定向调控精准打靶
转基因
胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)是指从哺乳动物胚 胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞， 这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。
这个途径是将外源基因直接导人ES细胞，经 体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中 的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分， 参与其分化。 由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物， 即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供 体ES细胞。 在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的 生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。
1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的 疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分 子机制。 2、基因打靶与肿瘤的研究 研究基因改 变与肿瘤发生及治疗的关系 3、基因打靶可用于构建高效的动物反应器 或植物反应器，用于药物生产。
逆转录病毒感染法 • 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成 高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床 后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转 录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的 目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到 宿主基因组DNA中去。 • 特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽 类的转基因研究。单点单拷贝插入，外源基 因的完整性不易被破坏。
转基因动物建立流程
待转移的目的基因的获得与设计 动物遗传背景及种系的选择
在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景 及种系的问题。
• 转基因动物生产主要步骤包括： • 目的基因的选择，这应视生产目的而定； • 将重组基因转入受精卵，常使用的方法有显微 注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞法、精 子载体法、脂质体法等 • 将转入了外源基因的受精卵植入同期发情的受 体动物，在植入前完成整合胚胎的检测、筛选、 建立ES细胞系； • 对出生后基因整合、表达情况进行检测，对整 合、表达的转基因动物进行育种试验，建立由成 功转基因个体或群体组建的转基因系。
分子植物卓越中心水稻基因打靶技术研究获进展
他主粮作物而言尚无明显突破，大豆生产亟需“绿色革命”。
本次泛基因组研究所选用的大豆种质材料不仅在遗传多样性上具有代表性，且具有重要的育种和生产价值。
其中满仓金、十胜长叶、紫花4号等种质材料作为骨干核心亲本已各自培育出了上百个优良新品种：黑河43、齐黄34、豫豆22、皖豆28、晋豆23、徐豆1号等品种是各个大豆主产区推广面积最大的主栽品种。
该基因组和相关的2898份种质材料遗传变异的发布为大豆研究提供了重要的资源和平台，将推进大豆分子设计育种，助力实现大豆“绿色革命”。
相关研究结果以Pan-genome of wild and cul⁃tivated soybeans为题在线发表于《细胞》杂志上。
田志喜研究组博士生刘羽诚、梁承志研究组博士生杜会龙为该论文的第一作者，田志喜为论文通讯作者，梁承志为共同通讯作者。
该研究得到国家自然科学基金委和中科院的资助。
（来源：遗传与发育生物学研究所）分子植物卓越中心水稻基因打靶技术研究获进展中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员朱健康领衔的研究团队，在植物基因组编辑领域再次取得重要进展。
研究人员采用修饰后的DNA片段作为供体，在水稻上建立了一种高效的片段靶向敲入和替换技术，高至50%的靶向敲入效率将极大地方便植物的研究和育种。
7月6日，相关研究成果在线发表在Nature Biotechnolo⁃gy上。
近年来，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点编辑技术在农作物基因功能研究和精准育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和应用前景。
然而，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点敲除技术只能在基因组特定位点产生随机插入和删除，精准的片段插入和替换的效率一直很低，限制了其在植物研究和育种上的应用。
因此，迫切需要建立更高效的植物基因组片段插入和替换技术体系。
植物基因组编辑是朱健康研究组的重点研究领域，近年来获得了一系列的进展。
作为该领域的难题，片段的靶向敲入和替换是科研人员的重要研究目标，并围绕这一目标努力。
精准调控 工作方法
精准调控工作方法随着经济发展水平的提高，调控方法的更新换代也成为了必然的趋势。
精准调控工作方法因此应运而生，在调整经济结构、优化工业布局、促进就业等多个方面得到了广泛的应用。
精准调控工作方法更注重的是精、准、实的结果。
那么，什么是精准调控工作方法呢？一、精准定向方法精准定向是指根据不同行业和不同目标的需求进行分类，针对性地制定和实施政策，以达到约束不相关行业的效果。
精准定向方法的执行程序与传统的中央政策有所不同。
它更侧重于资源的分配。
二、精准施策方法精准施策是指在精准定向的基础上，各个行业或领域需要制定不同的方案和政策，以满足其不同的需求。
同样的政策在不同地区的潜在影响是不同的。
这时候就需要在执行时进行不同的施策。
三、精准响应方法当发现在实施层面上出现困难时，就需要采取响应措施，对症下药解决问题。
反馈机制有助于进一步改进和完善制定的政策和措施。
精准调控工作方法的原则1.因地制宜。
在制定政策时，要根据不同地区、不同层面的经济发展水平，分类制定调控措施，使政策更地道、更适合当地的实际情况。
2.科学精确。
有人说：无论你如何制定政策，如果不能真正理解问题的本质，那么结果将是失败的。
在采用精准的调控方案时，必须尽可能的去寻找问题的本质，避免没必要的制定政策。
3.注重实际效果。
制定政策的根本目的是为了实现调整经济结构、扩大产业规模、促进地方发展等多个目标。
必须严格掌握实施效果和调整政策的效果。
在实践中，政策只有在实际运用中被证明是有效的才能真正落地。
4.协同作用。
政府是执行精准调控的主体，但是也需要各类企业、专家、学者等整合起来。
需要加强政府、企业、学者等各方的协作，增强政策制定的性质和纵深性。
精准调控工作方法的优势1.具有强大的调控功能。
精准调控是一种因地制宜的调控方法，可根据实际情况、地理位置、经济发展水平等因素进行差异化的调整，以达到更适宜的效果。
2.能够提高政策的执行效率。
精准调控是根据不同地区和不同行业的需求和特点，采取不同的针对性措施。
基因打靶技术.
四、外源DNA导人的方式
•
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔 法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最 广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射 法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA 细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个 细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。 Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定 转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细 胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶， 在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
常用的选择标记基因
•
•
正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶 （neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄 嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤 磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk） 及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。 负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、 tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB 等。
•
胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合 体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的 一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的 特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛 地应用于建立转基因动物之中。从80年代 到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已 发展到成熟阶段。
•
1984年， Bradly等成功地用显微注射法将 ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠， 获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获 得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首 次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发 育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子 代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除 (Gene knockout)的动物模型。此后，这项技 术得到了普遍应用和长足发展。
基因打靶技术的研究进展
01 引言
目录
02 研究现状
03 传统基因打靶技术
04 新兴DNA纳米技术
05 应用领域
06 基因功能研究
07 疾病治疗
目录
08 研究方法
09 基因打靶效率的评估
010 挑战与展望
011 结论
引言
基因打靶技术是一种通过定向改造生物体基因组来实现基因功能研究与疾病 治疗的新兴技术。自20世纪80年代初以来，基因打靶技术不断发展，为科学研究 与医学实践提供了强有力的工具。本次演示将综述基因打靶技术的研究现状、应 用领域、研究方法以及挑战与展望，以期为相关领域的研究人员提供参考。
新兴DNA纳米技术
近年来，随着DNA纳米技术的不断发展，出现了一种基于DNA纳米结构的新型 基因打靶技术。该技术利用DNA自组装纳米结构，将基因打靶与纳米药物输送相 结合，具有更高的靶向性和细胞内活性。此外，DNA纳米技术还可用于基因编辑、 疫苗研发等领域，为基因打靶技术的发展开辟了新途径。
应用领域
挑战与展望
尽管基因打靶技术具有广泛的应用前景，但仍面临许多挑战和问题需要解决。 其中，靶向序列的设计和制备是关键的挑战之一。目前，靶向序列的设计主要依 赖于计算机辅助软件，但这些软件的准确性和可靠性仍有待提高。此外，制备高 质量、大规模的靶向序列仍是一个挑战。未来，研究人员需要开发更加高效和准 确的软件和方法，以提高靶向序列的设计和制备水平。
2、DNA疫苗
DNA疫苗是一种将外源抗原编码基因导入机体，通过机体细胞表达抗原蛋白， 诱导机体产生免疫应答的疫苗。基因打靶技术可应用于DNA疫苗的研发，将抗原 编码基因导入机体细胞，提高疫苗的免疫原性和保护效果。
3、基因治疗
基因打靶技术可用于基因治疗，通过将外源正常基因导入患者体内，补偿缺 陷基因的功能，达到治疗疾病的目的。例如，利用基因打靶技术将正常β-珠蛋 白基因导入贫血患者的造血干细胞，可有效治疗地中海贫血。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
Gene targering 基因打靶
(四)外源基因的时间可控性表达：
实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表 达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表 达在动物发育不同阶段中的作用。另外，由于外源基因 表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期 死亡。为了解决这一问题，Mentzger等人(1995)用编码 Cre重组酶与人雌激素受体(estrogen receptor,ER)融合 蛋白的基因制备了Cre – ER转基因小鼠，给这种转基因 小鼠注射人雌激素，可诱导Cre – ER的大量表达。再用 插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶 小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反， 则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。
1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman 首先分离培养成功。
基因打靶的原理
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新 的基因。
(2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。
(3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以 正常基因替代突变的内源基因。
loxP位点 DNA序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的
DNA序列连同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的
DNA序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则
被调转方向。
Loxp 位点
两个loxp位点的方向相同
loxp
gene
loxp
Cre
两个loxp位点之间的基因被切除
两个loxp位点的方向相反
逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲 合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因 治疗方面具有较大的发展潜力。
实验动物现代新技术(二)转基因动物技术
法律问题
各国对转基因动物技术的法律法 规不尽相同，可能限制该技术的 发展和应用。
伦理问题
应尊重动物的福利，尽量避免对 动物的伤害和痛苦，同时确保转 基因动物的安全性和可控性。
未来发展趋势与展望
发展趋势
随着基因编辑技术的发展，转基因动 物技术将更加精准和高效，有望在生 物医药、农业、生态环境等领域发挥 更大的作用。
生物制药与疫苗生产
总结词
转基因动物技术可用于生产具有治疗和预防作用的生物药物和疫苗。
详细描述
通过转基因技术，可以在动物体内表达具有治疗和预防作用的人类蛋白质或抗原。这些蛋白质或抗原可以用于生 产药物和疫苗，为人类疾病的治疗和预防提供新的手段。
Part
04
转基因动物技术的挑战与前景
技术难题与解决方案
技术难题
解决方案
转基因动物技术的实施过程中，存在基因 定位、基因表达调控等技术难题，影响转 基因动物的准确性和稳定性。
通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统 ，可以实现精准的基因定位和调控，提高 转基因动物技术的准确性和稳定性。
技术难题
解决方案
目前转基因动物技术的效率较低，需要大 量的时间和资源进行实验和筛选。
胚胎干细胞法的优点是可以通过对胚胎干细胞的定向诱导 分化，获得具有特定功能或表型的转基因动物。此外，胚 胎干细胞法还可以用于构建转基因动物的遗传模型，为疾 病研究和药物筛选提供有用的工具。
基因打靶技术
基因打靶技术是一种利用同源重组原理，将外源DNA定点整合到受体细胞基因组 特定位点的技术。在转基因动物技术中，基因打靶技术主要用于实现特定基因的 敲除、敲入或修饰。
展望
未来转基因动物技术将与其他生物技 术、信息技术等领域交叉融合，形成 新的技术体系和应用领域，推动生物 技术的创新发展。
《分子生物学》复习指南
《分子生物学》复习指南《分子生物学》复习指南答案一、名解1、基因：是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和多肽链。
(课件)2、分子伴侣(Molecular Chaperone)：又称为伴侣蛋白，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，在细胞内协助其它多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解，在功能完成后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。
3、RFLP：即限制性片段长度多态性。
高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易由于突变产生或失去一个酶切位点，因而可以造成限制性片段长度多态性。
即用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA时，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产生长度不同的DNA片段，这种方法称为限制性片段长度多态性，简称RFLP技术。
4、DNA的复制（replication）：以构成基因组的全套核酸分子为模板，精确合成一套新的核酸分子的过程。
遗传信息通过亲代DNA 分子的复制传递给子代，在保持生物物种遗传的稳定性方面起着重要的作用。
5、反转录：又称逆转录（reverse transcription），是以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成双链DNA的反应。
6、克隆载体：可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。
该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。
7、功能基因组：细胞内所有具有生物学功能的基因。
表达一定功能的全部基因所组成的DNA序列，包括编码基因和调控基因。
8、核不均一RNA：即hnRNA,即前体mRNA，在真核生物中，最初转录生成的RNA,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。
由外显子和内显子组成，需经过剪接加工及各种修饰后，形成成熟的mRNA。
9、分子杂交：由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的过程。
基因打靶技术
基因靶位操作技术还为人类遗传疾病的基因治 疗提供了有力手段。所谓基因治疗 基因治疗，即通过对缺陷 基因治疗 基因的修复，使病灶细胞重新获得正常功能。靶位 操作技术对缺陷基因结构进行精确改正，与功能弥 补性基因治疗不同，修复后的细胞表达正常蛋白， 不表达错误产物，因此它是一种理想的基因治疗策 略。
4 转基因动植物和生物反应器方面 转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动 转基因技术 植物体内，使外源基因与动植物本身的基因整合在 一起，实现体内表达，从而培养出转基因动植物的 技术。基因靶位操作技术的出现，使转基因动植物 和生物反应器研制更为精确。如果应用基因打靶技 术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中，定 点改造原有基因的功能，使转基因动植物和生物反 应器的研制更为精确。
3 在病理模型和基因治疗方面 目前，越来越多的人类疾病被证实是由基因 缺陷所致，人类疾病的动物模型对病理学研究和 临床治疗都非常重要。自发或诱变病理模型需要 漫长的时间；应用转基因技术，外源基因在基因 组中的随机整合可能带来不确定的表型。而基因 靶位操作技术在很大程度上克服了上述局限，它 通过胚胎干细胞的体外转染、筛选和胚胎嵌合体 途径，获得含特定突变基因的模型小鼠，得到多 种病理模型。
基因打靶技术的原理
进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要 导入靶细胞的靶载体。该载体不仅含有需要插入 的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列 相同的核苷酸片段，即同源重组指导序列 同源重组指导序列。将此 同源重组指导序列 载体导入靶细胞，通过外源载体和内源靶位点相 同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定 点整合到靶细胞的特定的基因座上。因此，同源 重组是基因打靶技术的分子生物学基础。
图2：正负选择载体的筛选原理
染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区； 之间斜线部分为同源区； Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体 正负选择 ； ； A、B：染色体上的两个基因 、 ： E：外源基因； ：外源基因；
基因打靶技术
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起来的。对 于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组整合到基因组内， 随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应
用于哺乳动物细胞，并得到进一步的发展和改进。
80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，
基因打靶的基本环节
4 检测：
观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为模 板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方法 来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究 (2) 建立人类疾病的动物模型 (3) 用于疾病的基因治疗 (4) 用于改造生物和培育新的生物品种
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究
后基因组时代主要任务就是研究大量新基因的功能。用体细胞 基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因，有可能在细胞水平 上研究某一基因的功能及调控机制；从定点突变的干细胞获得基因突 变型个体，可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用。 另外，胚胎发育是非常复杂的生命现象，在这一过程中包含着许多生 理、生化的复杂变化，尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的 影响，用传统的研究方法很难进行观察研究。基因打靶为这一领域的 研究提供了理想的方法
变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是 同源重组效率的关键因素，基因打靶载体的同源重组序目标的DNA 序列进行扩增得到。
7 8 neo 8
6
78
基因打靶技术
同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法
建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础
之上的基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段
基因打靶原理
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术 的发展，促进了基因打靶的广泛应用。 同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组 的相应片段发生交换（即重组）。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状 态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
杀死细胞
随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死， 无整合的将被G418杀死。
用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk
基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。
2018/10/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
基因打靶的筛选
3.基因打靶的筛选方法
基因打靶的主要步骤
2、外源DNA导人的方式
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法 等。目前应用最广的是显微注射法。 显微注射每次只能注射一个细胞； 电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES 细胞稳定转染； 逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性 基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
4.基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) “标记和置换”法 (Tag and Exchange) • 条件性基因打靶
分子生物学考试重点
分子生物学考试重点分子生物学考试宝典名词解释1. 基因：是编码RNA或一条多肽链的DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列插入序列。
2. 基因组：细胞或生物体内一套完整单倍体的遗传物质的总和。
3. 结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列，包括模板链和编码链。
4. 基因表达：生物基因组中的结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等过程合成特定蛋白质，进而发挥特定生物学功能和生物学效应的全过程。
5. 开放阅读框（ORF）：在mRNA的核苷酸序列中，包含特定蛋白质多肽链信息的序列，从起始密码子开始到终止密码结束，决定了蛋白质的一级结构，该段序列称为开放阅读框或蛋白质编码区。
6. 非编码区（UTR）：是位于开放阅读框的5’端上游和3’端下游的没有编码功能的核苷酸序列。
其主要功能是参与翻译起始调控，是翻译的必需序列。
7. 卫星DNA:是出现在非编码区的串联重复序列，其特点是具有固定的重复单位，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。
包括，大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。
8. 微卫星DNA：又称为短串联重复（STR），是一类更为简单的寡核苷酸串联重复序列，其重复单位为2～6bp，重复次数10～60次左右，其总长度通常小于150bp，分布在所有的染色体。
微卫星DNA 因为重复单位的重复次数不同而具有高度的遗传多态性，并且按照孟德尔遗传规律，可以作为很好的遗传标记。
9. 动态突变：微卫星序列的串联重复的拷贝数可发生改变，并可随世代的传递而扩大，称为动态突变。
可与一些遗传病和肿瘤发生有关。
10. 反向重复序列：是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。
两个反向序列间可以有间隔序列，也可以串联在一起（回文结构）。
反向重复序列常见于基因的调控区内，可能与复制、转录的调控有关。
11.限制性片段长度多态性（RFLP）：指用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，由于高度重复序列和点突变的存在，会得到长度、数量各不相同的限制性片段类型。
基因打靶
基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。
原理首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。
目前，在ES细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。
通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种(相关数据库参见文献)，并正以每年数百种的速度增加。
通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。
特点基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。
基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器等。
gene knock-out将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。
去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。
MSTN打靶猪的安全性分析
Vol.372No.12DEC.2020农业技术与装备AGRICULTURAL TECHNOLOGY &EQUIPMENT MSTN 打靶猪的安全性分析李诚瑜，刘昭君，申明，李荣阳，陶景丽，吴望军，刘红林（南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095）摘要在提高物质生活的同时，人们越来越注重健康问题，转基因动物的安全性成为热点话题。
肌肉发育是家畜育种过程中重要经济性状之一，肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN ）是一种抑制骨骼肌生长发育的转录生长因子，被认为是提高畜牧业瘦肉生产的重要基因。
研究表明，MSTN 基因的敲除有助于提高动物的肌肉发育。
文章重点讨论了利用基因编辑技术获得的MSTN 基因敲除猪的安全性。
关键词MSTN；基因编辑技术；MSTN 打靶猪的安全性中图分类号S828文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.1673-887X.2020.12.0661MSTN 基因简介Myostatin （MSTN ）基因，中文名为肌肉生长抑制素基因，是转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成员之一，是一种抑制肌肉生长发育的负调控因子[1]。
在胚胎发育阶段，MSTN 在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，对肌纤维的数量起着非常重要的调控作用。
在成年动物体内，MSTN 在骨骼肌中特异表达，能有效控制肌纤维的生长[2,3]。
而大量的研究发现，MSTN 基因敲除和自然纯合突变的小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌肥大的现象[4-7]。
因此，MSTN 是一个在多物种中影响肌肉生长发育的重要功能基因。
2动物遗传修饰的概念与理解动物遗传修饰（Genetic Modification）是指人为改变动物的基因组（遗传物质），主要包括转基因与基因敲除。
转基因动物（Transgenic Animal ）是指利用实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内，外源基因能在动物体内表达并稳定遗传给后代的一类动物[8]。
CRISPRCas9技术在作物中的研究及应用进展
作物研究(CROPRESEARCH)2020,34(6)588-596 CRISPR/Cu9技术在作物中的研究及应用进展罗银，刘峰*(湖南大学研究生院隆平分院/湖南省蔬菜研究所，长沙010125)摘要:基因组编辑技术可在基因组水平上精准而高效地修饰植物的DNA序列，其通过使用序列特异核酸酶在靶位点产生DNA双链断裂，激活细胞内两种DNA损伤修复途径:非同源末端连接及同源重组,从而实现精确的基因组编辑，其中CRISPR/Cas9技术在各种动植物、微生物中得到了广泛地应用。
从CRISPRCas系统的基本概况、优化及其在作物中的应用等方面进行详细地阐述，并对其在未来需要改善的地方进行了探讨和展望。
关键词:作物;基因组编辑;CRISPRCas9技术中图分类号：S330；Q943.2文献标识码:A文章编号：1001-5280(2020)06558859DOI：10.06848/kO issn.1001-5280.2020.06.02Research and Application Pragrass of CRISPR/Cas9in CrapsLUO Yin,LIS Feng*(Lonapina Branch,Graduate Schovi ol Hunan University/Hunan Vegetable Research Institute,Chanasha,Hunan014125,China)AbstracS:Genome edibny can precisely and efficiently moPip plant DNA sequence sat the genomic level,and b can activate two kinds ol DNA dama/c regaiz pathways:4on homologous end joinina and homologous recombination to regaiz DNA dama/c by usina sequence-specific nuclease to generate DNA UopUle strand breads at the target site,so as to achieve accurate genome edibny.At present,CRISPIVCash had been widely used in various animals,plants and miemorganisms.Wo summarized the basic situation,optimization ol CRISPR/Cas9and its applicaVons in crops,as weli as chaVexaes and future nmpeoermrdh2Keywords:crops, genome editina；CRISPRCas9随着时代的发展，DNA测序技术(DNA$19X0 nng)正不断进步与完善，水稻、玉米、番茄等多种作物已完成基因组测序［£。
基因编辑技术的概念和原理
基因编辑原理
非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修 复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生 碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失 活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基 因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂 DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。
基因编辑原理
同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修 复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情 况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过 程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插 入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB， 在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因 的替换。
1. 基因功能研究
2009 年， 威斯康辛医学院、 Sangamo Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家机构使用 ZFN 技术，成功培育出首只靶基因敲除的大 鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同 样带有该基因突变。
2. 基因治疗
传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细 胞中替代有缺陷的基因， 但这种方法难以精 准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编 辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正 或进行基因切除， 达到基因治疗的目的。
基因编辑的研究背景
现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经 济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关 系，从而快捷可靠地对动物后代进行筛选。但是， 利用分子标记技术辅助筛选，改良的程度依然受限 于品种自身已有的基因。 所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破 种源的限制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此 分子育种更为本质和直接。
4. 改造和培育新品种
传统的改造动植物品种的转基因技术是将外 源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因 功能，使其表达优良的性状，获得人类需要 的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰， 达到高效定向。
基因工程考试
基因工程考试复习名词解释1. 基因工程是指将一种或多种生物体(供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体(受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.2. 质粒：一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。
3. PCR技术：是一种通过模拟体内DNA的复制方式，在体外两种分别与基因两端不同DNA 链互补的特异引物，经聚合酶酶促作用下选择性地将DNA某个特殊区域快速扩增出来的技术4. 不对称PCR：用不等量的一对引物（非限制性引物与限制性引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA。
5. 反向PCR：一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法，根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来注：一种用于指数式扩增位于一个已知DNA区段的PCR法6.巣式PCR :方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对引物产生扩曾产物，然后用一对内引物对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增，用于DNA及RNA病毒的检测。
7. 基因定点诱变:是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
（体外特异性改变某个碱基的技术）8. 盒式诱变:是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列获得数量众多的突变体。
9.探针:一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列，只有同特异性目标产生很强的相互作用和对其相互作用的产物进行有效检测的分子10.放射自显影: 利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，用显影液显示这种潜影，成为可见的“像”。
11.限制性内切核酸酶：识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶12. 星号活性：某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶，在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切微位点而得到不同的酶切片段，这种酶活性则称星号活性。
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定向调控精准打靶
定向调控更加注重对症下药，更加注重区别对待，更加注重标本兼治。
适时适量“精准滴灌”中国经济，已成为上半年宏观调控的突出亮点巴西世界杯激战正酣。
上半年，对中国经济而言，也是个令人紧张的“上半场”：经济下行压力加大，实体经济困难增多，市场预期不稳。
但中国经济表现还是相当不俗，企稳向好的积极迹象进一步显现：5月份外贸增速转正，6月份PMI指标（制造业采购经理指数）连续四个月回升，达到51%……
中国经济“有惊无险”，与宏观调控方式的创新密不可分。
上半年，宏观调控告别“经济一多云就要强刺激”的思维定势，保持定力，主动作为，更加注重瞄准经济运行中的突出问题确定“靶点”，定向调控，精准发力。
把脉步入“新常态”的中国经济，增速回落的主导因素不是传统的需求不足，而是潜在增长率下降；矛盾问题的主要方面不是整体性的问题，而是结构性的问题。
如此形势下，再用“大水漫灌”式调控，精准度不够，成效自然打折，对房价过高等结构性问题不仅没有疗效甚至会起反效。
“大水漫灌”出水量大、速度快，刺激性强，副作用也不小，今天的“垫脚石”很可能会成为明天的“绊脚石”。
而定向调控，更加注重对症下药，更加注重区别对待，更加注重标本兼治。
适时适量“精准滴灌”中国经济，已成为上半年宏观调控的突出亮点。
定向调控瞄准改革“靶点”，向深化改革要动力。
6月份行政审批制度改革继续用权力的“减法”，换取经济活力的“加法”甚至“乘法”效应。
6月4日召开的国务院常务会议，又确定取消和下放新一批共52项行政审批事项，并将36项工商登记前置审批事项改为后置审批。
简政放权“先手棋”成效明显，但要更好地增强经济活力，仍需按问题导向原则进一步深化改革。
定向调控直击结构“靶点”，向结构调整要动力。
经历了总量扩张的持续繁荣，结构失衡问题日益成为影响经济可持续发展的顽疾，其中重投资、轻消费，重工业、轻服务业积重待改，“三农”、水利、铁路、物流等短板明显。
一系列调结构措施陆续出台。
6月11日通过的《物流业发展中长期规划》，剑指提高经济整体运行效率和效益。
14条铁路集中开工，中西部地区成为“主工地”。
支农支小，货币政策继续定向宽松。
6月16日起，符合审慎经营要求且“三农”和小微企业贷款达到一定比例的商业银行下调存准率0.5个百分点。
6月30日，银监会调整存贷比计算口径，将支农支小、“三农”和小微的政策性贷款排除出分子，有利于降低其融资成本，助力经济转型。
定向调控聚焦民生“靶点”，向惠民生要动力。
扶持小微企业发展，能为促就业提供有力支持；加大保障房建设和城市地下管网等基础设施建设，在改善居住环境的同时能拉动投资促进消费。
一件件民
生实事，让百姓更加认可经济发展成绩单，也为稳增长提供了源源动力。
世界杯半决赛马上开踢，今年中国经济的“下半场”也已鸣哨。
定向调控要发挥更好效用，下半年还需在精准、及时、适度上多下功夫，让“政策活水”适时适量“精准滴灌”中国经济，助其提质增效，行稳致远。
（顾仲阳）。