第六章微生物发酵机理2

经过突变处理的菌株
A—某种氨基酸 A`—某种氨基酸的类似物
目标产物 赖氨酸 苏氨酸 异亮氨酸 精氨酸
结构类似物 S-（2氨基乙基）-L半胱 氨酸-(AEC) -氨基--羟基戊酸 （AHV) 乙硫氨酸 D-精氨酸
苯丙氨酸
对氟苯丙氨酸
获得方法及其原理： 营养缺陷型回复突变菌株
催化亚基基因突变
出发菌株
反 馈 阻 遏 高丝氨酸脱氢酶(HSDH)
异亮 高丝氨酸 氨酸 苏氨酸
甲硫氨酸
利用谷氨酸棒状生产赖氨酸比利用大肠杆菌 的优势： （1） 不存在天冬氨酸激酶或天冬氨酸半 醛脱氢酶受阻遏的问题； （2） 赖氨酸分支的第一和第二个酶（双 氢吡啶二羧酸合成酶和双氢吡啶二羧酸还原 酶）不受赖氨酸的抑制或阻遏； （3）赖氨酸产生菌中缺少L-赖氨酸脱羧酶。
如
A
B
C
D
E
限量添加E，就会造成C大量积累
枯草芽孢杆菌的精氨酸营养缺陷型，鸟氨 酸积累量可到到25g/L.
F A B C D
G E
协同反馈 F A B C D
G
E
F
G
A
B
wenku.baidu.com
C
D
E
F A B C D
G H E
赖氨酸简介： 谷物中不含的必须氨基酸。
谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸激酶（AK) 反 馈 抑 制 赖氨酸 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸半醛
葡萄糖
反馈抑制 反馈阻遏
赖氨酸 Met -
Lys-
天冬氨酸 AK 天冬氨酸磷酸 HD
甲硫氨酸
高丝氨酸 苏氨酸
AHVr
黄色短杆菌 的苏氨酸合 成途径
抗代谢类似物的筛选方法
不含结构类似物
含结构类似物
3.抗分解阻遏突变体的应用 例如：葡萄糖－脯氨酸，筛选抗分解阻遏突变体
利用葡萄糖类似物选育蔗糖酶、淀粉酶、 纤维素酶
（二）抗反馈调节突变菌株的应用 抗反馈调节菌株：对反馈抑制作用不敏感， 或对反馈阻遏有抗性，或二者兼而有之的 菌株。 抗反馈抑制突变菌株的获得途径： 1.结构类似物抗性突变菌株 2.营养缺陷型回复突变菌株 获得方法及其原理： 结构类似物抗性突变菌株
将接除了反馈抑制的突变菌株筛选出来
极少数
A`
大多 数
肌苷酸生成菌株 PRPP
PRPP酰氨转移酶
PRPP－磷酸核糖基焦磷酸
IMP－肌苷酸
S-AMP－肌苷酸琥珀酸
AMP－腺嘌呤5`－单磷酸 XMP－黄苷酸
IMP S-AMP AMP XMP
GMP－鸟嘌呤5`－单磷酸
产量达13g/L GMP
肌苷酸简介：很好的高效调味品，也是重要 的工业原料。
2. 渗漏缺陷型(leaky mutant): 一种不完全遗传障碍营养缺陷型， 能够自己合成某一代谢终产物但达不到 反馈调节的浓度，所以不会造成反馈抑 制而影响中间代谢产物的积累。 与营养缺陷型的区别？
第四节 代谢调节的人工控制 微生物的正常代谢不会使代谢产物 过量积累，发酵目的是尽可能多地积累 代谢产物，以此必须打破微生物的代谢 调节机制，使代谢产物大量积累。 改变微生物的遗传学特性
方法 控制发酵条件
一
改变微生物的遗传学特性
（一）.营养缺陷型和渗透缺陷型突变菌株的应用 1.营养缺陷型：原菌株由于发生突变，致使 代谢途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失 了合成某种物质的能力，必须在培养基中 外源补加该营养物质才能正常生长的突变 菌株。 在培养过程中我们可以控制补加营养物质的 量也不造成反馈调节（阻遏或抑制）。
3. 发酵与分离过程耦合： 在发酵过程中及时将末端代谢产物移 走，末端代谢产物保持较低水平，解除反 馈调节。 耦合手段较多，有膜分离、离子交换 分离和萃取等。这些分离装臵应该具有分 离效率高、抗污染、易于重复使用等特定。
4. 控制发酵的培养基成分：
通过各种加料方法来限制生长速率， 使酶生产去阻遏。 通过控制生物素来增加谷氨酸产生菌 细胞膜的通透性；添加青霉素抑制细胞壁 后期合成，细胞壁不能形成完整的网状结 构，引起磷脂和细胞壁成分的UDP-N-乙 酰己糖向外分泌使细菌的细胞壁和细胞膜 的合成受到损伤。 加入适量的无机离子例如Mn2+可增加膜 的通透性。
4.选育组成型突变株和超产突变株
如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而 不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成 结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要 诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样 的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成 型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种 突变株称为超产突变株。
（二）发酵条件的控制
1.添加前体绕过反馈控制点
(-)
D B C E
(-)
A
F
(-)
2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说， 最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底 物的衍生物。 如：大肠杆菌β-半乳糖苷酶的最有效诱导剂 是异丙酰-β-D-硫代半乳糖苷，它不被β-半乳 糖苷酶分解。 高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也 会引起分解代谢物的阻遏，对许多发酵生产 胞外酶，如果底物浓度过高，产量反而不高。 有些底物类似物作为诱导剂，因为利用速 度慢，可以消除代谢物的阻遏，显著提高酶 的产量。
例如：在发酵工业中，为了提高次级 代谢的产量。利用乳糖和葡萄糖的混 合流加来提高青霉素的产量。乳糖非 青霉素的直接前体，是因为它能够缓 慢应用从而使分解代谢产物处于较低 水平，不至于阻遏青霉素合成。
营养缺陷型
催化和调节亚基均突变
催化亚基完全回复
催化亚基未完全回复
催 化 亚 基 回 复
催 化 亚 基 和 调 节 回 复
抗反馈调节突变菌株与营养突变菌株比较：
1.不受培养基中营养成分的限制，生产稳定； 2. 易于筛选 3.可有效防止回复突变，易于保存
对于分支合成途径使用抗性突变菌株要和营 养缺陷型结合育种，才会得到更高的产量。
组成型突变株 调节基因发生突变
产生无效的阻遏物而不 能与操纵基因结合
操纵基因突变
突变操纵基因不 能与阻遏物结合
结构基因不受控制地转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不 再被末端产物或分解代谢物阻 遏。
组成型突变
5.条件致死 例如在抗生素和酶制剂生产过程中的应用。 6.细胞膜通透性突变体的应用
使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。 1. 用生理学手段—— 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如: 在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu； 控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性； 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法； 再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的作用与 生物素相似。 2. 利用膜缺损突变株 ——油酸缺陷型、甘油缺陷型 如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸， 合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸 大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下， 也可以获得大量谷氨酸。
7.增加有关基因的数量
增加结构基因或操纵基因的数量 例如，β－半乳糖苷酶、青霉素酶、氯 霉素转酰氨酶等可借助含有相应结构基因 的质粒转移给受体培养物来增加产量；利 用含有对苯丙氨酸的结构基因的转导噬菌 体可使该酶产量增加15倍。 通过操作基因与传统诱变技术和代谢调 控相结合提高产量。
启动基因的突变增加RNA聚合酶和 DNA的亲和力，增加转录速率。