从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv
T7噬菌体展示人源抗体库筛选雌二醇ScFv抗体的开题报告
T7噬菌体展示人源抗体库筛选雌二醇ScFv抗体的开题报告一、研究背景雌二醇是一种主要由卵巢产生的雌激素，具有重要的生理生化作用，包括对生殖系统、乳腺、骨骼和心血管系统的影响等。
各种疾病（如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等）和药物（如雌激素类避孕药、激素替代疗法等）都与雌二醇有关。
因此，检测血液中的雌二醇水平对于预测疾病风险、指导临床治疗和判断生育能力等有着重要的意义。
传统的雌二醇检测方法包括放射免疫法、化学发光法、酶联免疫吸附法等，但这些方法存在着检测时间长、检测成本高、复杂度较高等缺点。
而基于噬菌体展示人源抗体库筛选出的特异性抗体则可以发挥出高度特异性、灵敏度和快速性等优点，成为新型雌二醇检测方法中的研究热点。
二、研究目的本研究旨在使用T7噬菌体展示人源抗体库对雌二醇进行筛选，从中筛选出具有高亲和力的单链抗体 (ScFv)，并验证其特异性及灵敏度，为开发新型的快速、有效的雌二醇检测方法提供基础。
三、研究内容1. 构建T7噬菌体展示人源抗体库采集人群体内ScFv基因，通过PCR扩增、连接酶切、双酶切等方法构建T7噬菌体展示人源抗体库。
2. 筛选雌二醇ScFv抗体以雌二醇为抗原，将其包被在平均粒径为200 nm的小泡蛋白体（BLT，bilayered structure of liposome and T7 phage）上，并作为蛋白体-病毒颗粒复合物的选择性过滤筛选酵母菌。
通过ELISA、Western blotting等技术筛选出对雌二醇特异性高、亲和力强的ScFv抗体。
3. 验证ScFv的特异性及灵敏度使用其它类似物和干扰物对ScFv进行交叉反应和特异性检测，评估其特异性。
同时，通过运用不同浓度的雌二醇制备样本，评估其灵敏度。
四、研究意义通过本研究，可筛选出对雌二醇特异性、亲和力强的ScFv抗体，作为开发新型快速、有效的雌二醇检测方法的基础。
此外，本研究的理论和方法，对其他激素和药物等的快速检测领域的研究有一定参考意义。
从大容量噬菌体抗体库中筛选抗体
将所分析得到的抗原性高的基因序列进行 ＢＬＡＳＴ比 对。选取抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片 段进行表达。 １．２．２ 细胞培养 ＨｅＬａ细胞以 １×１０５接种于含 １０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液中，５％ＣＯ２／９５％空气，３７℃ 孵育培养。 １．２．３ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ?ＰＣＲ 收集指数生长期细 胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总 ＲＮＡ。定量后，Ｍ?ＭＬＶ逆转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链。以反转录获得的 ｃＤＮＡ为模板，分别用 两对引物 Ｐ１，Ｐ２和 Ｐ３，Ｐ４对目的基因片段进行 ＰＣＲ扩 增。扩增反应的条件均为：９５℃预变性 １０ｍｉｎ，９４℃变 性 ４５ｓ，５５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，扩增 ３０个循环。 ＰＣＲ扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 １．２．４ 重组克隆载体 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ４ 的构建与鉴定 将纯化的两段 ＰＣＲ产物分别连入载体 ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙ，构建重组质粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，转化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后 挑 取 阳 性 克 隆，用 ＮｄｅⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 质 粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，将两段目的基因片段分别回收纯化。 １．２．５ 重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 的构建与诱导表达 将纯化的两段目的基因与经 Ｎｄｅ Ⅰ ／ＸｈｏⅠ双酶切的载体 ｐＥＴ?２２ｂ（ ＋ ）相连接，分别 构建重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４，转 化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后挑取阳性克隆，用 ＮｄｅⅠ ／Ｘｈｏ Ⅰ双酶切鉴定。经测序分析正确的重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ? ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 转 化 感 受 态 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取阳性克隆，接种于 １０ｍｌＬＢ／Ａｍｐ＋培养基 中，于 ３７℃培 养 过 夜。按 １％ 比 例 将 工 程 菌 转 接 于 ５００ｍｌ新鲜的 ＬＢ／Ａｍｐ＋培养基中，３７℃培养至 ＯＤ６００约 ０．５时，加 入 终 浓 度 为 ０．８ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱 导 表，于 ３７℃培养 ３ｈ。表达产物用 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ检测。取 ５０ｍｌ 经诱导表达 的 工 程 菌 超 声 裂 解 后，分 别 取 上 清 组 分 及 沉淀组分 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分析。 １．２．６ 融合蛋白 ＤＰＫ３和 ＤＰＫ４的纯化 收获的工程 菌经超声破菌后，将沉淀物用 １％ ＴｒｉｔｏｎＸ?１００漂洗后 用缓冲液 Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ７．５）于 ４℃洗涤 ２ｈ，离心收集沉淀。经粗提的包涵体溶解于 缓 冲 液 Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ８．０， ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），４℃搅拌 ２ｈ，使其充 分溶解。离心后取上清以 １ｍｌ／ｍｉｎ的流速上样于经缓 冲液 Ｂ平衡后的 ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱，上样后以缓冲液 Ｂ洗 柱；而 后 通 过 梯 度 混 合 器 形 成 从 缓 冲 液 Ｂ到 Ｃ
三聚氰胺人源scFv抗体筛选与鉴定
ｃｏ ｅ ， ｓｎ ｎ ｙ ｑｉｋ ｄｉ ｌｎ ｓ ｕ ｉｇｅｚ ｍｅ ｎ ｅ ｍｍｕ ｏ ｏ ｂ ｎ ｓａ ｔ ｏ （ Ｓ ，ｃｏ ｓｒａ ｔ ｅａ ｄｃ ｍｐ ｔｔ ｅｉ ｉｉｏ ｘ ｅ ｉ ｎ ｓ ｎ ｓ ｒ ｅ ｔａ ｓｙｍｅｈ ｄ ＥＩ Ａ） ｒｓ—ｅ ｃｉ ｎ ｏ ｅｉｉ ｈｂｔ ｎｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ， Ｉ ｖ ｖ ｎ ｉ
关键 词 ： 体 ； 菌体表 面展 示技 术 ； 抗 噬 三聚氰 胺 中图分 类号 ： ３ ２ １ 文献 标 志码 ： 文 章编号 ：６ １７ １ （ ０ ２ ０ —１ —４ Ｒ ９． １ Ａ １ ７ —４ ４ ２ １ ） ３０ ００
ｄ ｉ１ ． ９ ９ｊ ｉ ｎ １ ７— ４ ４ ２ １ ． ３ ０ ３ ｏ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ． ６ １ ７ １ ． ０ ２ ０ ． ０ ｓ
scFv抗体的筛选和活性研究(Molecular Devices)
靶向FGFR3胞外区域的人scFv抗体的筛选和活性研究成纤维细胞生长因子(FGF)是最大的一类中胚层和上皮细胞生长分化多肽因子家族。
FGFs在许多生物学过程中发挥重要作用，比如胚胎发育，伤口愈合，血细胞生成及血管发生等。
此外，已有研究表明FGFs可以增加多种肿瘤细胞的浸润性，如前列腺、膀胱、肾脏、乳房、胰腺等部位肿瘤。
目前，共发现20多种FGFs，对不同类型细胞具有不同的作用。
但是，只发现了5种FGF受体(FGFR)。
在蛋白水平上，这些受体具有55%-72%的同源性。
FGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域以及一个胞内激酶区域。
配体结合区域包含三个不同的类似免疫球蛋白结构域(称为免疫球蛋白I，II和III)。
FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成两种亚型α和β。
其中FGFR3具有两种不同的突变体IIIb和IIIc。
这两种变体具有不同的亲和活性：IIIc分布更加广泛，能和多种FGFs结合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb优先和FGF1结合，能够较低程度和FGF8和FGF9结合。
在有肝素(heparin)作用的情况下，FGFs和FGFRs结合后，FGFs诱导受体二聚化，引起胞内激酶区域的自身磷酸化以及下游信号级联反应的激活。
配体受体结合后，FGFs会启动多种信号转导途径：胞内钙离子水平升高，诱导丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸环化酶以及诱导原癌基因c-myc 和c- fos。
已发现FGFR3会发生特殊突变，导致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些与骨骼发育，多发性骨髓瘤，颈部肿瘤以及膀胱肿瘤相关的综合征。
最近的研究发现FGFR信号是前列腺肿瘤细胞在体外存活所完全必需的。
近来，FGFR3已被作为多发性骨髓瘤的可能治疗性靶点。
尽管已有确实证据表明激活的FGFR3突变存在于肿瘤组织中，但是关于FGFR3在肿瘤组织中的表达知道的非常少。
近来，使用基因芯片技术对基因表达分析后，发现和正常组织相比FGFR3在膀胱肿瘤样品中过表达。
斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定
斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾鮰为试验材料，取其新鲜外周血，分离淋巴细胞，提取总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ。
ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ，以纯化的ＶＨ、ＶＬ基因为模板，以与ＶＨ基因３′－端和ＶＬ基因－５′端序列互补的Ｌｉｎｋｅｒ—ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ为引物，将ＶＨ、ＶＬ随机拼接为ＳｃＦｖ。
通过酶切连接，依次将ＰＣＲ产物插入质粒ｐ３ＭＨ相应位点，热激法转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，加入辅助噬菌体ＶＣＳＭ１３，构建噬菌体单链抗体库。
测定库容并酶切鉴定。
斑点叉尾鮰天然单链（SｃＦｖ）噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾鮰病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。
关键词：斑点叉尾鮰；抗体库；噬菌体展示；抗体单链（SｃＦｖ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ２５０ｍL ｂｌｏｏｄ，ｗｈｉｃｈｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ５０ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｎｉｚｅｄｈｅａｌｔｈｙｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｒｖｅｎａｃａｕｄａｌｉｓ．ＴｈｅｈｅａｖｙｃｈａｉｎＦｄａｎｄｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｃｔｅｄｂｙＬｉｎｋｅｒ—ＰｒｉｍｅｒＭｉｘｉｎｔｏＳｃＦｖ．Ｔｈｅｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｌｉｇａｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙｉｎｔｏｔｈｅｐｈａｇｅｍｉｄｖｅｃｔｏｒｐ３ＭＨ，ｔｈｅｎｔｈｅｌｉｇａｔｅｄｓａｍｐｌｅｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉＸＬ１－Ｂｌｕｅ．ＴｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＶＣＳＭ１３ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅｔｏｙｉｅｌｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｈａｇｅSｃＦｖａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｎａiｖｅｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙｃｒｅａｔｅd ｆａｖｏｕｒａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄａｂｓｔｒａｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＩｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓＲａｆｉｎｅｓｑｕｅ；ａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈａｇｅ；SｃＦｖ斑点叉尾鮰（ＩｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓＲａｆｉｎｅｓｑｕｅ）亦称沟鲶（Ｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈ），属于鲶形目（Ｓｉｌｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）鮰科（Ｉeｔａｌｕｒｉｄａｅ）鱼类。
从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体
物 。 目前 ， 已经 有 多 种 针 对 ｓｒｉｎ靶 点 的药 物 开 ｕｖ ｉ ｖ 始 进 行 Ｉ期 或 Ⅱ 期 临 床 试 验 ， 反 义 寡 核 苷 酸 如
殖腺 中有微 量表 达 ， 其 他 正 常组 织 中均 未检 测 到 在
其表 达 ， 而在 大 部 分 肿 瘤 中则 高 表 达 尤 其 是 肺 、 乳
《 医 杂 》 １年１月 第１ 第２ 转化 学 志 ２ ２ ０ ０ 卷 期
Ｔｎ ｒｓ ａ
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１ 材 料 与方 法 １１ 大容 量抗 体 库及 主要 试 剂 大 容 量 噬 菌 体 抗 ．
３ｑ 培养 至对 数生 长期 ， ７３ 加入辅 助病毒 Ｖ Ｓ １ ， Ｃ Ｍ ３ ３ ＇培 养过夜 ， 心 收取上 清 即得 到 噬菌体 抗体 。 ０２ ｔ 离
分析有 ８种不 同的抗 ｓｒｉｎ的 ｓＦ 基 因 ， ｕｖ ｉ ｖ ｃｖ 在这 ８种 中有 ５种 获得 可溶性表达 。结论 术 获得 了特异性 的人 源抗生存 素抗体 ， 为其在今后肿瘤 治疗 中的应用奠定基础 。 利用噬菌体抗 体库技
［ 关键词 ］大容量抗体库 ； 生存素 ； 噬菌体抗体 ； 可溶性抗体 ［ 中图分类号 ］Ｒ ９ ． １ ３ ２ １ ［ 文献标志码 ］Ａ ［ 文章编号］２９ —０ ７ ２ １ ） ２０ ８ － ０ ５３ ９ （０ ２ ０ －０４０ ４
人源抗创伤弧菌溶血素蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定要点
达和纯化¨０＝；实验用大肠杆菌菌株、制备噬菌体抗 体用辅助病毒ＶＣＳＭｌ３均为海军总医院实验室保 存；ＩＰＴＧ、ＰＥＧ８０００、各种酶标抗体购自Ｐｒｏｍｅｇｅ公 司；卵清蛋白（ＯＶＡ）和铁蛋白（Ｆｅｒ）购自Ｓｉｇｍａ
公司。
达的特异性阳性克隆，３７℃培养过夜后送诺赛公司 进行基因序列测定，利用ＰＣＧＥＮＥ软件对该克隆的 可变区进行序列分析。 ８．竞争抑制性ＥＬＩＳＡ：取０．２ ｍｌ的ＰＣＲ管，每管 加入结合活性较好的抗ＶＶＨ噬菌体抗体５０仙ｌ，同时 分别加入５０仙ｌ不同浓度的游离ＶＶＨ抗原（稀释浓 度为１：１００、１：５００、１：５ ０００）和无关抗原，混悬后将其 移人包被并封闭好的ＶＶＨ酶标板（２ ｍｇ／Ｌ）上，３７℃ 孵育ｌ ｈ，ＰＢＳＴ洗涤３次后加入ＨＲＰ．抗鼠Ｍ１３抗体， ３７ｃＣ孵育２ ｈ，ＯＰＤ显色，测４９０ ｎｍ处４值。
ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ ＳｃＦｖ
Ｘｉｅ Ｘｕｅｙｕａｎ，Ｆｕ
Ｋａｉｆｅｉ，Ｗａｎｇ
Ｙｕｘｉａｏ，Ｗｕ Ｃｈｅｎｇｌｉｎ，Ｚｈｏｕ
Ｌ＠ｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎａｙ）’Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓห้องสมุดไป่ตู้ｉｔａｌ，Ｂｅｉｆｉｎｇ
１０００４８，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ
４９０
ｎｍ处吸光度（Ａ）值。 ６．可溶性ＶＶＨ抗体的制备及特异性鉴定：将培
人源抗体，则在很大程度上弥补了这种缺陷。故本 研究拟通过抗体库技术从大容量噬菌体抗体库中筛 选针对ＶＶＨ的人源单链抗体，为制备创伤弧菌感染 生物治疗制剂奠定基础。
材料与方法
养至对数生长期的大肠杆菌ＨＢ２１５１与鉴定好的抗 ＶＶＨ的噬菌体抗体３７℃共同孵育１５ ｍｉｎ，接种培
用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗
用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的
单链抗
噬菌体抗体库是一种非常强大的生物技术工具，可以用于筛选出针对特定疾病、特定抗原的单链抗体。
在搜索抗完整食管癌细胞的单链抗体时，可以采用以下几种方法。
第一种方法是基于表面展示技术的筛选。
此方法利用噬菌体表面的展示蛋白，将特定单链抗体的DNA序列插入其中，并让
噬菌体体表面展示这种单链抗体分子。
接下来，将经过筛选的噬菌体与完整食管癌细胞接触，将其在体外培养。
通过重复筛选和挑选，可以得到经过筛选的却对完整食管癌细胞具有很强抗体效果的单链抗体。
第二种方法是利用串联抗体的筛选。
此方法先将多个单链抗体连接在一起，形成一个可变区域长的串联单链抗体，再将其插入噬菌体表面展示蛋白中。
同样的，将经过重复筛选和挑选，可以得到抗完整食管癌细胞效果很好的串联单链抗体。
第三种方法是利用功能筛选法。
此方法首先需要将完整食管癌细胞切成小碎片，然后使用这些碎片投放到噬菌体抗体库中，让这些碎片吸附在噬菌体表面，以模拟完整食管癌细胞在人体内的生存环境。
接下来，通过加入某些化合物或特定条件，可以筛选出对完整食管癌细胞有特异性的单链抗体。
综上所述，虽然每种筛选方法都各有优缺点，但我们可以选择最适合的筛选方法，以此从大容量的噬菌体抗体库中筛选出一种高效抗完整食管癌细胞的单链抗体，以提高食管癌治疗效果。
从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv
Ｃｌｎｉ ｇ ｏ ｏ ｎ ｆＡｎｔ－ ｒ ｔｎ ｃ ｏ ｕ ａ ｒ ｅ Ｐｈ ｇ ｔｂ ｄｙ Ｌｉ ａ ｙ ｉｋｅ ａ ｉ Ｓ Ｆｖ Ｆｒ ｍ ａ Ｈ ｍ ｎ Ｌａ ｇ ａ ｅ Ａｎ ｉ ｏ ｂｒ ｒ
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抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定
抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定马巍娜;刘雪林;宋宏彬;沈建良;黄友章;刘毅;向丹【摘要】目的筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件.方法本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段.即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒.结果从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段.结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2016(013)012【总页数】3页(P1608-1610)【关键词】噬菌体表面展示技术;筛选;三聚氰胺;人源单链可变区抗体;生物素化【作者】马巍娜;刘雪林;宋宏彬;沈建良;黄友章;刘毅;向丹【作者单位】中国人民解放军海军总医院血液科,北京100037;中国人民解放军军事医学科学院十所,北京100039;中国人民解放军军事医学科学院十所,北京100039;中国人民解放军海军总医院血液科,北京100037;中国人民解放军海军总医院血液科,北京100037;中国人民解放军海军总医院血液科,北京100037;中国人民解放军海军总医院血液科,北京100037【正文语种】中文·论著·近年对制备化学物质抗体的研究很多，而利用噬菌体抗体库表面展示技术完成制备的报道少见[1-2]。
农药、兽药和食品添加剂抗体制备技术平台的建设是标准抗体资源库和快速检测方法建立的基础和关键。
【doc】抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定
抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定2000年第20卷第6期ChlaJ~lierOaiollmavano17一}抗KGla细胞噬菌体展示SeFv的筛选及鉴定';7￡隋建华何一心许静束增璇——一——一【摘要】目的应用KGla细胞(髓系白血病细胞系)筛选噬菌体抗体库,获得能以一定特异性结台KGIa细胞的单链抗体(ScFv),克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布;方法用完整的KGIa细胞筛选一个经KGla细胞免疫小鼠脾细胞的scn噬菌体抗体库,重复筛选4轮;细胞ELISA鉴定了其中96个克隆与KGIa细胞的结合反应;从26个KGIa细胞ELlsA 阳性克隆中挑选了3个克隆,进一步用免疫荧光染色,流式细胞仪分析其各自对应抗原在不同细胞表面的分布,并对其中2个克隆的scFv编码基因进行序列测定.结果流式细胞仪分析结果显示,3个克隆所识别的抗原均存在于不同白血病细胞表面,但比例分布不同,而3个克隆之间又略有差异,其中2个克隆的DNA序列测定结果显示其核苷酸序列和氨基酸顺序有所不同,均属小鼠免疫球蛋白同一可变区基因家族和亚群,重链可变区(vH)属亚群Ⅱ,家族Ⅵ,轻链可变区()属亚群Ⅲ,家族Ⅸ.结论用完整细胞筛选噬菌体抗体库可有效分离细胞表面分子的抗体片段及其基因,这种方法对于筛选和获得此类难以分离纯化和束知的细胞表面分子的抗体具有良好的应用价值;用KGla细胞筛选所得的抗体及其基因对于进一步研究和发现白血病细胞表面分子具有重要意义:…【主题词1哩堕韭茸啦堑世;三塑望;耋scne柚did蚰曲蒯0n0fa~i-KGla删apha窖e越曲y蛐蛐曲r町SUI血,HE,XU曲,礴d『瑚.,}dfD毋,c岫瑚eAeo~my肼e吐删&蹦&[艄College,嬲O.P00w嘲删越柏胛:SUIJm,E-moil:m@曲如r舯m【Ab日h】(,bjeclivescreer血gandel~ffmgofa一KGlacellr出chaiⅡ帅曲0dies(~Yvs)frompI-agedisay枷b0dyb唧.Meth0dsAscFvp}Ia舻displaylibrarythe印】eenceilsofmiceimmzedwJthKGlacells(~u.teTl0自町loIlsleI|acellli~e)wa吕selectedbyu乌i】theimra~ngeell~.After4珊lr-d宴ofpaI1rng,96in出d|lald0r?瞄ofpl~ge-ScFwwererededbycellFIISA.Threeoutofthe26positiveclonesthem胁hercheekedforthe曲∞oftheiraI】ti鲫∞diffe~enlcellsbymingⅢLItl0nu啦en e~etry.RI拈几dcy【0meⅡvassay81.0difremdi血ibu0I】ofthe0ntigemondifferentlet~kemiaceilsDNAs0qu帅ce8anddeduced且mi帅acids0erIcesofthehvoclnlnesahothbelo雌thes 衄emousekVsuIlpfamilyvHbelongss岫Ⅱf~filyⅥ,tIlebelongsto蜥ⅢfamilyⅨ.0咖d哪Ir.eell~canbeLbedeffe~iwlytoscreen,i∞andd0mgene~挑ee1] surfacenmleeuksM~ieh研usually}Iardtoisolatepuffy.Theanfi-KGlascwe~,dredareniforfurther~tadyingisolatingtheoensUd胱mecuksleukemiaceils.【吣ect啪rds】P}m铲血pb0dyli珂;sch;KGlaee1];S~'faeenmleede噬菌体展示抗体库技术近年来发展很快,日益成为制备单抗的有效手段.目前不仅已广泛应用于筛选针对纯化抗原的抗体片段,而且更为重要的进展之一是应用于复合抗原的筛选.这对于那些难以分离,纯化并获取一定量的抗原分子如膜结合型或细胞表面抗原分子等的抗体的分离和制备,以及发现未知的细胞表面分子具有重要的意义….我们探索了应用髓系白血病细胞KG1a筛选一个自建的噬作者单位:3000~0天津,中国和医科大学中国医学科学院血液学研究所实验血裱病学国家重点实验室通信作者:隋建华(E?Tn且iI:h@publletjue…cn)菌体抗体库,以期分离白血病相关细胞表面分子抗体及发现新的细胞表面分子.材料与方法实验材料:载体,菌株,辅助噬菌体及细菌培养基等同参考文献[2].细胞系:昆虫细胞St9;鼠成纤维细胞NIH.313;人胚肾细胞293;人肝癌细胞7402;人宫颈癌细胞tteI.a;人骨髓基质细胞ttFLe;人髓系白血病细胞KGla,m加,U937;人红白血病细胞K562,ttEL;人B淋巴细胞白血病细胞系Namalwa,ML;人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat.正常人外∞一20卷第6期CkinJMmbLmalun~.November2OOO,V ol20.No 周血来自健康献血者(共2例).噬菌体单链抗体库:来自KGla细胞免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞,为本组构建并鉴定了其库容,多样性及文库对外源抗体的表达能力.抗体库的筛选抗体文库噬菌体抗体上清的制备:取一部分保存的文库菌种悬于6ml2×YTGA培养基中使A600 为0.8左右,加人辅助噬菌体NI3K07(感染复数l~IOI=10),37℃静髭温育60rain,离心沉淀感染的细胞,并重悬于8ml2×YrAKT中,37"C培养5—8h,离心收集上清即为展示有SeFv噬菌体文库.用完整KGla细胞筛选噬菌体展示scFv文库:取3×106KGla细胞,PBS洗涤,加人lml含2%脱脂奶的PBS静置30min(室温22℃一25℃,以下操作均在室温下进行),加入300SeFv文库噬菌体上清(滴度约3X10")和4倍量的N13KO7(1.2×10),轻摇90rain,PBST(含0.o5%Tween20的PBs)洗l5次后离心沉淀细胞后加入500~1洗脱液(0.1mol/L甘氨酸/HC1,pH=2.5,含0.1%BSA),冰浴5min后10000Xg离心2mln,立即加入2mdlmo1]L的s中和,而后加人400A600=0.8的xL1一Blue,静置10rain感染XL1-Blue,全部铺于SOBGA揞养板,37℃培养过夜, 计算菌落形成单位(CFU),即为筛选后所得噬菌体颗粒数,刮取菌落获得KGla细胞筛选后的噬菌体次级抗体库再进行下1轮的筛选,同样方法筛选4轮,其中只是每一轮筛选时所用的噬菌体数量不同(表1). 单个克隆的噬菌体抗体制备:随机挑取96个筛选4轮后的单个克隆,按前述方法获得在噬菌体表面展示有scFv的单个克隆的噬菌体抗体上清,直接用于细胞ELISA检测;PEG/NaC1溶液沉淀,浓缩噬菌体抗体上清J,用于免疫荧光分析.检测噬菌体抗体与细胞的结合细胞EUSA(室温下操作):以l0o多聚左旋赖氨酸(Sigma)l0o孔包被96孔酶标板(Nunc公司),37℃烘干,加人lOOPBS重悬的2×l细胞/孔,静置6—8h,弃上清,0.24%戊二醛100~L固定细胞30mln,PBS洗涤1次,加人单个克隆的噬菌体抗体上清(2—3)Xll0o吼,孵育2h,PBST洗涤8次后用}玎RP-抗M13抗体(t~meia公司)检测结合的噬菌体颗粒,四氨基联苯胺(TNB)为底物,显色8 min,测定45Ohm的光吸收值(A450).阴性对照为与构建文库同一载体表达的抗PHOX的噬菌体抗体(由德国癌症研究中心Duble博士惠赠).免疫荧光:取l细胞与(2—3)X10"噬菌体抗体在含2%脱脂奶的PBS中混匀,室温1h(以后操作均在4"C进行),加人抗一M13抗体(Pharmacia公司)孵育1h,洗涤后,用Fife一大鼠抗小鼠荧光抗体(本所制备)标记细胞,经流式细胞仪(Coulter公司)分析10O0o个细胞,计算阳性率.阴性对照同上述细胞行EIISADNA序列测定:以双链质粒DNA为模板,以构建文库所用v的5端引物和的3端引物分别作为测序引物,ABI373A型测序仪进行双向,双链测序. 结果1.噬菌体抗体库的筛选:用KGla对噬菌体scFv抗体库进行了4轮的富集筛选,每轮对从KCla细胞表面洗脱下来的噬菌体颗粒进行了滴度测定,显示洗脱下来的噬菌体量逐渐升高,提示有特异性的富集(表1)表1筛选对特异性噬菌体抗体的富集T枷e1-由mt0f印edphagem州yby咄2.单克隆与细胞结合反应(1)细胞EIISA结果:用St9,NIH-313,293,HeLa,7402,I-IFCL等其他种属及人非血液系统细胞和KGla细胞分别与96个克隆的噬菌体抗体进行细胞ELISA检测,结果表明其中26个克隆呈现与KGla细胞强的特异性结合(表2示部分克隆的结果).表2克隆5C1,28,1R3的细胞Ⅱ麟结果Table2-ceⅡ甩0f5C1.荔and1R3phaged加for岫岫t0KGlaoelbA0ThBlloen45(A450)J∞?Ⅻ∞.eⅡlin档Hf蚰一一h日I越dkcelll,s丹Nm.m嘲7402HmC5C10.6160o9l0.I招012100580.1020.161280.7260l2502I20010000.0880.123IB30.7240O0.25o004001020.1280.∞ONme:Foreachc】othe~araeqL枷1h母0fp}噼I~tieles(2-3)xl w蕾uall^J】日s∞andeachwelleinduplicate.The ELISAadi咿一tIlen0rtIleIWO(2)免疫荧光分析:随机选取其中3个克隆(5C1,28,1B3),进行免疫荧光染色,分析与不同的人白血病细胞系KGla,m劢,U937,K562,ttEL,N龃】aha,574LCL,Jurkat及正常人外周血单个核细胞的结合反应,发现它们所识别的抗原分子在不同细胞表面的分布不同,在髓系白血病细胞(KGIa,HL-60,U937)的比例较高(图1),而在其他细胞表面的分布较少(均小于15%,结果未示),3个克隆之间仅在上述3种细胞的表面分布上略有差异.3.DNA序列测定结果:取5C1和IB3克隆测定其DNA序列,发现二者vK完全相同,而v的DNA序列及推导的氨基酸序列略有差异,同源性为98%,经计算机检索Kabat分类数据库,发现二者的V均属v皿群和Ⅵ家族,vK属Ⅲ亚群和Ⅸ家族(图2).KGlaT曲亩口圈…田囝图圜1田囝圆圆圈1诫式细胞术测定单克隆(SO,28,1B3)的识别分子在舶系白血庸细胞裹面的分布ng1.Flowt啊c啦出ofexprts~mdthe州e_oaksreeo~igmltheSeFvinehme5C1.28and1113V日of5C1and1B3(126aa):5C1一I-CAGGTGCAGCTGCAGCAATCCGGAGCTGAGCTGGTAAAGCCrGGGGCTTC AGTAAAGA TGQvQLQQSGAELVKPGASVKM…….一………..…………….………….….………….….…………….….上…..…..………………....……5Cl,lB3—61.TCCTGC^^GGCTTCTGG^T^CACA TTC^Cr^GCT^TG1^T^C^CTGGTTGAAG C^GC^GscKASGYTFTSYVIHLKOO5C1…121.CTGGGGCAGGGCCTTGAGTGG^TTGGATAT^rr^TTCCA TACAA TGATGGT ACTAAGTACLG0GLEWlGY【lPYNDGrKS5CI.一181.AA TGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGC丁TGACAAATCCTCCAGCACAGCCT^CNEKFKGKA TL￡yDKSSSTAY ……..…………..…………......……ACr7TA...............................一. (7)￡.…….……一….…5C1/IB3..241.ATGGAGCTCAGTAGCCTGACCTCTGAGGACTcTGCGGTC1^TTA CTGTGCAAGAGAGAAGMELSSLTSEDSAVYYCAREK5CI/IB3..381.ACGGTTCACTGGTACTTCGA TGTCTGGGGCGCAGGGACCACG GTCACCGTCTCCTCAGCCTVHWYFDVWGAGTTVTVSSA5CI/IB3--361'AAA^CGAc^CCC^^Gc丌KTTPXLVRofSCland1B3(1lla:l—G^TA TCGTCCTGACTCAGTCACCAGCTTCT丌CGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGCCCACCD1VLTQsPASLAVSLGqR^T6I一^TCCTGCAGAGCCAGTG^^AGTGTTGATAGTTATGGCTA TAGTTTTATGCACT GGTAC【SCRASESVDSYGYSFMHWY21CAGCAGAAAC—CA—GGACAGCCACCCAAACTCcrcA TCTATC1-TGCATCCAACCTAGAATCT QQKPGQPPKLL1YLAsHLgS181.GGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTcTAGGACAGACTTcACCC TCAACATCCATCVPARFSGSGSRTDFTLN【H241一CCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGC^ATC1TTACTGTCAGCAAAGTAAGGAGG ATCCGTGGPVEggDAAIYYCQ0SKEDPW301.ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAA TCAAACGG TFGGGTKLEIKR圈2克隆5CI,IB3的vH和VK的核苷酸和推导的氨基酸序列Fig2.Theaudeoddeanddedumlaa1~oaddseqmmeestheV aandVthe5CIand1B3 Theandedhledseque~toes盯ec】,nueleofidesandazrdnoaddsd赶er翱cebetw~5CIandIB3mesho~-edinitalics21)卷第6期ChinJMie~obio讨论应用噬菌体抗体库技术筛选到针对固相化的纯化抗原分子的抗体片段已有相当成熟的方法.近年来,人们尝试将噬菌体抗体库技术应用于难以分离纯化或者固相化过程本身会引起构象改变的抗原分子,尤其是膜结合性或细胞表面抗原分子等抗体的筛选,目前已有将完整细胞筛选获得特异性抗体的报道然而,由于完整细胞表面含有大量的糖类,蛋白等抗原成分,致使在筛选过程中往往存在大量非特异性吸附的干扰,我们在筛选中使用4倍过量于噬菌体抗体量的野生型噬菌体,同时与KGla细胞孵育以降低重组噬菌体抗体与细胞的非特异性吸附,并且用强烈的洗涤条件以期提高特异性噬菌体抗体的富集效率,经4轮筛选后,洗脱的噬菌体滴度的增加提示筛选过程是有效的,这进一步被细胞ELISA结果所证实.随机挑选出4轮筛选后的96个克隆进行细胞ELISA分析,结果其中26个克隆仅与KGla细胞呈强特异性结合反应,而与其他种属细胞,人非血液系统细胞共6种细胞呈微弱或无结合反应;进一步从这26个克隆中随机挑选3个克隆分析它们在不同白血病细胞系和人正常外周血单个核细胞表面的比例分布,结果在髓系白血病细胞3个克隆的阳性细胞百分率均较高,而在其他种类的细胞没有或仅有较弱的结合反应,提示它们识别的抗原分子可能与髓系细胞的发育和分化有关.进而测定了其中2个克隆的DNA序列,结果表明这2个抗体基因编码的氨基酸顺序在v的4个部位不同,CDR3完全相同,均属小鼠免疫球蛋白同一可变区基因家族和亚群,它们可能识别相同的抗原决定簇.KGla细胞由于分化程度很低,被认为是造血干/祖细胞系,其表面具有造血细胞发育,分化早期阶段相关的多种标志分子及细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子,这些细胞表面分子抗体基因的分离具有重要的理论和临床应用价值我们应用KGla细胞直接筛选噬菌体展示scFY抗体文库,经细胞ELISA得到KGla阳性克隆,进一步分析了其中都分克隆所识别的抗原分子在其他白血病细胞表面的分布情况,并测定其中2个克隆的DNA序列,这些资料将为进一步分离和发现这些抗体所识别的KGla细胞表面分子奠定基础,并有可能为研究造血干细胞分化提供有价值的线索参考文献1_.b'Ⅲ1HR,BmineAP,HufitmSE,dalAntibodypbagedisplaytedmolo~~anditsIic叫1slmramotechnolog)-,1998,4:1-加2隋建华,宋增余鸣,等.KGIa细胞免疫小鼠脾细胞scPv噬苗体展示文库的构建及其表达中国免疫学杂志,92300,16(6):31$一3213CaiXH,Gsa'~A.Antiomelanonm~tibodiesh'ommelanomapatientsira- monized-,dthgene6eaUymodifiedQlltolo~olismraor汕:Seleeti~ofspe—eifie朋虹bod曙frothsi.1c}Fvfusi~P|Liibr~es.1%acAndAeadSeiUSA.,1995926537-65414Wattcs,s,IM,Tell~w.anPJⅢlhansRP.An叩Ⅱ副mbodforcall- baseddispIpannmglm岫,1997.3:21?295KlJM,‰删,KW,etIsolaliandharmatumatospe?eitie曲LbD出∞村L|椰.f丑llantibodyP|Llibrary.Oftmelarl,m,acelts.~3itaCanR.es1999.S:925.-931.(收稿日期:1999437-20)《中国肿瘤生物治疗杂志》征订启事《中国肿瘤生物治疗杂志》是创刊于1994年并经国家科委和国家新闻出版署正式批准,由中国免疲学套和中国抗癌协套联合主办的国家正式医学期刊(刊号为ISSN1007-38,.CX;GN31-llS3/R).1996年被《中国医学文摘?肿瘤学》列为板,42期刊;1999年被列入国家科技部"中国科技论文统计源期刊;呻0年被列入《中国期刊网》,《中国学术期刊(光盘版)》全文收录期刊和《中国学术期刊综合评价数据库》来源期刊,《中国科学引文教据库》来源期刊.《中国肿瘤生物治疗杂志》每期定价}8.00元,仝年定价:32.00元,邮发代号:4-576,请通过邮局订阅姗年的《中国肿瘤生物治疗杂志》(即第八卷).若错过,也*-YZk本刊蝙辑部补订,请将舯.00元(含邮资)寄本刊编辑部并请注明详细通迅地址压邮政蝙码,本刊编辑部将负责如期寄至您的手中.联系地址:上海市翔殷路舯0号第二军医走学免疫楼《中国肿瘤生物治疗杂志》蝙辑部电话:021-55620(~8x22联系人:厉永建邮政编码:200433。
硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选
硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选寇立泉;刘爽;王东方;祁志军【摘要】旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选.采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达.采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性.得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性.说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2014(023)004【总页数】5页(P202-206)【关键词】硫代磷酸酯类杀虫剂;单链抗体库;ELISA【作者】寇立泉;刘爽;王东方;祁志军【作者单位】西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌712100;西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌712100;西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌712100;西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S481硫代磷酸酯类杀虫剂作为一类有机磷类杀虫剂（Ops），是一种重要的农业生产资料，在防治害虫和增加粮食产量方面发挥了极大的作用，但由于其大量使用造成的环境问题也越来越受到人们的关注［1］。
传统的仪器检测样品前处理耗时长、操作水平要求高、操作仪器价格昂贵，难以实现大批量样品的快速筛选与现场的实时检测［2］。
噬菌体展示技术是继单克隆抗体制备技术［3］后具有换代地位的抗体制备技术，因其筛选通量高、试验周期短、效率高、特异性强及亲和选择范围广等特点在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景［4］。
本研究在前人合成出的硫代磷酸酯类杀虫剂半抗原基础上［5－6］，旨在建立一种利用基因工程单链抗体检测有机磷农药残留的方法，以便快速有效地检测食品中硫代磷酸酯类杀虫剂的含量。
从scFv噬菌体库分离特异性的人源化抗D-dimer抗体
从scFv噬菌体库分离特异性的人源化抗D-dimer抗体夏红利;谭最;陈德杰;乔建国;邱仁峰【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)002【摘要】目的从scFv(单链Fv)噬菌体抗体库分离出对D-dimer有特异性的人源化单克隆scFv.方法对Tomlinson scFv噬菌体文库进行3轮淘洗,富集特异性的抗D-dimer抗体并进行ELISA 验证.通过酶联免疫检测和双脱氧终止法基因测序,获取特异性的人源化单克隆抗体.结果 3轮淘洗选择出38个抗D-dimer噬菌体抗体,酶联免疫和基因测序分析后,20个不同的全长单克隆抗D-dimer scFv噬菌体抗体被筛选出来,3轮选择后阳性克隆获取率为100%;分泌性抗体ELISA结果显示单克隆anti-D-dimer噬菌体顺利表达了抗体蛋白;5个A450值较高的单克隆中,3个显示了对D-dimer的高特异性和亲和力.结论抗体噬菌体展示技术是分离获取人源化特异性anti-D-dimer抗体的高效快速方法.%Objective To isolate specific humanized anti-D-dimer scFv(single chain Fv) antibody from scFv phage libraries. Methods Isolate anti-D-dimer positive clones from Tomlinson I + J phage libraries by three rounds of panuing, then sequence monoclonal genes by bideoxy-mediated chain termination and express soluble scFv antibody; Pick out anti-D-dimer antibodies with high specificity and affinity by ELISA.Results After three rounds of selection from human scFv phage libraries Tomlinson I and J, 38 monclonal specific anti-D-dimer scFv fragments were selected. By polyclonal and monoclonal phage ELISA and gene sequencing, 20 different full-length monoclonal scFv phages wereidentified, the result of soluble scFv ELISA showed that 20 full-length monoclonal scFv were expressed smoothly. According to the result of soluble scFv ELISA, in 5 scFv antibodies with high value of A450 selected, 3 scFv antibody fragments showed high specific and affinity. Conclusion Antibody phage display was an effective, rapid method to isolate anti-D-dimer antibodies with high specificity and affinity.【总页数】5页(P168-172)【作者】夏红利;谭最;陈德杰;乔建国;邱仁峰【作者单位】430071,武汉大学中南医院普外科;430071,武汉大学中南医院普外科;襄樊市中心医院普外科;430071,武汉大学中南医院普外科;430071,武汉大学中南医院普外科【正文语种】中文【相关文献】1.人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定2.从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv3.抗HCMV人源化噬菌体抗体库的构建4.抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化5.人源化抗HCMV噬菌体ScFv库的构建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体
从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体
王刚;化冰
【期刊名称】《海军总医院学报》
【年(卷),期】1999(12)4
【摘要】目的；从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。
方法：经表皮角蛋白为抗原，通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体。
用ＥＬＩＳＡ和ＤＮＡ指纹分析对所获抗体进行鉴定。
结果：经过４轮筛选，获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆，其中可产生特异性抗蛋白抗体的克隆１８个。
经ＤＮＡ指纹分析，判定所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。
【总页数】5页(P204-208)
【作者】王刚;化冰
【作者单位】海军总医院中心实验科;海军总医院中心实验科
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.从半合成噬菌体抗体库筛选基质金属蛋白酶-2人抗体 [J], 丁秀云;王琰;化冰;王刚;刘群英;李春海
2.从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体1 [J], 化冰;王刚;王琰;刘德新;李小鹰
3.从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体 [J], 王刚;化冰;王琰;刘玉峰
4.从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv [J], 张国民;乔媛媛;陈宇萍;吕喆;安云庆
5.从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体 [J], 闭兰;张爱华;彭祥兵;王志友;张智;余模松
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噬菌体展示scFV抗体流程
噬菌体展示scFV抗体流程
噬菌体表面展示基本概念
将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。
直接将可见的表达型与其基因型联系在一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白
质或多肽挑选出来。
多年来,噬菌体展示技术被用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备。
特别是近几年来,该技术被作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面的研究。
噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示scFV抗体流程示例
噬菌体展示技术优点
●淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；
●所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；
●展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。
从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体
从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体邵锴;姜海燕;张国利;岳玉环;朱平;吴广谋;刘瑞田【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2008(012)005【摘要】目的从Tomlinson(I+J)噬菌体抗体库中筛选人源化抗HIV-Tat蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法以HIV-Tat蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗Tat蛋白单链抗体,对其进行基因序列测定,并检测其抗原结合活性.结果经过筛选,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VH Ⅲ型.结论利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Tat蛋白单链抗体.【总页数】3页(P592-594)【作者】邵锴;姜海燕;张国利;岳玉环;朱平;吴广谋;刘瑞田【作者单位】军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;清华大学【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体 [J], 乔媛媛;霍雨佳;周丽君;王欲晓;张达矜;郝秋星2.从噬菌体单链抗体库中筛选MMP7单链抗体 [J], 孙春燕3.抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选 [J], 王永娟;李碧春;沈明君;洪伟鸣;左伟勇4.从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体 [J], 夏汝山;乔媛媛;王刚;陈宇萍;沈柱;王琰;刘玉峰5.从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs人源单链抗体 [J], 杜丽;周丽君;潘秀颉;王豫;王欲晓;杨陟华;徐勤枝;张士猛;朱茂祥;周平坤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定
抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定岳文涛;赖百塘;张春燕;湛秀萍【期刊名称】《结核病与胸部肿瘤》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】目的制备抗人肺癌单链抗体（single chain Fv ferment antibody，ScFv），并对抗体生物学特性进行初步研究。
方法以人肺腺癌细胞系A：为抗原，对5F一11杂交瘤细胞噬菌体抗体库进行富集和筛选。
以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原，进行酶联免疫吸附试验，从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆。
筛选的噬菌体克隆转染大肠埃希菌HB2151，得到可溶性单链抗体分泌克隆。
可溶性抗体分泌克隆测序。
应用ELISA、竞争性ELISA、SDS．PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7．1克隆进行初步鉴定。
结果以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集。
进一步筛选得到18个仅识别A：细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆。
转染大肠埃希菌HB2151后筛选到能与Az细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7．1。
竞争性ELISA结果显示，5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合。
SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30X10。
的单链抗体。
结论通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆，为进一步的抗体应用研究奠定了基础。
【总页数】6页(P84-89)【作者】岳文涛;赖百塘;张春燕;湛秀萍【作者单位】北京市结核病胸部肿瘤研究所细胞生物学研究室【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.抗IL－13全人源单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定 [J], 张登梅;年四季;叶迎春;杨燕;于红;袁青2.人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定 [J], 汤正好;马会慧;陈文思;顾琳;李刚;姚集鲁3.抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定 [J], 马巍娜;刘雪林;宋宏彬;沈建良;黄友章;宫立众;向丹;臧丽梅4.抗克伦特罗单链抗体噬菌体展示文库的构建初步筛选及鉴定 [J], 王弘;潘科;雷红涛;杨金易;孙远明5.抗人结肠癌单抗MC5的功能性ScFv在大肠杆菌中的可溶性表达(英文) [J], 何凤田;郑英如;高会广;陈姗;李蓉芬;江渝;彭家和;钟小林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定
抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定周云;包林;金秋;张黎;蔡雪婷;卢悟广;曹鹏;焦永军;张建平【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2013(053)020【摘要】目的从人源噬菌体抗体文库中筛选抗人结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv),原核表达并鉴定其活性.方法以重组人源CTGF(rhCTGF)为靶标,对人源噬菌体抗体文库进行筛选；用Phage-ELISA筛选阳性克隆并进行原核表达、纯化,获得了高纯度的ScFv蛋白,通过ELISA和Millicell迁移实验鉴定其活性.结果经过3轮筛选,获得1株特异性抗人CTGF ScFv 1C5,ELISA显示1C5能与rhCTGF特异性结合；在Millicell迁移实验中,1C5能抑制CTGF的生物学功能,具有中和活性.结论成功筛选到1株抗人CTGF的ScFv,有望在CTGF相关疾病的治疗上发挥作用.%Objective To screen anti-connective tissue growth factor(CTGF) human single-chain variable fragment (ScFv) from human phage antibody library,prokaryotic expression and to identify its activity.Methods The human phage antibody library was screened by using rhCTGF as the target,and the positive clones were selected by phage-ELISA to induce its prokaryotic expression and to purify the protein,and the high purity ScFv protein was obtained.Its activity was identified by ELISA and Millicell migration assay,respectively,Results After three rounds of screening,only 1 clone,designated 1C5,with good reactivity to rhCTGF was selected.1C5 was found to bind human CTGF specifically in ELISA,and inhibit CTGF's function in Millicell migration assay,indicating its neutralizing activity.Conclusion Ananti-CTGF human singlechain Fv clone was successfully identified,which could be used as therapeutic agent candidate for CTGF-related disease.【总页数】5页(P15-17,21,后插2)【作者】周云;包林;金秋;张黎;蔡雪婷;卢悟广;曹鹏;焦永军;张建平【作者单位】南京医科大学第二附属医院,南京210011;卫生部肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所;卫生部肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所;卫生部肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所;江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室;江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室;江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室;卫生部肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所;南京医科大学第二附属医院,南京210011【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.抗IL－13全人源单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定 [J], 张登梅;年四季;叶迎春;杨燕;于红;袁青2.人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定 [J], 肖静;刘章锁;王雅楠;赵国强;王沛3.抗人Cyclin D1人源单链抗体AD9的表达及活性分析 [J], 曹玉华;李善玉;陈勇;邹德生;田宇;郝东云;李桂英4.全人源抗MAGE-A1单链抗体的筛选及免疫活性鉴定 [J], 丁贵鹏;朱进;朱毅;孙景军;张建平;冯振卿;管晓虹5.人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定 [J], 王凯;温伟红;王涛;张瑞;秦炜炜;雷小英;杨安钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体
应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体黄君健;俞炜源;黄翠芬【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】1996(000)001【摘要】应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体（DD）免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体（ScFv）cDNA文库。
文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10<sup>5</sup>个氨苄抗性菌落。
通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体（ScFvA11）。
经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10<sup>7</sup>tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10<sup>10</sup>tfu/ml,两者相差1000倍以上。
表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。
经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为（Gly<sub>4</sub>Ser）<sub>3</sub>15个氨基酸连接肽。
【总页数】6页(P1-5,14)【作者】黄君健;俞炜源;黄翠芬【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所;军事医学科学院生物工程研究所北京 100071;北京 100071;北京 100071【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.应用噬菌体抗体库技术建立抗前列腺特异抗原人—鼠杂和抗体 [J], 昝虹;叶敏2.抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定 [J], 段朝晖;毛越苹;罗晓红;李民友;劳伟思;王英;朱振宇3.鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 裴世春;孙大庆;郭德军;宋薇;蒋琛4.从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体 [J], 孙雷;高新胜;黄仪秀;朱圣庚5.鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建 [J], 陈鸣;府伟灵;俞丽丽;张雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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2007年 2月 第 28卷 第 1期
首都医科大学学报 Journal of Cap ital M edical University
Feb. 2007 Vol. 28 No. 1
·基础研究 ·
从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白 scFv
张国民 1 乔媛媛 2 陈宇萍 2 吕 喆 1 安云庆 13
蛋白组与其他非特异对照组的比较用 t检验进行分 析 ,以 P < 0. 05为差异有统计学意义 。 1. 5 抗体可变区基因的 DNA 指纹分析
将筛选到的阳性克隆提取质粒 ,经 H indⅢ + NoⅠt 双酶切鉴定。以酶切鉴定正确的抗体 DNA 质粒为模 板 , PCR 扩 增 scFv 基 因 , 扩 增 产 物 经 CL 26B 凝 胶 ( Pharmacia公司 )离心纯化 ,以内切酶 MvaⅠ消化后 ,进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,根据电泳情况分析基因的多 样性 。 1. 6 抗体可变区基因的序列测定及分析
was panned for four times. The specificity of the antigen binding activity of the selected clones was identified by EL ISA. Positive clones were analyzed by DNA fingerp rint and sequencing. Results After 4 rounds of“adhesion2elution2amp lification”panning, 9 clones exp ressing anti2keratin scFv were obtained. DNA fingerp rint and sequence analysis showed that they had different antibody V region encoding genes. Conclusion Human anti2keratin scFv is obtained from a large phage antibody library, which w ill benefit to the app lication of anti2keratin antibody to clinical research. 【KEY W O RD S】 phage antibody libraries; keratin; scFv
第 1期
张国民等 :从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白 scFv
(1. 首都医科大学微生物学和免疫学教研室 ; 2. 海军总医院中心实验科 )
【摘要 】 目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 ( scFv) ,测定其特异性结合活性并进行基因序列分析 。 方法 以混合分子量人表皮角蛋白包被固相 ,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选 ,经 4轮“吸附 洗脱 扩增 ”后 ,挑取单克 隆 ,用 EL ISA法测定特异性结合活性 ,并对阳性克隆抗体基因进行 DNA指纹分析及序列同源性分析 。结果 经 4轮筛选 ,获得 9 株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆 ,酶切鉴定正确后 ,经 DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因 。结论 利 用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体 ,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体 。 【关键词 】 噬菌体抗体库 ; 角蛋白 ; 单链抗体 【中图分类号 】 R 392. 12
脱 扩增 ”的程序对大容量噬菌体抗体库进行了 4轮 筛选 ,每轮筛选均测定次级库的滴度并计算回收率 , 并以此作为特异性噬菌体抗体富集的指标 。在每轮 筛选过程中均可见到富集现象 ,回收率亦逐渐升高 。 从筛选第 4 轮的培养盘中挑取 40 个单集落 ,制备噬 菌体抗体上清 ,用 EL ISA 法进行抗原特异性分析 ,结 果 11个克隆可与角蛋白特异性结合而与其他抗原 (地高辛 、胃蛋白酶及卵清蛋白 )不结合 。表 1示其中 5株的特异性结合活性鉴定结果 。 2. 2 阳性克隆的酶切鉴定
从筛选第 4轮的培养盘中 ,挑取 40个单个集落 , 接种到 2 mL 含 10 g /L 葡萄糖的 2 ×YT液体培养基 中 ,于 37 ℃培养至 OD600 = 0. 5 ～0. 8 时 ,用辅助病毒 VCSM13拯救 ,继续培养过夜后收集上清 ,即为噬菌体 抗体 。用 EL ISA 法进行抗体特异性结合性能的鉴定 : 用角蛋白抗原包被 EL ISA 板 , 以 25 g /L 脱脂奶粉 / PBS封闭 ,加入以上所得的噬菌体抗体上清 50 μL / 孔 ,以 HRP2抗 M13 抗体为二抗进行结合反应 , 经底 物邻苯二胺 (OPD )显色后 ,测定 A490的值 。同时以地 高辛 、胃蛋白酶及卵清蛋白包被的 EL ISA 板作为非特 异性结合对照 。结果以均数 ±标准差 ( x ±s)表示 ,角
收集人外周血并分离淋巴细胞 ,提取总 RNA,经反 转录 (RT2PCR)合成 cDNA, 然后用根据全部胚系可变区 基因设计的多组引物 , 以 PCR分别扩增轻、重链可变区
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首都医科大学学报
第 28卷
基因 VL和 VH。再将获得的 VL和 VH以外延引物进行 2次 PCR,加入适当的酶切位点及 loxp511序列 , 然后进 行重叠 PCR (over2lap PCR ) ,将 VL 和 VH 基因拼接成 scFv基因 ,纯化回收后经 B ssHⅡ+NheⅠ酶切位点克隆入 载体 PDF,并电穿孔转化大肠杆菌 XL12B lue, 获得初级 噬菌体抗体库。初级抗体库以噬菌体 ∶细菌 = 200 ∶1的 比例〔感染复数 (MO I) = 200〕超感染 cre +大肠杆菌 BS1365,使多副本噬菌体载体进入同一细胞 ,在 cre蛋白 的存在下进行同源重组。用辅助病毒 VCSM13拯救 , 30 ℃培养过夜 ,次日收集噬菌体抗体库。再以 MO I < 1的 比例感染对数生长期的 XL12B lue菌 , VCSM13拯救 , 30 ℃过夜 ,次日收集上清 ,经聚乙烯二醇 ( PEG)沉淀后 ,即 获得大容量的重组噬菌体抗体库。抗体库滴度的测定 : 将 1～10μL经适当稀释的噬菌体上清液入加新鲜 XL12 B lue菌液至 100μL,室温放置 15 m in,铺含 Amp的 LB培 养盘 , 37 ℃培养过夜 ,计数集落 ,计算滴度。 1. 3 噬菌体抗体库的筛选
为明确所获抗体的基因背景 ,了解抗体可变区尤 其是第一骨架区的完整性 ,对抗体可变区基因进行测 序和分析 。DNA 序列的测定由上海博亚生物技术有 限公司完成 。用 Pcgene软件 ( Intelli Genetics公司 )进 行序列分析和同源性比较 。
2 结果
2. 1 噬菌体抗体库的筛选 以角蛋白抗原包被固相抗原管 , 经“吸附 洗
乔媛媛等 [2 ]利用 loxp / cre蛋白定位重组系统 ,采 用单载体细胞内重组法成功构建了大容量噬菌体抗体 库 ,经多种抗原筛选验证 ,该抗体库有良好的多样性。
本工作以混合分子量人表皮角蛋白为抗原 ,通过 固相淘筛法对该抗体库进行筛选 ,旨在获得人源性抗
3 通讯作者 ( Corresponding author)
C lon ing of An ti2kera tin ScFv From a Human Large Phage An tibody L ibrary
Zhang Guom in1 , Q iao Yuanyuan2 , Chen Yup ing2 , LüZhe1 , An Yunqing13 (1. D epa rtm en t of M icrobiology and Imm unology, Capita l M ed ica l U n iversity;
抗角蛋白抗体可显著降低角质形成细胞的增殖 代谢 ,具有非特异性的抗炎作用 ,在对抗角蛋白自身 抗体 (AK autoAb)低下的银屑病的治疗中 , 人为地补 充和纠正该抗体已显示出令人满意的治疗效果 [ 1 ] 。 由于鼠单克隆抗体 (mAb)用于人体时有鼠源性缺陷 , 目前通过噬菌体抗体库技术制备人源性抗体已成为 获得治疗性抗体的理想途径 。迄今报道的成功构建 的抗体库已有很多 ,通过分析发现 ,抗体库的容量与 所获抗体的亲和力大体成正比 ,因此构建大容量抗体 库是不经免疫制备抗体的关键 。
从以上筛选到的 11 株阳性克隆中提取质粒 ,用 H indⅢ +NoⅠt 双酶切后 ,进行琼脂糖凝胶电泳 ,正确的 质粒应放出约 1 000 bp 的 DNA 条带。结果表明 ,有 9 个克隆放出 1 000 bp左右的条带 ;另 2个克隆及阴性对 照 ( PDF空载体 )则无该条带出现 (图 1) 。 2. 3 抗角蛋白单链抗体基因的 DNA 指纹分析
2. Cen tra l L ab of N avy Genera l Hospita l)
【ABSTRACT】 O bjective To clone human single chain antibodies ( scFv) against keratin from a large phage antibody library and analyze the specificity of antigen binding activity and the homology of gene sequences. M ethods A human large phage antibody library