精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法
GUS酶活检测方法
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性试剂准备：1.GUS提取缓冲液：50mmol 磷酸钠(PH7.0)10mmol EDTAO.1% Triton X-1000.1% Sarcosyl10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/1 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。
4℃暗处可以贮存一个月。
贮存中有可能发生结晶。
3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。
4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。
操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：1．取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。
2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。
GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。
按上表制作BSA梯度液。
从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。
吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。
测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。
GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。
2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。
谷氨酰转肽酶干化学法100
谷氨酰转肽酶干化学法100
谷氨酰转肽酶（GPAT）干化学法是一种用于测定谷氨酰转肽酶活性的实验方法。
以下是该方法的步骤：
1. 准备实验材料：谷氨酸、甘油-1-磷酸钠、NaOH溶液、硫酸铵、三乙胺、2,4-二硝基苯胺溶液、乙酸乙酯。
2. 准备试样：分别取一定量的目标组织或细胞裂解液，并进行蛋白含量的测定。
3. 预处理样品：将试样加入NaOH溶液中，并加入硫酸铵溶液进行酸化处理。
4. 合成底物：将谷氨酸和甘油-1-磷酸钠混合，加入适量的NaOH溶液进行搅拌，形成底物液。
5. 反应：将处理后的样品与底物液混合，加入三乙胺和2,4-二硝基苯胺溶液，并进行孵育反应。
6. 提取：加入乙酸乙酯提取反应液中的产物。
7. 测定：使用分光光度计对提取物进行测定，根据吸光度的变化可以计算出谷氨酰转肽酶的活性。
这是谷氨酰转肽酶干化学法的基本步骤，具体操作中可能还会有一些细微的差异和优化步骤。
在进行实验前，需要根据实际
情况进行实验设计和样品处理，并确保仪器设备的正确使用和操作流程的规范性，以获得准确可靠的结果。
谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)活性测定试剂盒使用说明
谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)活性测定试剂盒使用说明产品简介：GLS存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。
产品内容：试剂一×1瓶，60mL，4℃保存；试剂二×1瓶，50mL，4℃保存；试剂三×1瓶，60mL，常温保存；试剂四×1瓶，12mL，常温保存；试剂五×1瓶，6mL，常温保存；试剂六×1瓶，6mL，常温避光保存。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入0.9ml试剂一研钵中研磨均匀，于48000rpm℃离心10min，取上清，作为待测液（粗酶液）。
二、测定步骤：1、空白管：（1）蒸馏水0.05mL，加试剂一0.2mL，加试剂二0.8mL，混匀后37℃水浴1h；（2）加入试剂三1.05mL，混匀后8000rpm离心10min；取上清液1.0mL到新离心管中，加入试剂四0.23mL，混匀；（3）取0.8mL到新离心管中，依次加入试剂五0.1mL和试剂六0.1mL，混匀后等待10min，即可用于调零。
2、样品管：仅需要把蒸馏水0.05mL换成粗酶液0.05mL即可，其余同空白管。
3、实际测定只要做一个空白管，用于调零，于420nm处比色，记录吸光值，记为A。
GLS活性计算：1、酶活性单位定义：37℃下每mg蛋白质每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨。
2、计算公式：GAA（U/mg prot）＝363.1×(A－0.1301)÷蛋白质浓度（mg/mL）。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
GUS酶活性测定
实验注意事项： 4-MU梯度浓度液的配置时需要根据预估样品的浓度范围来确定，要求 是4-MU的浓度梯度要跨过样品的浓度范围。 预估时可以参考一下数据： 0.05nmol的MU的荧光强度是843; 0.1nmol是1968; 1.5nm品（叶、根）20mg于预冷的1.5mL eppendorf管中，加入液氮研磨成粉末，加 入200uL的提取buffer，混匀； • 13000rpm, 4℃离心15min，吸取上清于另一 eppendorf管中4℃备用。可以做几个平行。
MU标准曲线的制作
用反应终止液将MU母液（1mM）稀释成浓度范围在0－10uM的 系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
2、GUS assay buffer :
称取22mg 4-MUG于50ml的 GUS extraction buffer中，4℃ 保存。
4、G-250 dye:
3、Stop solution:
0.2M Na2CO3
实验结束后清洗工作: • 96孔板用过以后用清水洗净,然后用碱液(氢 氧化钠溶液)浸泡一个小时后用清水洗净后 烘干后备用. • 测蛋白的比色杯用酒精洗净后用清水洗净, 烘干后备用.
测定原理
GUS酶活性
（pmol 4-MU/hr/ug protein)
反应底物（4-MU）的物质的量 反应时间*蛋白含量 反应底物（4-MU）的浓度*（体积） 反应时间*蛋白浓度*（体积）
注： 1. 4-MU的浓度是由荧光分光光度计测得数值后从标准曲线上读数获得； 2. 反应时间可以设置梯度时间：5min、10min、20min、30min、45min和 60min等, 也可以只取一个时间； 3. 蛋白浓度是通过考马斯亮蓝法测得吸光度后从BSA标准曲线读数获得。
氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管
氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管是一种用于检测样品中氨基酸脱羧酶活性的试剂盒，由不同种类的氨基酸和相关酶组成。
该试剂盒可用于各种样品中氨基酸脱羧酶的检测和鉴定，如食品、饲料、药品等。
使用氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管时，需要将待测样品与试剂盒中的试剂混合，并在适宜的温度下培养一定时间。
然后根据样品的颜色变化和对照管的比较，判断待测样品中是否存在氨基酸脱羧酶活性。
需要注意的是，在使用氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管时，应严格按照说明书上的操作步骤进行，以免影响检测结果的准确性。
同时，对于不同的样品和实验条件，可能需要进行适当的调整和优化。
重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验
重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验一、实验目的了解原核表达系统熟悉并掌握粗酶液的制备方法熟悉并掌握谷氨酸脱羧酶活力的测定方法熟悉并掌握超声破碎仪及U-V1100紫外可见分光光度计使用方法二、实验原理γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白氨基酸，是目前研究较为深入的哺乳动物脑组织一种重要的抑制性神经递质，具有一系列的生理功能，例如降血压功能、治疗癫痫、抗疲劳、提高免疫力等。
谷氨酸脱羧酶（GAD,EC4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，能专一催化L-谷氨酸脱羧成为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。
催化效率——即酶的活力是酶的重要参数，研究酶的活力是研究酶性质及应用的基础。
本实验通过测定谷氨酸脱羧酶催化产物γ-氨基丁酸产率来定义谷氨酸催化活力。
谷氨酸脱羧酶催化反应式如下：L-谷氨酸谷氨酸脱羧酶（GAD）γ-氨基丁酸（GABA）GAD现行测定方法及优缺点测定方法优点缺点HPLC法准确灵敏度高操作复杂、测定时间较长氨基酸自动分析仪法稳定操作简单仪器使用复杂、昂贵纸层析和薄层层析法方便简单稳定性差、适合定性测量Berthelot比色法灵敏度高、方便简单有游离氨干扰毛细管电泳法耗材少，环境污染小重现性较差根据样品的特性及实验的需要，本实验采用Berthelot法测定反应液中GABA。
GABA的测定方法采用Berthelot法，该方法利用苯酚和次氯酸钠与氨基反应生成蓝绿色物质(次氯酸钠氧化苯酚生成醌，醌和氨基反应生成蓝绿色物质)。
Berthelot法对GABA（ω-氨基酸）的响应高，而对L-谷氨酸（α-氨基酸）响应低，所以用Berthelot法可以快速、高灵敏度测定出催化反应产物中的GABA。
通过测定一定时间反应液中的GABA的吸光度值从而得到GABA的浓度，最终计算出谷氨酸脱羧酶的活力。
三、实验材料和主要仪器1、仪器MIKRO 220R 2205型低温冷冻离心机UV-1100型紫外可见分光光度计水浴锅ZHWY-110XAB104-N型电子分析天平FS-250N型超声破碎仪2、主要器皿100mL容量瓶、烧杯、样品瓶、5mL试管、5mL离心管、10mL离心管、50mL离心管3、试剂和材料γ-氨基丁酸（GABA）标准品（sigma公司）L-谷氨酸钠（味精）磷酸盐缓冲液（PBS）：8g/L NaCl,0.2g/L KCl,1.42g/L Na2HPO4,0.27g/L KH2PO4,加入浓盐酸调节pH至7.4Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH4.8，含0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸，20mL）：0.2M Na2PO49.86mL,0.1M柠檬酸10.14mL混合。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用
１．４．４反应溶液：新鲜配制不同类型、浓度的缓冲液，内含１０㈣ｌ／Ｌ ＬＭｓＧ和
ｏ．１—删ｏｌ／Ｌ Ｐ凹作为底物溶液。次氯酸钠（含活性氯５．２５％），新鲜配制的６％苯酚溶液 和２０姗诎，Ｌ ＧＡＢＡ溶液，冰箱保存备用。 １．４．５标准测定方法：２００皿底物溶液和１００止酶液在３０℃反应一定时间（根据活力 大小确定０．５～２０ ｈ），然后置于冰浴中，加入２００皿０．２ ｍｏｌ／Ｌ硼酸缓冲液（ｐＨ９．０）终 止反应，再加入１．ｏ ｎ１Ｌ ６％苯酚和４００皿次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反 应１０ ｍｉｎ，迅速在冰浴中冷却２０ ＩＩｌｉｎ，在６３０枷测定吸光值，酶反应产物ＧＡＢＡ的定量 以标准曲线确定，相对酶活力以单位时间内Ａ枷值的变化表示，每组测定同时做３个重
分析法。对乳酸菌谷氨酸脱羧酶提取液的适宜反应底物体系为０．２ ｍｃｄ／Ｌ Ｍａｃｎｖａｉｎｅ，ｐＨ４．７，
内含Ｏ．１咖蒯Ｌ ＰＬＰ（５’一磷酸吡哆醛），１０Ⅱｍ出Ｌ底物ＬＭｓＧ（Ｉ，谷氨酸钠）。２００肚底物溶液
和１～１００皿酶液在３０℃反应，然后冰浴中加入２００皿０．２Ⅱ础Ｌ硼酸缓冲液（ｐ瑚．０）终止反 应，再加入１ ｍＬ６％苯酚和４００血次氯酸钠，沸水浴加热１０ ｌＩｌｉｎ后，迅速冷却２０ ｌＩｌｉｎ，在６３０ 啪测定吸光值，酶反应产物＊氨基丁酸的定量以标准曲线确定，同时探讨了该方法的应用。
酶活测定基本方法
前处理：称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。
注：粗酶提取液要全部转移；加入石英砂后离心需配平1.SOD测量取透明度好的指形管，按下表加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）0.05M磷酸缓冲液 1.565mM Met溶液0.3500uM NBT溶液0.3100uM EDTA-Na20.3200uM核黄素0.3酶液0.1（对照管加缓冲液）蒸馏水0.5总体积 3.3混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。
按下式计算SOD活性。
SOD总活性=[(ACK —AE)×V]/[ ACK×1/2×W×a]SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示ACK—照光对照管的消光度值AE—样品管的消光度值V—样液总体积（ml）a—测定时样品用量（ml）W—样重（g）蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。
【试剂配制】磷酸缓冲液配制：母液：A：Na2HPO4•12H2O 36g，稀释至500mlB：NaH2PO4•2H2O 15.92g，稀释至500ml提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。
PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。
PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml （500ml）。
65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml；500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）；100 umol/L EDTA-Na2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na2磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）注：若要抑制Cu-Zn/SOD的活性，可加入30mM的KCN0.3ml；若要抑制Cu-Zn/SODFe-SOD的活性，可加入50mM的H2O2（0.52ml 30%的H2O2稀释至100ml） 0.3ml；2.CAT酶提取液：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，4℃下保存备用。
一种快速定量检测氨基酸脱羧酶活力的比色方法及其应用
试剂 Ｒｅａｇｅｎｔｓ
氨 基 酸 脱 羧 酶 （ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ） 是 催化脱去某种氨基酸的羧基生成对应胺的裂解酶 的总称［１－２］ ，主 要 通 过 消 耗 质 子 和 释 放 二 氧 化 碳 （ ＣＯ２） 催化某些氨基酸的脱羧。 氨基酸脱羧生成 的胺类物质在动物体内有重要作用，脱羧后形成 的胺类是某些维生素或激素的成分，具有特殊生 理作用。 氨基酸脱羧酶活力测定方法的建立对于 研究氨基酸代谢具有重要意义。 目前测定氨基酸 脱羧酶活力的方法主要有以下几种：高效液相色 谱（ ＨＰＬＣ） 、ｐＨ 指示 剂 和 放 射 性 标 记 法。 高 效 液 相色谱法精确性和重复性好，但是耗时长，并且需 要专门的设备［３］ 。 ｐＨ 指示剂法是利用 ｐＨ 变化对 氨基酸脱羧酶活力进行测定［４］ ，通过分光光 度 计
采用比 色 方 法 定 性 或 定 量 检 测 氨 基 酸 脱 羧 酶 活 力［５－７］ ，ｐＨ 指示剂法费时费力，仅可对几种特定的 氨基酸脱羧酶活力进行测定，并且在测定过程中 使用的有机溶剂毒性较大。 放射性标记法采用放 射性物质标记氨基酸底物［８］ ，通过监测 ＣＯ２ 的形 成量来对 氨 基 酸 脱 羧 酶 活 力 进 行 定 量 检 测［９－１０］ ， 该方法操作复杂，且必须在防放射性物质空间里 进行操作，对实验人员和环境污染大。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是固碳途径中活力 较高的羧化酶，利用羧化 酶 的 偶 联 反 应 固 定 ＣＯ２ 可检测氨基酸脱羧酶活力［１１］ 。 基于目前还没有快 速定量检测氨基酸脱羧酶活力的详细方法和商品 化的试剂盒。 为了替代测定成本高、耗费时间较
１期
陈庆菊等：一种快速定量检测氨基酸脱羧酶活力的比色方法及其应用
３９１
长、污染大的测定方法，本 试 验 采 用 酶 偶 联 固 定 ＣＯ２ 技术，旨在建立一种对仪器要求低、成本消耗 小、操作简 单 的 快 速 定 量 检 测 氨 基 酸 脱 羧 酶 活 力 的方法，为进一步开发商品化试剂盒做准备，并为 深入研究动物组织、微生物培养液等中氨基酸脱 羧酶活力提供一种简便的方法。
精氨酸脱羧酶活性测定方法
精氨酸脱羧酶活性测定方法一．液相色谱法：1.实验设备高效液相色谱，恒温水浴锅，SUMIPAX PG-ODS 07-4625（250*4.6mm）色谱柱，离心机2.实验试剂醋酸钠，L-精氨酸，磷酸吡哆醛，乙腈，磷酸氢二钠3.色谱条件色谱柱：SUMIPAX PG-ODS 07-4625（250*4.6mm）；流动相：乙腈：0.03M 磷酸氢二钠（pH3.0）=30:70；柱温：40℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm.4.实验方法将收集的细胞重悬于0.4mL 0.2M的醋酸钠缓冲液（含1% L-Arginine-HCL和0.02%磷酸吡哆醛）中，37℃孵育1h，之后离心，液相色谱分析上清中胍丁胺含量。
（难点：较难找到合适的色谱柱，且检测方法是专利中所描述的，是否切实可行，有待验证；优点：准确率高，易重复）二．分光光度法：1.实验设备分光光度计，恒温水浴锅，离心机2.实验试剂L-精氨酸，磷酸吡哆醛，氯化钠，氢氧化钾，正丁醇，双乙酰3. 实验方法将10mL反应体系（0.1mM L-精氨酸，5mM Tris-HCL，50μM磷酸吡哆醛和粗酶液）置于37℃或45℃恒温水浴中孵育90min，之后离取上清2mL加入氢氧化钾的盐饱和溶液，混合，加入2mL正丁醇，搅拌1-2h后离心，取上层醇层0.5mL 加入双乙酰试剂后，在510nm下测定有色衍生物胍丁胺的吸光值。
（难点：化学测定法误差较大，不易重复，且参考文献中未给出详细实验步骤，具体实验方法需要进一步实验摸索；优点：实验设备简单易操作）三．华勃氏呼吸仪法1. 实验设备华勃氏呼吸仪2. 实验试剂L-精氨酸，醋酸，醋酸钠3. 实验方法称取足量L-精氨酸配置溶液，取0.1-1mL加入1.9-1mL蒸馏水后加入0.2mL 2M醋酸-醋酸钠缓冲液置于反应小瓶中，酶液0.3mL于反应小瓶酶液侧室，置呼吸仪测定。
实验结束后，按照下列公式计算消耗的精氨酸量从而测得精氨酸脱羧酶的酶活。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
谷氨酰胺酶(GLS) 活性检测试剂盒说明书 微量法
谷氨酰胺酶(GLS)活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC1455规格：100T/48S产品内容：提取液：液体70mL×1瓶，4℃保存；使用前37℃预热。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL提取液溶解。
试剂二A：液体0.4mL×1支，4℃保存。
试剂二B：液体1.6mL×1瓶，4℃保存；临用前将试剂二A倒入试剂二B中混匀（A：B=1：4比例），或者根据样本所需，按照体积比试剂二A：试剂二B=1:4现配现用。
试剂三：液体2mL×1瓶，常温保存。
标准品：液体1mL×1支，10µmol/mL氮标准液，4℃保存；使用前37℃预热。
产品说明：GLS（EC3.5.1.2）存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
本试剂盒利用利用靛酚蓝比色法测定GLS催化谷氨酰胺生成的氨来计算其酶活性。
试验需自备仪器和用品：台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和双蒸水。
操作步骤：一、粗酶液提取：1.组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5-10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液），冰上匀浆后于4℃，12000g离心15min，取上清待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：蒸馏水体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万个细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后4℃，12000g 离心15min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤：1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至630nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、将标准溶液用提取液稀释8倍得1.25μmol/mL的标准溶液。
GS和GOGAT酶活性测定
实验报告（修改中勿动）9月8日张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μm ol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml 的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）←以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
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精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的测定方法
赵福庚;刘友良
【期刊名称】《植物生理学通讯》
【年(卷),期】2000(36)5
【摘要】介绍了一种测定精氨酸脱羧酶和谷酰胺转移酶活性的方法———苯甲酰化紫外检测 ,并鉴定了该方法的灵敏性。
【总页数】4页(P442-445)
【关键词】精氨酸脱羧酶;谷酰氨转移酶;活性测定;测定方法
【作者】赵福庚;刘友良
【作者单位】南京农业大学农学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.54;Q946.55
【相关文献】
1.白血病细胞内精氨酸酶,鸟氨酸脱羧酶和组氨酸脱羧酸活性的变化 [J], 缪金明;潘瑞彭
2.吗啡依赖状态下大鼠脑组织左旋精氨酸脱羧酶活性的测定 [J], 苏瑞斌;李锦;秦伯益
3.低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶活性的影响 [J], 张贵友;李萍;戴尧仁
4.不同生态型芦苇叶片中多胺浓度和精氨酸脱羧酶活性的季节变化 [J], 王洪亮;张承烈
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