回收率高，接近 ％。 3． 分离条件缓和 。 凝胶骨架亲水 ， 分离过 ． 分离条件缓和。 凝胶骨架亲水， 程又不涉及化学键的变化， 所以对分离物 程又不涉及化学键的变化 ， 的活性没有不良影响。 的活性没有不良影响。
常用的层析方法
（1）凝胶层析 ） （2）离子交换层析 ） （3）亲和层析 ） （4）吸附层析 ） （5）分配层析 ）
凝胶层析法
凝胶层析（ 凝胶层析（gel chromatography）常 ） 如凝胶过滤、分子筛层析、 出现多种名称 ：如凝胶过滤、分子筛层析、 排阻层析、凝胶渗透层析等。 排阻层析、凝胶渗透层析等。
－、凝胶层析的基本原理 －、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始， 散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小 散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分 分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱， 大分子行程较短 子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物， 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒 犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时， 犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对 分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只 能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动， 能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此 流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱； 流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱； 反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝 反之， 胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔， 胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中， 移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再 进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出， 进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布， 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布， 部分进入颗粒， 部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质 之间被洗脱。这样，经过层析柱， 之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的 各物质按其分子大小不同而被分离。 各物质按其分子大小不同而被分离。
凝胶层析的定义： 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分 子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、 子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状 不同的分子进行层析分离， 不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围： 凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过 的样品， 分子大小彼此相差 的样品 单一凝胶床就可以完全将它们分开。 单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用 凝胶的分子筛特性， 凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、 凝胶层析具有设备简单、操作方便、 分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 目前已被广泛应用于各种生化产品的分离 和纯化。 和纯化。
• 3、装柱： 、装柱： 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的洗脱 将处理好的凝胶在烧杯内用 倍体积的洗脱 液搅拌成悬浮液， 液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱 待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开底 左右时， 中。待底部凝胶沉积至 左右时 端出口管， 端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝 胶体积沉淀至25cm高度为止。操作中注意防止气 高度为止。 胶体积沉淀至 高度为止 泡与节痕产生。 泡与节痕产生。 注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得 注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续 不得 有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整， 有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可 用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起， 用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自 然下沉。 然下沉。
实验操作
• 1、凝胶处理； 、凝胶处理； • 将SephadexG-25凝胶干粉放入过量水 凝胶干粉放入过量水 中浸泡24小时或沸水浴 小时。 小时或沸水浴2小时 中浸泡 小时或沸水浴 小时。浸泡后搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后， 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细 粒悬浮，如此反复多次。 粒悬浮，如此反复多次。
凝胶过滤层析经常遇见的问题
1．流速慢 ． （1）有气泡、出水管阻塞 ）有气泡、 （2）没打开夹子 ） （3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 ）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 接头漏气） 接头漏气） 2．拄内产生气泡 ． （1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流 ）上水口不流或皮管破裂， （2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧 ）接口漏气，
3．条带扭曲 ． （1）胶面不平 ） （2）样品或洗脱液中有颗粒 ） （3）装拄不均匀 ） 4．分辩率不高 ． （1）装拄不均匀 ） （2）样品量过大 ） （3）流速太快 ） （4）拄不垂直或拄不合适 ）
（5）长菌 ） （6）拄下口软管太长 ） （7）胶不适当 ）
• 葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶能被微生物（如细菌和 霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作 用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生 长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为 防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、 ％叠氮化钠、 0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其 三氯叔丁醇（ 三氯叔丁醇 仅在弱酸有效， 他离子交换剂） 他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯 ％洗必泰、 ％ 在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂） 汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂） 以及0.1mol／L氢氧化钠溶液等作防腐剂 氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析 以及 ／ 氢氧化钠溶液等作防腐剂 前再用水或平衡液将防腐剂洗去。
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
实验目的
• （1）掌握凝胶层析的原理 ） • （2）掌握柱层析的基本装置 ） • （3）熟悉凝胶层析的操作过程 ）
实验原理
凝胶层析又叫分子筛层析， 凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不 同的物质进行分离的方法。 同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝 胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子 胶时 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用 分子 大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。 大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚 糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267） 糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为 ） 和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样 和血红蛋白（红色，相对分子质量为 ） 在层析时，血红蛋白相对分子质量大， 品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶 颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小， 颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速 度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小， 度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝 胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢， 胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢， 后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。 后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。
打开平衡好的色谱柱底端出口， 打开平衡好的色谱柱底端出口，使柱 内溶液流至床表面相切时时关闭出口。 内溶液流至床表面相切时时关闭出口。将 吸有0.5ml样品的加样滴管在床表面 样品的加样滴管在床表面lmm处 吸有 样品的加样滴管在床表面 处 沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底 端出口使样品流至床表面，关闭出口， 端出口使样品流至床表面，关闭出口，用 少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面l-2次 少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面 次， 使样品流至床表面， 使样品流至床表面，然后将洗脱液在柱内 约加至2-3cm高，接上高位贮液瓶并调好流 约加至 高 速即开始洗脱（注意： 速即开始洗脱（注意：在加样和洗脱过程 中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面， 中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影 响分辨率）。 响分辨率）。
• 4、平衡： 、平衡：
柱装好后，使色谱床稳定5-10分钟， 柱装好后，使色谱床稳定 分钟， 分钟 然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调 然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞， 节高位贮液瓶的高度， 节高位贮液瓶的高度，控制流速为 1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平 。 倍于床体积的洗脱液进行平 是层析床稳定。 衡，是层析床稳定。 注意：在洗脱时， 注意：在洗脱时，要将恒流泵至色谱 桂的连接管内气泡全部排除， 桂的连接管内气泡全部排除，以免影响流 另外务必防止流速过大以及过小， 速。另外务必防止流速过大以及过小，造 成色谱床液体流干。 成色谱床，如肽类、 ．应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、 激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、 激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、 脱盐、浓缩以及分析测定等。 脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子 量范围也很宽，如Sephadex G类为 量范围也很宽， 类为102～ ～ 类为 105d；Sepharose类为 类为105～108d。 ； 类为 ～ 。 5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层 ．分辨率不高，分离操作较慢。 析是以物质分子量的不同作为分离依据的， 析是以物质分子量的不同作为分离依据的， 分子量的差异仅表现在流速的差异上， 分子量的差异仅表现在流速的差异上，所 以分离时流速必须严格把握。 以分离时流速必须严格把握。因而分离操 作一般较慢。 作一般较慢。而且对于分子量相差不多的 物质难以达到很好的分离。此外， 物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层 析要求样品粘度不宜太高。 析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时 还有非特异吸附现象 。