第8章发酵机制 51-100

当黄色短杆菌以葡萄糖为唯一碳源时，葡萄糖 生成的PEP分别经分解途径和CO2固定生成乙 酰-CoA和草酰乙酸。PEP羧化酶对PEP的表现 亲和力约是丙酮酸激酶的1/10，当PEP的浓度 低时，PEP羧化酶不被乙酰-CoA和二磷酸果糖 激活，PEP容易进入分解途径；当乙酰-CoA浓 度增加，与二磷酸果糖共同对PEP羧化酶激活， 代谢转向CO2固定。另外，增加TCA循环的中 间产物浓度，可认为与其保持平衡的天冬氨酸 浓度增加，反馈抑制PEP羧化酶，代谢又转向 分解途径，防止了草酰乙酸的过剩。

丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点， 丙酮酸既可以由丙酮酸脱氢酶催化氧化 脱羧生成乙酰-CoA，也可以由丙酮酸羧 化催化经CO2固定生成草酰乙酸。

CO2固定的强度对柠檬酸高产率的一个重 要条件。黑曲霉的丙酮酸羧化酶已被提 纯，与其他真菌相反，此酶不被乙酰CoA抑制，α-酮戊二酸只有微弱的抑制作 用，该酶的调节性很差。Feir（1969年） Johnson（1962年）、Wongchai（1974年） 的研究指出此酶是组成型。
2. DCA循环 在谷氨发酵中，DCA循环一方面可以作为TCA 循环有缺陷时C4二羧酸的补充，特别是以醋酸 和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是C4二羧酸的 唯一补充来源，也作为能量供给来源的末端氧 化系。

3. CO2固定 在谷氨酸发酵培养基中供给NaH14CO3时，可发 现标记14CO2掺入到谷氨酸的α-羧基，说明草酰 乙酸的补充是通过 CO2 固定反应来完成的。在 谷氨酸产生菌中已检出二种 CO2 固定反应酶： 磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶和苹果酸酶。

但理想的情况是柠檬酸转化的量应为生 成量的1/2 。这显然需要极为复杂的调节 机制来控制，循环中的中间体都必须存 在，使发酵产物中不仅仅是柠檬酸。

例如，酵母的烃类发酵产物中除柠檬酸外，含 有较多的异柠檬酸，有时高达总酸的 50%。现 在已经清楚，酵母的烷烃发酵，柠檬酸的积累 是在培养基中氮源耗尽以后开始的。在氮源耗 尽时，细胞内AMP浓度陡然下降，这样抑制了 NAD- 异柠檬酸脱氢酶活性，这时柠檬酸的合 成远大于分解，从而积累起来。后 Mitsushima 等人用线粒体实验支持了上述观点。

大石等（1965）在生物素充足和亚适量条件下 对产氨短杆菌（Brev. ammoniagenes）进行研 究，由葡萄糖-1-14C及葡萄糖-6-14C放出14CO2 回收率计算HMP的比率，结果表明，生物素充 足菌HMP所占比率为38%，生物素亚适量菌为 26%，并且添加亚砷酸抑制丙酮酸以后的代谢， 而这两个值不变，他们的工作得出结论：生物 素参与糖代谢的作用是增加糖代谢的速度。
二、TCA、DCA和CO2固定作用 1. TCA循环 糖经过 EMP、HMP 途径生成丙酮酸，在 有氧条件下，氧化脱羧生成乙酰 -CoA， 另一方面经CO2固定生成草酰乙酸，两者 在柠檬酸合成酶催化下生成柠檬酸，进 入TCA循环酸生物合成中 是非常重要的。Shiio等曾测定谷氨酸产 生菌中的α-酮戊二酸脱氢酶，初期未被 检出，因而认为该酶缺失或活力极弱是 谷氨酸产生菌的另一特征。但他们分析 了谷氨酸发酵的实际转化率远低于理论 转化率，可能是部分糖通过完整的TCA 循环而被完全氧化。

La. Naze等（ 1966年）比较了在不同产率的柠 檬酸发酵中，顺乌头酸水合酶、NAD和NADP异柠檬酸脱氢酶的活性，在柠檬酸产生和不产 生时均存在。供给铜 0.3mg/L，铁 2mg/L ，和 pH2.0 情况下，这三种酶均不呈现活性。发酵 中柠檬酸正是在这个酸度下积累的，因此他们 认为细胞内 pH2.0，上述三种酶失活是由于酸 度太高造成的。但不能解释为什么pH值会下降， 即柠檬酸开始如何积累。

当乙酰 -CoA 氧化，使 ATP 水平提高，结 果丙酮酸激酶受 ATP抑制， PEP又向 CO2 固定。当生物合成和需能反应使 ATP 浓 度降低，则 ATP 对丙酮酸激酶的抑制被 解除，此酶被 AMP激活，使乙酰-CoA生 成量增加。


1961年苏等以扩展短杆菌（Brev. divaricatum）进行研究，同时发现与 EMP途径、HMP途径有关的酶存在，证 明了有这两个途径存在。

图5-1 谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径

关于EMP和HMP两个途径在糖酵解中所 占比率，椎尾等以黄色短杆菌的完整细 胞添加亚砷酸作为抑制剂，在通气条件 下，由葡萄糖-6-14C和葡萄糖-尿苷酸-14C 生成丙酮酸。结果得到EMP/HMP比率是 90∶10。
柠檬酸的生产动态： 柠檬酸的发酵工艺： 柠檬酸应用：

第八节 谷氨酸生物合成途径及 调节机制

正常代谢的微生物是不大量积累谷氨酸 的，今天谷氨酸产生菌能够在体外积累 100g/L以上谷氨酸，为菌体最大生长需 要量0.3g/L的三百多倍。

在开始时曾设想有新的合成途径的可能 性，但其后的研究表明谷氨酸的大量积 累不是由于生物合成途径的特异，而是 菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特 异调节以及发酵条件的适合。

图5-1为谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成 途径示意图。可见谷氨酸的生物合成途 径包括EMP、HMP、TCA循环、乙醛酸 循环（DCA）和CO2固定作用等。根据 这一合成途径，由葡萄糖生成谷氨酸的 总反应式为：

则1mol葡萄糖可以生成1mol谷氨酸，谷氨酸对 糖的重量理论转化率为：
147 100% 81.7% 180

这些氨基酸的积累可能是由于蛋白质合 成受干扰，从而导致蛋白质分解相应增 加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。 有锰离子存在时，添加环已酰亚胺 （Cycloheximide）可以促进NH3+和氨基 酸积累。

由此可得到结论， NH3+ 积累是由于蛋白质和 RNA转换过程中细胞蛋白质的再合成受损失伤 引进的，后者是由于Mn2+缺乏所致。虽然这过 程中Mn2+的主要作用是什么仍不清楚，但在添 加Mn2+后要经过几个时的延迟，并需要通过细 胞质蛋白质（不是线粒体蛋白质）的合成才对 柠檬酸发酵产生抑制效应。细胞质蛋白质的合 成被环己酰亚胺所拮抗，而不被氯霉素拮抗。 可以认为Mn2+的效应是通过NH3+水平升高而减 少柠檬酸对 PFK 的抑制， NH3+ 水平升高是因 Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻。
最近研究表明，黑曲霉中有一种单纯的， 位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在 催化时能建立下面平衡： 柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸 =90∶3∶7

TCA 循环在柠檬酸积累中所起的作用可 归纳为： （1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的 关键； （2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本 上不受代谢调节的控制或极微弱，而且 这二个反应的平衡，保证了草酰乙酸的 提供，增加柠檬酸合成能力；
二、三羧酸循环的调节 在许多细胞中三羧酸循环起始酶——柠 檬酸合成酶是一种调节酶。然而根据柠 檬酸合成与CO2固定之间的关系为化学计 量关系，可以推断黑曲霉的柠檬酸合成 酶没有调节作用。


从理论上推测，顺乌头酸水合酶失活， TCA循环阻断是积累柠檬酸的必要条件， 顺乌头酸水合酶需要Fe2+。也有人报道， 在积累柠檬酸时，顺乌头酸水合酶和异 柠檬酸脱氢酶失活。

Mn2+ 对棒杆菌核苷酸积累的专一性影响 和上述例子极为相似。关于核苷酸的积 累，人们推断是因为催化核糖核苷酸形 成聚合阶段第一步反应的酶需要锰。

某些真菌的丙酮酸是酵解过程第二个调 节点已被证明，但是关于黑曲霉尚未被 证明。用交换定理未能确定这一步反应 是否调节性。测定柠檬酸发酵时酵解中 间代谢物浓度可推断流经丙酮酸激酶的 通量增加。

同时在控制Fe2+含量时，顺乌头酸水合酶活力 低，使柠檬酸积累，一旦柠檬酸浓度升高到某 一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一 步促进了柠檬酸自身积累。柠檬酸的积累使 pH 值下降，在低 pH 值下降，顺乌头酸水合酶 和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的 积累并排出体外。
第七节
乙醛酸循环和醋酸发 酵柠檬酸


（3）TCA循环的阻断或微弱（即顺乌头 酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二 酸脱氢酶活力降低），导致循环中间代 谢物积累，由于各种酶处于平衡状态， 使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定 水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提 高自身的积累。

综上所述 ， 柠檬酸的积累机制可
归纳为：

由于锰离子缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞 内NH3+浓度升高和有一条不产生ATP的侧系呼 吸链，这两方面的原因分别解除了对 PFK的代 谢调节，促进了EMP途径的畅通。由于丙酮酸 羧化酶是组成型，不被调节控制，就源源不断 地提供草酰乙酸。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定两个反应的平衡，以及柠檬酸 合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。由 于顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡： 柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸=90∶3∶7
上述理论能够解释生成柠檬酸，而不能 解释乙醇和醋酸或烃类发酵生成柠檬酸。


由于丙酮酸氧化脱羧反应是不可逆的。 因此草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环 来完成。Olsen（1954年）证明黑曲每中 存在异柠檬酸裂解酶，此酶催化异柠檬 酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。有力地证明 黑曲霉中存在乙醛酸循环。

由醋酸或乙醇或烃类合成柠檬酸的途径。 见图4-5，从图可看出，在理论上3mol醋 酸可以合成1mol柠檬酸，在此过程中没 有碳原子损失。由于合成柠檬酸的C4二 羧酸只能由乙醛酸循环来提供，因此， 柠檬酸向异柠檬酸的转化和后者的裂解 是必不可少的。

而糖酵解和三羧酸循环中间代谢物含量增高 （见表4-3），可见，锰缺乏时黑曲霉的组成代 谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。

当黑曲霉菌生长在缺锰的高浓度糖培养 基中时，细胞内NH4+异常高（25mmol/L， 随之出现几种氨基酸：谷氨酸、谷氨酰 胺、鸟氨酸、精氨酸和-氨基丁酸）的积 累和分泌，使NH4+对细胞的毒性被解除。