应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇基因型的研究

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用反向斑点杂交法检测结核杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性

［ｓｒｃ］０ｂｅｔｅＴｏｄｖｌｐａｎｗｅｅｓｏｌｔａｐｏｃｏａｉｅｅｔｎｏｐＬＡｂｔａｔｊｃｉｖｅｅｏｅｒｖｒｅｄｔｂｏｐｒａｈｆｒｒｐｄｄｔｃｉｆｒｓｏ
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应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析

Ｍｅｈｏ０Ｍｔ．ｒｍｐｉｉｄｔｅｄｕｅｉｔｎｅｇｎｆｐＢ，ａＧ，ｓ，ｒ，ｍｂｂＣＲ，ｎｈｎｈｂｉｉｅｔｔｄｓ５ｂｗｅｅａｌｅｈｒｇｒｓｓａｃｅｅｏｏｋｔｒＬ．ｓｅＢｙＰｆｒｐｒａｄｔｅｙｒｄｚｄｗｉｈｏｉｏｕｌ０ｉｅｐｏｅｎｍｅｒｎ，ｙｄｂｌａｉｅｐｏｐａａｅａｄＢＩＰ／ＴｓｓｅＡｔｈａｉ，ｏｔａｔｄｗｉｈｌｎｃｅｔｄｒｂｓｏｍｂａｅｄｅｙａｋｌｎｈｓｈｔｓｎＣＮＢｙｔｍ．ｅｓｍｅｔｇｔｍｅｃｎｒｓｅｔｔｅｔａｉｉｎｌｄｕｅｓｔｅｔｓ．ｈｒｄｔｏａｒｇｓｎｉｉｅｔＲｅｕｌｓ５ｂｉｏａｅｗｅｅｐｒｏｍｅｈｅｔｆｏＲＦ－ｅｉｔｎｂｄｔｃｅ：ｆｖｓｔ０Ｍｔ．ｌｔｒｅｆｒｄｔｅｔｓｒｍＰｒｓｓａｔＭｔ．ｅｅｔｄ４ｏｓＩＮＨ— ｅｉｔｎｌｎｃｌｉｏａｅ５ｗｒｅｔｄｏＭ— ｅｉｔｎｌｉａｓｌｔ，ｅｅｔｓｅ，ｂｓｏｄＳｒｓｓａｔｉｉａｓｌｔ，ｅｅｔｓｅ；ｆｃＳｒｓｓａｔｃｉｃｌｏａｅ７ｗｒｅｔｄ１Ｍｔ．ｈｗｅＭ— ｅｉｔｎｎａｌｆｎｉｒｓｓａｔｌｏｉ
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应用聚合酶反应-反向斑点杂交法检测利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

本研究应用聚合酶链反应一反向斑点杂交法采集广西龙谭医院２株结核分支杆菌进行药敏测定，果８结对利福平耐药的标准浓度为大于５￣／ｌ０ｇｍ。结核菌传统药敏试验：８２株分离株中，株为敏感株，２对ＲＰ６２株Ｆ抗结核药物耐药。应用反向斑点杂交结果：２２株结核分支杆菌ｒｏ因的ＰＲ扩增产物进行了检测结果表ｐＢ基Ｃ
儿ＨｐｅＢ及时接种率。但在住院分娩率不高的情况下，提高在家出生新生儿Ｈｐ。ｅＢ及时接种率就成为提高新生儿Ｈｐ时接种率的重点。由于在家出ｅＢ及
生新生儿的接生员不一定都具备预防接种资格，因
县免疫规划工作人员为卫生部／联合国儿童基金会加强常规
明，ｏ基因突变率为７．３１２）其中５１５６５６ｒＢｐ２７％（６２，／３、２和１位密码子突变率分别为３．％（／６、５４７５６１）２％（／１）３．％（／６。６和７５６１）双位点突变率为１．％（／６。２５２１）本文应用ＰＲ一向斑点杂交法操作简便，Ｃ反可以快速准确地判定结核分支杆菌对利福平的药敏结果，有利于提高诊疗效率，降低治疗费用。
ｕｅ２０，５４：９ｌ，０７２（）１．ｎ
［】周玉清，５达
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峰，．等西藏自治区儿童免疫规划
５疫苗免疫覆盖率及儿童监护人预防接种知识、度、种态行为的调查【］中国疫苗和免疫，０８４４：４ — Ｊ．２０，１（）３２

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。

方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。

以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。

结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。

NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。

11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。

结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。

[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

ａｎｄｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｌｕｆｉｄｗｅｒｅ：ａｃｉｄ－ｆａｓｔｓｔａｉｎｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ３２．８％．ＲＴ－ＰＣＲｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ８２．８％．ＲＤＢ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｖｅｓｅｒｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｉｒｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｒｅａｌ — — ｔｉｍｅＰＣＲ；Ａｃｉｄ — — ｆａｓｔｓｔａｉｎ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｐａｔｈｏ－－
ｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅ；ｅｖｌｕａａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＲＤＢｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（９０．６％），Ｙｏｕｄｅｎｉｎｄｅｘ（０．９１），ｔｈｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅ（９３．９％），ａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖｌａｕｅ（８５．０％）ｗｅｒｅｇｏｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄｏｔｂｌｏｔ

应用反向线性杂交技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

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焦伟伟李圣Ｉｏｋｏｓｖ，，，ｇｒＭｏｒｕｏ孙桂芝。刘佳文。ＯｌａＮｒｓａａ，，，ｇａｖｋｙ申阿东
（．首都医科大学附属北京儿童医院，京１０４；．俄罗斯圣彼得堡巴斯德研究所，彼得堡１７０；１北００５２圣９１１
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维普资讯
ＬｂｌｄＩａｅｅｍｍｕｏｓａｓ＆ＣｌｄｎａｓｙｉＭｅ，Ｍａ．２０，Ｖｏ．４Ｎｏ反向线性杂交技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种

ｌቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｔｓｔｐｃｅｅｅ．ａｅｏｓｅｉｓｌｖ１
［ｙｗｒｓＭｙｏａｔｒｍ；ｐｃｅｄｎｉｃｔｎＰｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｎＲｖｒｅｄｔｌｔｙｒｉｔｎａｓｙＫｅｏｄ］ｃｂｃｅｉｕＳｅｉｉｅｔａｉ；ｏｓｉｆｏｙｒｓｈｉｃｉ；ｅｅｓｏｂｏｈｂｄｚｉｓａｅｏｉａｏ
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论：Ｃ — ＤＢＡ能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平，ＰＲＲＨ方法简便、快速，结果准确，具有良好的临床应用价值。
【键词】枝杆菌；种鉴定；合酶链反应；向斑点杂交关分菌聚反【图分类号】Ｒ７．１中３８９ｆ献标识码】Ａ文【章编号１６３７１２１）３ｃ一３ — ２文１７－２０（０００（）０５０
ＰＣＲ－ｒｖｒｅｄｏｌｔｈｂｒｄｚｔｏｓａｏａｄｄｎｔｆｃｔｏｆｙｏａ－ｅｅｓｔｂｏｙｉｉａｉｎａｓｙｆｒｒｐｉｉｅｉａｉｎｏｃｂｃｉＭ

应用反向斑点杂交技术快速鉴定脊柱结核分枝杆菌菌种

【ｂｔａｔＯｂｅｔｅｏｖｌａｅｐｌａｏａｅｆｅｅｓｏｂｔｙｒｉｔｎｉｔｅａｉｅｔｃｔｎｆｙｏａｔｉＡｓｃｒ］ｊｃｖＴａｔｔｐｃｔｎｖｕｖｒｅｔｌｂｄａｏｐｉｎｆａｏｅｂｃｒｉｅｕｅｈａｉｉｌｏｒｄｏｈｉｚｉｎｈｒｄｄｉｉｏＭｉｅ－
ｂｉｉｅｉｌｏｕｌｏｉｅｐｏｅ．ｓｌＯ７ｓｉａｂｒｕｏｓｓｃｉｉａｓｌｔｓ３ｒｅｂｃｅｉｍｂｒｕｏｉｏｌｘｒｄｚｄｗｆｏｉｎｅｅｔｒｂｓＲｅｕｔｈｇｄｓｆ３ｐｎｔｅｃｌｕｉｌｃｌｏａｅ．６ｗｅｅＭｙｏａｔｒｌｕｎｉｕｔｅｅｌｓｃｍｐｅｕｓ
中，１ＳｒＮＣ — ＳＰ初步鉴定，６经６ＡＰＲＳＣＤ３株为结核分枝杆菌复合群，株为非结核分枝杆菌；１经杂交分析，４株结核分枝杆菌分３
离株鉴定为结核分枝杆菌复合群，株鉴定为偶发分枝杆菌，分别与相应的特异探针杂交，１２株与分析探针杂交阴性。结论
ＬＡＮＧＪａ — ｉ，ＵＸｕ — ｉｎ，ＩｉｎｑｎＷｅｑｏｇＺＨＡＮＧＸｉ￣ｎ，ＡＮＪｎｈ，－ｇＷＧｉ— ｅＣＨＥＮＺｉＦｈ，ＥＮＧＳｉｓｅｇｈ— ｈｎ
ＰＡＴｂｒｕｏｉＲｓａｃｓｔｅ３９ＨｓｉｌｆＬＢｉｎ００１ＣｉａＬｕｅｃｌｓｅｅｒｈｎｔｕ，０ｏｐｔＡ。ｅｉｇ１０９，ｈｎｓＩｉｔａｏＰｊ

反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用林炳生张太松510080 广州中山大学达安基因诊断中心【摘要】反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。

该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值。

【关键词】反向斑点杂交；基因诊断Reverse dot blot method and its use in gene diagnosis LIN Bingsheng, ZHANG Taisong. Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,Guangzhou , 510080 China,【Abstract】The reverse dot blot(RDB) method, by using biotine labeled primers, amplify the target nucleic acid and hybridize with the probes covalently bound to the nylon membrane. It can identify several kinds of target sequence in a single assay with reliability and specificity. RDB assay was widely applied to the pathogen identification, gene point mutation assay, genetic polymorphism detection, and provides a promising tool for clinical nucleic acid analysis.【Key words】reverse dot blot(RDB)；gene diagnosis反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分子机制和其耐药基因检测方法的研究

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分子机制及其耐药基因检测方法的研究摘要ｆ≮箩１，《目的：为ｌ阐呀结核分支杆菌耐乙胺丁醇（ＥＭＢ）的分子机制，了角姑核分支杆菌耐ＥＭＢ分离株ｅｍｂＢ基因突变情况，ｚＯｔ：瓠ｍｂＢ基酉突变与ＥＭＢ最小抑菌浓度（ＭＩＣｓ）之间的关系；探番累合酶链反应．单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析技术检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇的应用价值，建立快速、有效的结核分支杆菌药物敏感性试验方法。

３ｆ方法：临床标本进行传统分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验；对耐药结核分支杆菌分离株进行ＥＭＢ最低抑菌浓度（ＭＩＣｓ）测定，ＥＭＢ浓度如下：０、５、１０、２０、３０、５０ｕｇ／ｍｌ；通过１６Ｓ“ⅢＡＰＣＲ．ＳＳＣＰ分析方法对１６０株临床分离株进行分支杆菌初步分子菌种鉴定；通过ＰＣＲ．ＳＳＣＰ、ＰＣＲ．限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ．直接测序（ＤＳ）技术分析结核分支杆菌临床分离株ｅｍｂＢ基因。

结果：１６０株分离株经ＰＣＲ．ＳＳＣＰ初步分子菌种鉴定，５株为非结核分支杆菌，１５５株为结核分支杆菌复合群．对１５５株结核分支杆菌进行了传统药物敏感性试验，３８株为ＥＭＢ敏感株，１１７株为耐ＥＭＢ菌株。

用引物Ｅ４和Ｅ５及Ｅ６和Ｅ７分别扩增６８株结核分支杆菌耐ＥＭＢ分离株和３８株ＥＭＢ敏感株ｅｍｂＢ基因，产生３６５ｂｐ和２５８ｂｐ片段。

引物Ｅ４和Ｅ５扩增ｅｍｂＢ基因３６５ｂｐ片段的敏感性为１０ｐｇ；引物Ｅ６和Ｅ７扩增ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ片段的敏感性为１００ｆｇ。

对２２株分支杆菌及８株非分支杆菌标准株ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ片段进行扩增，结果显示引物Ｅ６和Ｅ７是分支杆菌属特异的。

以结核分支杆菌标准菌株Ｈ，，Ｒｖ做对照，１０６株结核分支杆菌临床分离株ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ扩增片段经限制性内切酶ＨａｅｌＬＩ酶切后，进行１５％聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），结果显示：３８株ＥＭＢ敏感株和６０株耐ＥＭＢ菌株的ＰＣＲ．限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱与结核分支杆菌标准株相同，余８株耐ＥＭＢ菌株ＲＦＬＰ图谱与结核分支杆菌标准株有明显差异。

结核分支杆菌耐药基因的杂交检测

结核分支杆菌耐药基因的杂交检测【摘要】目的采用PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变。

评价该方法检测结核分支杆菌利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链霉素耐药性，探讨直接检测结核患者痰标本的可行性。

方法用PCR-反向斑点杂交技术分析对75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测。

结果临床耐药株分离株进行rpoB、rpsL 和KatG基因突变的检测，其突变率分别为83．9％、62．5％、57．1％。

肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为81．0％、60．0％、52．9％。

结论rpoB 基因、KatG基因和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关，应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性。

PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。

【关键词】结核分支杆菌；反向斑点杂交；药物耐受性近年来全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。

异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福平（RFP）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视。

传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6～8周时间，不能及时指导临床用药。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶－过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性；耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致；结核分支杆菌耐RFP与其核心区域rpoB基因突变有关[1、2]。

笔者采用采用PCR－反向斑点杂交技术分别对肺结核患者痰标本临床分离株和结核患者痰标本直接进行KatG基因、rpsL基因、rpoB基因的突变检测，现将结果报告如下。

应用膜反向斑点杂交技术检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型

应用膜反向斑点杂交技术检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型应用膜反向斑点杂交技术检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(INH)耐药性.方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH kat、inhA基因的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交.结果20株INH敏感株中,仅9例出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inhal探针杂交阳性,PCR-DS 显示inhA基因-15位C→T突变.36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示KatG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inhal探针阳性杂交,25株野生型探针inhl杂交阳性.KatG基因膜杂交突变检出率为50%,inhA基因膜杂交突变检出率为30.56%.结论膜反向斑点杂交技术可成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法.作者：梁建琴吴雪琼张俊仙李洪敏陆阳 LIANG Jian-qin WU Xue-qiong ZHANG Jun-xian LI Hong-min LU Yang 作者单位：北京解放军309医院,结核病研究室,北京,100091 刊名：中国现代医学杂志ISTIC PKU英文刊名：CHINA JOURNAL OF MODERN MEDICINE 年，卷(期)：2006 16(15) 分类号：Q789 关键词：结核分支杆菌异烟肼 KatG inhA 药物耐受性聚合酶链反应反向斑点杂交。

PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值

中国防痨杂志2021 年1月第43 卷第1期Chin J A nthuberc，Jamiai~y 2021 ,Vol. 43，No. 1• 47 ••论著•PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值刘轾彬吴敏吴小翠韩敏肖和平张青【摘要】目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。

方法收集2015 年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本，每份标本量均不少于2 ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpen MTB/RIF检测和BACTEC MGIT 960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称“药敏试验”），最终纳入357例（株）为研究对象。

以微孔板法药敏试验结果为参考标准，评价PCR-反向点杂交法的检测效能。

结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准.PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和值分别为 97. 5%(115/118)、97. l%(232/239)、94. 3%(115/122)、98. 7%(232/235)、97. 2%(347/357)和 0•937,对异烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kr//少/值分别为82.5%(113/137)、99.1% (218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和 0.841，对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和 /<«沖a 值分别为 86.5%(115A33)、99. 1%(222/224)、98, 3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和值分别为 60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和 0.682。

膜—反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

膜—反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌目的探讨膜-反向斑点杂交技术（RDB）在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。

方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象，分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR（RT-PCR）、抗酸染色三种方法检测结核杆菌，对三种方法进行方法学评价。

结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为：抗酸染色为32.8%，RT-PCR阳性率为82.8%，RDB阳性率为89.9%，两两比较差异均有统计学意义（均P 0.05），具有可比性，分别用RDB、PCR、抗酸染色三种方法检测病理石蜡组织及肺泡灌洗液结核杆菌，比较三种方法的检测情况。

1.2 诊断标准肺结核的诊断参考原卫生部制订诊断标准[3]，结合患者临床症状、X线、纤维支气管、实验室检查及抗结核治疗的有效性确诊。

1.3 方法1.3.1 抗酸染色镜检试剂由厦门迈威生物有限公司提供，肺泡灌洗液离心涂片，石腊切片脱腊水洗，石碳酸品红初染，70℃孵育30 min，0.5%盐酸酒精脱色1 min，0.5%亚甲蓝复染30 s，水洗，无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。

高倍镜检，抗酸阳性菌呈红染，微细杆状，可分布于巨噬细胞内外。

1.3.2 实时荧光PCR试剂由中山达安基因生物有限公司提供，基因扩增仪为ABI7300，样本预处理严格按试剂说明书操作，扩增条件：93℃ 2 min预变性，93℃45 s（变性）、55℃120 s（退火、延伸）为一循环，共计40循环（后30循环记录荧光信号），结果判定，CT值30为阴性。

1.3.3 膜-反向斑点杂交1.3.3.1 标本预处理采用4倍体积的4%NaOH室温下对研究标本进行液化30 min，15 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，去上清，并加1 mL生理盐水充分吹打混匀洗涤。

50 μL 20 g/L蛋白酶K消化，沸水浴10 min灭活蛋白酶K。

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民【摘要】目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分别为84.88%、87.10%和79.17%,符合率为97.33%、94.74%和88.37%.结论:膜反向斑点杂交技术是检测部分MTB耐INH、RFP和SM基因型快速、简便的方法.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】4页(P759-762)【关键词】结核分枝杆菌;药物耐受性;反向斑点杂交;聚合酶链式反应;基因【作者】罗丹;向延根;潘建华;彭雪峰;邓为之;石国民【作者单位】湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院检验科,湖南长沙410004【正文语种】中文【中图分类】R34近年来，我国的结核病发病率和耐药率均有上升趋势，尤其是耐多药结核病和非结核分枝杆菌病及艾滋病并发的结核病的疫情十分严峻，并严重损害着人们的健康。

因此，如何快速、准确地检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)对主要一线药物的耐药性，成为广大学者所关注的课题。

目前临床上检测结核药敏大部分仍延用绝对浓度法和比例法等，其耗时6～8周，结果判定有一定主观性，难以标准化。

Wu等[1]利用反向斑点杂交技术检测利福平(rifampcin,RFP)的耐药基因，准确率达到92.8%，本文作者采用此技术同时检测了RFP、异烟肼(isoniazide,INH)和链霉素(streptomycin,SM) 3种抗结核药物的相关耐药基因，并探讨反向斑点杂交技术与绝对浓度法的相关性。

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究辛茶香;熊国亮;袁小兰;张周云;彭亦平【摘要】目的：探讨PCR-反向点杂交技术（PCR-RDBHA）快速鉴定支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid BALF）标本中分枝杆菌菌种的临床应用价值。

方法对临床306例活动性肺结核患者、疑似非结核分枝杆菌感染肺病患者BALF标本采用PCR-反向点杂交技术和传统的改良罗氏培养法进行分枝杆菌菌种鉴定。

结果306例BALF标本PCR反向点杂交技术检测出分枝杆菌127例，阳性率为41.5%（127/306），其中结核分枝杆菌复合群（MTC）108例，占分枝杆菌的85.0%（108/127），非结核分枝杆菌（NTM）19例，占分枝杆菌的15.0%（19/127）。

NTM中，6例脓肿分枝杆菌，10例胞内分枝杆菌，2例戈登分枝杆菌，1例瘰疬分枝杆菌；传统的改良罗氏培养法检测出分枝杆菌101例，阳性率33.0%（101/306），经菌种的初步鉴定，其中MTC89例，占分枝杆菌的88.1%（89/101），NTM12例，占分枝杆的11.9%（12/101）。

结论 PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种，该方法简便、结果准确，具有良好的临床应用价值。

%Objective To identify Mycobacterium species in BALF rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hy-bridization assay (PCR-RDBHA). Methods 306 cases of BALF from pulmonary tuberculosis patients and nontuberculous My-cobacteria (NTM) lung diseases patients were collected,Mycobacterium species of 360 cases of BALF were simultaneously detected by PCR-RDBHA and Roche medium culture. Results The positive rates of detecting Mycobacterium by PCR-RDBHA were 41. 5%(127/306),108 cases (85.0%) were determind to be M.tuberculosis comples(MTC),19 cases were determind(15.0%) to be NTM which contained 6 cases of M. abscessus,10 cases.of M. intracellulare,2 cases of M. gordonae and 1case of M. scrofulaceum. The positive rates of detecting mycobacterium by culture were 33.0%(101/306),89 cases (88.1%) were determined to be M. tuberculosis comples (MTC),12 cases were determined (11.9%) to be NTM. Conclusion PCR reverse dot blot hybridization technique can quickly identify mycobacterium species in BALF. The method is simple and accurate,and has good clinical application value.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2016(034)004【总页数】3页(P439-441)【关键词】分枝杆菌;菌种鉴定;聚合酶链反应;反向点杂交【作者】辛茶香;熊国亮;袁小兰;张周云;彭亦平【作者单位】江西省胸科医院，江西南昌 330006;江西省胸科医院，江西南昌330006;江西省胸科医院，江西南昌 330006;江西省胸科医院，江西南昌330006;江西省胸科医院，江西南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R378.91;R446.62分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tubetculosis comples，MTC）和非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）。

利用反向点杂交膜片检测结核杆菌多耐药基因的研究

利用反向点杂交膜片检测结核杆菌多耐药基因的研究韦世录;何晓;何敏;蒙江明;王祖恩;银春莲;仇小强;张志勇【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2008(025)002【摘要】目的:探讨反向点杂交膜片试剂盒在结核杆菌耐药性检测中的作用.方法:利用5种耐药基因检测试剂盒,对20株耐药的结核杆菌临床分离菌株、5例非结核病患者痰标本进行检测,结果与传统药敏试验结果进行比较.结果:20株耐药的临床分离菌株,膜片试剂盒检测19株判为耐药,总体耐药符合率为95.0%;其中3株膜片检测的耐药种类与药敏试验耐药种类完全一致;l株检测结果与药敏结果不同;5例非结核病患者痰标本膜片检测结果为阴性.结论:反向点杂交膜片试剂盒检测5种结核杆菌的耐药基因快速、简便,但检测出的耐药种类与传统药敏的符合率较低.【总页数】3页(P202-204)【作者】韦世录;何晓;何敏;蒙江明;王祖恩;银春莲;仇小强;张志勇【作者单位】广西医科大学公共卫生学院,南宁,530021;华中科技大学MPH研究生,武汉,430074;广西医科大学医学科学实验中心,南宁,530021;南宁市第四人民医院,南宁,530023;南宁市第四人民医院,南宁,530023;南宁市第四人民医院,南宁,530023;广西医科大学公共卫生学院,南宁,530021;广西医科大学公共卫生学院,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1【相关文献】1.利用基因芯片技术快速检测结核杆菌耐药性的初步研究 [J], 张万江;鲍朗;王晓樱;张会东;谢勇恩;陈玮;于向华2.PCR-反向点杂交法在结核杆菌耐药突变基因检测中的应用 [J], 何进才;周丹;劳诗欣;李惠贞;黄涛;单万水3.PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型 [J], 刘伟;李代红;刘纯4.PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值 [J], 李晓琴;周敏;王霖;曾海燕;骆鹏举;林丽佳5.PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值 [J], 李晓琴;周敏;王霖;曾海燕;骆鹏举;林丽佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌蒋莎莉;朱德茂;周华山;罗海军;王志敢;李锋【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2013(10)31【摘要】目的探讨膜-反向斑点杂交技术(RDB)在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值.方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR (RT-PCR)、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价.结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为:抗酸染色为32.8％,RT-PCR阳性率为82.8％,RDB阳性率为89.9％,两两比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度(90.6％)、约登指数(0.91)、符合率(93.9％)、阴性预测值(85.0％)均较好.结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用.【总页数】4页(P14-17)【作者】蒋莎莉;朱德茂;周华山;罗海军;王志敢;李锋【作者单位】湖南省长沙市中心医院病理科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院病理科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院病理科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院病理科,湖南长沙410004;湖南省长沙市中心医院病理科,湖南长沙410004;浙江省杭州市红十字会医院,浙江杭州310003【正文语种】中文【中图分类】R378.911【相关文献】1.肺结核患者肺泡灌洗液中结核杆菌检测的方法学评价 [J], 蒋莎莉;朱德茂;罗海军;梁伟军;谢晋予;周华山;赵艳2.不同检测方法对肺结核患者肺泡灌洗液中结核杆菌的诊断价值 [J], 蒋莎莉;梁伟军;朱德茂;罗海军;谢晋予;刘爱凤3.支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测在菌阴肺结核中的诊断价值 [J], 余欢成;陈玲;祝国强;刘云4.肺泡灌洗液结核杆菌RNA和DNA检测在痰菌阴性肺结核诊断中的临床应用 [J], 陈皋;邬碧波;吴孟征;罗万蓉;秦春俊;刘舒舒;刘建英;刘丽5.肺泡灌洗液联合肺组织PCR方法检测结核杆菌DNA对肺结核早期诊断的意义[J], 潘云虎;季志宇;李发根;喇海芹;陈艺坛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因

单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因摘要】用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsl、rrs基因突变，可用于临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段。

【关键词】结核分支杆菌链霉素耐药 PCR-LiPA rpsL基因 rrs基因【Abstract】 PCR-LiPA might become a rapid, simple, sensitive and specific method to detect rpsl、rrs genes mutations in part of streptomycin-resistant M. tuberculosis. It could be used for clinical detection of drug-resistance as an assistant test.【Key words】 Mycobacterium tuberculosis Streptomycin Drug-resistance PCR-LiPA rpoB katG rpsl rrs embB gene.链霉素作为结核病的一线用药被广泛应用，近年来，国内外耐链霉素病例也在逐渐增高。

单链探针反向杂交试验(LiPA)技术基于探针杂交原理，设计合成一系列探针，覆盖整个待检基因的突变高发区，在严格条件下与带生物素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出有无突变及突变的大致位置。

本研究用此方法同时检测结核分支杆菌链霉素（SM）耐药相关基因，探讨单链探针反向杂交技术检测结核分支杆菌链霉素耐药性的应用价值。

1 材料与方法1.1临床菌株结核分支杆菌临床分离株50株。

2005年至2006年从深圳市四个区级慢性病防治院采集的痰标本中分离，以改良罗氏培养基纯培养，并进行药敏试验分析其耐药特性。

1.2 参考菌株结核分支杆菌标准株H37Rv（93020）、牛型分支杆菌（93006）、偶发分支杆菌（93323）、蟾分支杆菌（93325）、草分支杆菌（93318）、龟分支杆菌（93326）来源于中国医学细菌保藏中心。

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［-］。究室结核杆菌 EFG 扩增试剂盒
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探针的设计和合成：根据文献［ "］设计 8-、
基金项目：军队医学杰出中青年人才科研基金项目（#-.#"#）作者简介：梁建琴（-/00 1 ），女，河北省石家庄市人，副主任医师，博士研究生。主要从事分支杆菌菌种检定和结核分支杆菌耐药基因的研究。 23&： 405-#500667067； 859:+&： &;<=;> 3?%@ ’ A%9 收稿日期：修回日期： "##B5#05"B， "##B5--5"!
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应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇基因型的研究
梁建琴吴雪琼曹立雪李洪敏张俊仙
（解放军第三零九医院结核病研究室北京 -###/-）
摘
要：应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对乙胺丁醇（ 8CD）耐药性。设计与合成用于检测结核分
支杆菌耐 8CD 基因 !"#$ 的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（EFG）产物进行反向斑点杂交，并与 EFG5单链构象多态性（ EFG5HHFE）和 EFG5直接测序（ EFG5IH）结果比膜反向斑点杂较。对 4- 株结核分支杆菌临床分离株进行分析， B- 株 8CD 敏感株中， "0 株 !"#$ 基因的 HHFE 图谱、完全相同；其余 7 株 HHFE 图谱出现泳动变位，其中 B 株 8-= 杂交阳性，交结果与标准株（JB6GK） EFG5IH 分析为 !"#$ 基因 B#0 位密码子 (2L" L2L 突变； " 株 8-M 杂交阳性， EFG5IH 分析为 !"#$ 基因 B#0 位密码子 (2L" (2( 突变。7# 株耐 8CD 菌株中， "! 株 EFG5HHFE 图谱与标准菌株相同， 8- 杂交阳性； "0 株 EFG5HHFE 图谱出现泳动变位，其中 -4 株 8-= 杂交阳性，未发现 8-N 杂交阳性，与 EFG5 " 株 8-A 杂交阳性， 7 株 8-M 杂交阳性， - 株 8-3 杂交阳性， EFG5IH 分析结果一致。突变检出率为 7"O 。膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌乙胺丁醇 HHFE、耐药基因型简便、快速的方法。关键词：结核分支杆菌，乙胺丁醇，!"#$ 基因，药物耐受性，膜反向斑点杂交中图分类号： P64/ 文献标识码： ( 文章编号 ###-50"#/ （"##!） #"5#"-75#7
性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，与结核分支杆菌 :(5;< 图谱相同的为结核分支杆菌，不同的分离株为非结核分支杆菌。未标记的 !"#$ 基因的 =.; ! " # " ’ =.;>11.= 分析：扩增产物 T@ （/Q C "）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察结果并照相。与结核分支杆菌标准菌株图谱相同的为野生型，出现泳动变位的为突变型。部分经 =.;>11.= 和膜杂交分 ! " # " ( =.;>A1 分析：析为 !"#$ 基因突变的临床分离株进一步由上海生工生物工程技术服务有限公司进行 AJ+ 测序证实。
U3M? " ,9& PKHN3KF H&IVFN E’ 3%&4N3’3$KN&% %&’(#)’*!+,-" IP&$3&I #W "*1 H;J+ =.;>11.= +， R， A， !， U? %&’(#)’*!+,-" *-#!+’-.(/,/ $F343$KF 3IEFKN&I； .? %&’(#)’*!+,-" *-#!+’-.(/,/ INK4%KH% INHK34 :(5;<； :， S ? JE4>NV#&H$VFEVI %&’(#)’*!+," $F343$KF 3IEFKN&I?
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材料和方法
材料
4! 株分支杆菌临床分离株来自解放军 B#/ 医均为院结核病研究中心临床实验室。耐药菌株（ G）包括耐 8CD 的耐多药分离株；敏感菌株（ H）为不耐 8CD 的临床分离株。标准菌株 JB6GK 由中国药品生物制品鉴定所提供。硝酸纤维膜购自基因有限公司，孔径为 # ’ " 9。 ! !"# 方法采用解放军第 B#/ ! " # " ! 结核分支杆菌 I,( 提取：［-］医院结核病研究室分支杆菌 I,( 提取方法。合成和标记：引物由上海生工 ! "# " # 引物的设计、生物工程技术服务有限公司合成、纯化。引物 80 7T 端用生物素标记。引物 80 和 86 可扩增结核分支杆菌 !"#$ 基因，产生 "74=) 片段；引物 -0H- 和 -0H" 可扩增分支杆菌 -0H *G,( "6"=) 片段。采用解放军第 B#/ 医院结核病研 ! " # " $ EFG 扩增：
图# 结核分支杆菌 !"#$ 基因 /0,)**0/ 分析结果
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