实时荧光定量PCR技术2014
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用
实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种精确、快速的检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
本文将讨论实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用，并介绍其原理和优势。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术基于传统的PCR原理，通过不断复制并扩增DNA片段，然后采用荧光信号检测系统实时监测PCR过程中的DNA合成数量。
在PCR过程中，引物与靶DNA片段结合并引发DNA合成，同时荧光探针与靶DNA片段结合释放出荧光信号。
荧光信号量与靶DNA的初始数量成正比，通过实时监测荧光信号的强度，可以实时定量测量靶DNA的含量。
二、实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用1. 快速检测细菌的存在：实时荧光定量PCR技术可以在较短的时间内检测出细菌的存在与数量。
传统的培养方法需要一定的时间来培养细菌，而实时PCR技术几乎可以立即提供结果，帮助及时采取相应的措施。
2. 检测细菌的耐药性：实时荧光定量PCR技术可以检测出细菌对抗生素的耐药性。
通过检测细菌的特定基因或突变，可以判断其对不同抗生素的敏感性，为合理使用抗生素提供指导。
3. 检测细菌的毒力：实时荧光定量PCR技术可以检测细菌的毒力相关基因，帮助研究人员判断细菌的致病能力。
4. 监测细菌感染动态：由于实时PCR技术具有快速、准确等优势，可以用于监测细菌感染的动态变化。
在临床诊断中，可以通过实时PCR技术监测患者体内细菌的数量变化，从而评估治疗效果。
三、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR技术可以检测到非常低浓度的细菌。
在样品中只存在几个细菌时，也能够准确检测出来。
2. 高特异性：实时荧光定量PCR技术通过特异性引物和探针的设计，可确保只扩增目标细菌的DNA片段，并排除其他DNA的干扰。
3. 高准确性：实时PCR技术通过实时监测PCR过程中的荧光信号，可以快速、准确地确定细菌的存在与数量。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
一、实时荧光定量PCR技术原理及方法
实时荧光定量PCR技术是一种结合了PCR和荧光信号检测的新型分析技术。
其原理是通过引入一种荧光探针或染料，使PCR反应进行过程中产生的DNA片段或RNA片段能够发出荧光信号，从而实现对PCR产物的实时监测和定量分析。
在实时PCR过程中，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过测定荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR技术的方法包括SYBR Green I法和探针法两种。
SYBR Green I法是利用SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光的特性，实现对PCR产物的定量分析。
探针法则是引入一种特定的探针分子，当探针与PCR产物结合时，荧光信号会产生变化，从而进行定量分析。
两种方法各有优缺点，研究者可根据具体实验需求选择合适的方法进行实时PCR分析。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中具有重要的应用价值。
它可以用于病原体检测，如病毒、细菌等的快速定量分析。
通过设计特异性的引物和探针，可以实现对病原体的快速检测和定量分析，为临床诊断提供重要的依据。
实时荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的检测，如常见的遗传病突变、肿瘤基因突变等。
通过对基因突变的定量分析，可以为临床诊断和治疗提供重要的信息。
实时荧光定量PCR技术还可以用于药物代谢酶基因的表达分析，从而指导个体化药物治疗。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用前景，有望成为未来医学诊断的重要手段。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介
实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。
现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。
一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。
游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。
利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。
然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。
二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。
此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。
荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。
在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。
每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。
使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种可以在PCR反应过程中实时监测DNA扩增的方法。
其技术原理基于PCR反应中的DNA扩增和荧光探针的结合。
实时荧光定量PCR主要包括以下步骤：
首先，将待扩增的DNA模板，引物和荧光探针混合在一起。
荧光探针由一个与待扩增的DNA序列相互补的引物和一个带有荧光染料和一个抑制退火的小分子的探针组成。
接着，将混合物加入到特定设计的PCR反应体系中，其中包括缓冲液、DNA聚合酶以及其他所需的试剂。
PCR反应开始后，通过热循环过程，将DNA模板的两条链分离，并进行DNA扩增。
在PCR反应过程中，荧光探针与DNA扩增产物结合，当探针结合到合适的位置上时，荧光探针的荧光染料会释放出荧光信号。
PCR反应体系中含有一个光学系统，可以实时监测PCR反应进行过程中的荧光强度变化。
光学系统通常由一个光源、一个荧光探测器和一个数据处理单元组成。
实时荧光定量PCR中的数据处理单元会收集、分析和解释荧光强度变化的数据，根据扩增产物的荧光信号强度，可以推断
出反应体系中的扩增产物的绝对或相对数量。
通过定量PCR技术，可以对DNA进行定量分析，确定起始模板的数量。
实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、拷贝数变异检测等领域得到广泛应用。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。
它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。
该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。
在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。
当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。
SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。
由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。
在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。
标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。
然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。
总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
简述实时荧光定量pcr技术基本原理
简述实时荧光定量pcr技术基本原理实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于检测和定量DNA分子的方法。
其基本原理可以分为以下几个步骤：1. DNA模板准备：从样品中提取目标DNA并纯化。
2. 反应混合物制备：将目标DNA模板与一对引物（Primer）和一种DNA聚合酶（如Taq聚合酶）一同混合。
引物是特异性的DNA片段，用于引导DNA合成的起始。
3. PCR反应：反应开始时，立即开始DNA聚合酶的活性。
DNA聚合酶会从引物的3'端开始合成新的DNA链，直到另一条模板DNA链的末端。
该过程包括三个步骤：变性、扩增和延伸。
- 变性：将DNA模板的双链解链，得到两条单链DNA。
- 扩增：引物结合到模板DNA上，并通过DNA聚合酶的活性引导新的DNA链的合成。
- 延伸：DNA聚合酶在模板链的5'到3'方向上合成新的DNA 链。
4. 荧光探针监测：实时PCR使用一种带有荧光染料的DNA探针，例如SYBR Green或TaqMan探针。
这些探针能够与新合成的DNA片段结合，并发出荧光信号。
- SYBR Green：该荧光染料会与双链DNA结合并发出荧光。
当PCR反应进行时，DNA的数量增加，SYBR Green的荧光信号也增加。
通过检测荧光信号的强度，可以确定PCR反应的进程和目标物质的数量。
- TaqMan探针：TaqMan探针包含一个与目标DNA片段互补的序列，并在其一端有一个荧光染料，如荧光素（FAM）和荧光素内部荧光质体（TAMRA）。
当TaqMan探针与目标DNA结合时，聚合酶开始进行DNA合成，并在过程中释放探针分子。
聚合酶的活动断开荧光染料和荧光质体之间的特定连接，导致发出另一种荧光信号。
通过监测这两种荧光信号，可以确定PCR反应的进程和目标物质的数量。
5. 数据分析：荧光信号的强度与反应温度和时间关联，通过计算PCR循环的阈值周期（CT值），可以确定目标DNA的起始数量。
实时荧光定量PCR技术详解及总结
实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。
在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。
通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。
与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。
首先，它被广泛应用于基因表达分析。
通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。
其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。
例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。
相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。
首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。
实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。
其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。
实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。
此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。
总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。
该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。
实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
实时荧光定量PCR技术
动物医学进展,2005,26(12):972101Progress in Veterinary Medicine专论与讲座实时荧光定量PCR技术3蒋春燕,王泰健,王 琴3,范学政(中国兽医药品监察所,北京100081)中图分类号:Q503文献标识码:B文章编号:100725038(2005)1220097205摘 要:荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。
它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。
提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等。
关键词:荧光定量PCR;基因定量;检测技术随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊断在临床中的地位显得更为重要。
自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应(polymerase chain re2 action,PCR)以来,PCR技术作为一种重要的基因诊断方法,以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为科研、临床诊断的热点技术。
但是传统PCR技术在应用中遇到了一些难题,一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。
为克服上述不足,人们采取了许多方法,如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等,但均不能得到满意的结果,直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy t rans2 fer,FRET)技术用于PCR定量后,上述问题才得到较好的解决。
1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,为解决传统PCR的难题提出了新的思路。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断 和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞 争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物 被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已 知模板推测未知模板的起始拷贝数。
谢谢观看
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地 高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加 入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
实时荧光定量 Real-timePCR 和 RT-PCR 技术在流感疫情检测中的作用
Ｏ 引言
流感 与严重急性 呼吸综合症 容易误 诊 ，据 相关资料 表明 ， 在Ｓ Ａ Ｒ Ｓ严 重流行期 间，误 诊率甚 至高达 ３ ０ ％ ～４ ０ ％口 】 。这 严 重 的伤 害 和 干扰 了对人 们 的身体 健 康 和科 学 的 治疗 ，因 此 ，我们 要 采用 准确 、快 速 的检测 方法 来进 行 流感 的检 测 ， 避 免 误 诊 的 发 生。在 １ ９ ９ ６年 美 国 Ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｅ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍｓ 公 司推 出 推 出 了实 时荧 光 定 量 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ技 术 ，该 技术 不 仅 使 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ从 定 性 飞跃 到定 量 ，而且 还 具 有 能有 效 解 决 Ｐ Ｃ Ｒ 污染 问 题 、特 异性 强 、 自动 化 程度 高 等 特点 ，这种 技 术 目 前 得 到 了广 泛 的应 用 。荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ法 在 Ｐ Ｃ Ｒ 反应 中不 仅 加 入亚 型 特 异 引物 ，也 加 入 了标 记 荧光 的相 应 型 、亚 型特 异 核苷 酸 片段 作 为探 针 ，Ｐ Ｃ Ｒ 反应 中复 性温 度 比该 探 针温 度 低５ ｏ Ｃ，使其 与 Ｐ Ｃ Ｒ产 物 杂交 ，通 Ｔ ａ ｐ酶 内源性 核酸 酶 活 性来 使 的 为杂 交 的 荧光 探 针得 到 降 解 ，并加 入 淬 灭剂 使 得 游离 的荧 光素 被 消 除 降解 ，最 后 通 过测 定荧 光来 对 扩增 产 物进 行 定量 的 分析 。这 样 可 以使得 以往 的 Ｐ Ｃ Ｒ后繁 琐 的产 物 分析 过 程得 到避 免 ，而 且 还可 以随 时终 止 扩增 反 应 ，检
杨 露 露
摘要 ： 目的 实时荧光定量 Ｒ ｅ ａ １ ． ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ检 测技 术在 流行性 感 冒检 测诊 断上 的应 用探 究。方法 收集 ２ ０ １ １ 年 至２ ０ １ ３年 和 田地 区哨 点 医院 疑 似 流 感 、Ｓ Ａ ＲＳ患者 的咽 拭 子 标 本 １ ３ ５ ０ 份 ，应 用 实时 荧光 定 量 Ｒ ｅ ａ １ ． ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ和 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 、Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ细胞培养法和血凝抑制试验进行病原 学和血清 学检测 。结果 １ ３ ５ ０份哨 点医院疑似 流感、Ｓ Ａ Ｉ Ｌ Ｓ 患者的咽拭 子标 本 中用荧光定量 Ｒ ｅ ａ １ ． ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ和 ． Ｐ Ｃ Ｒ检测 ， 阳性 ９ ８ 份 。阳性 率 ７ ． ３ ％。 其 中甲型 Ｈ１ Ｎ１ 流感阳性 ６ ２份 、 Ｂ型流感份 阳性 ２ ５ 份 、季节性 Ｈ３阳性 ｌ １ 份 。结论 实时 荧光定量 Ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ和 一 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ方法检 测流感病毒 能够在 ３ ～４ ｈ内得 出结果、且操作 方便 、特异性 强、灵敏度 高，值得在 流感诊 断过程 中广泛应 用。正确检 测和鉴 定病毒是 必 须解决 的首要 问题 ，我 中心开展 了甲型 Ｈ１ Ｎ１ 流感病毒核 酸检 测技术 的检 测工作 ， 目前 已建立 了甲型 Ｈ１ Ｎ１ 流感病毒 核酸 Ｒ ｅ ａ １ ． ｔ ｉ ｍｅ Ｐ Ｃ Ｒ和 一 Ｐ Ｃ Ｒ检 测技 术，并将其及 时用于临床样本 的检测 关键词 ：实时荧光定量 ；逆转录聚合酶链反应 ；甲型 Ｈ１ Ｎ１ ；流感 ；病毒 中图分类号 ：Ｒ ４ ４ ６ 文献标识码 ：Ｂ ＤＯ Ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ １ ． ３ １ ４ １ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ２ ． ０ ９ ９
实时荧光定量PCR技术
Real Time PCR 原理
• 定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。 • 同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。
C(t)
Ct值的特点： 终点处产 物量不恒定； Ct值则极具 重现性
Cycle
Real Time PCR 原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
THANKS
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I与 DNA双螺旋小沟区域结合示意图
• SYBR Green I 与dsDNA结合 • SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍
• 随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA 结合，
SYBR Green I作用机理示意图 使得荧光信号增强.
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作
出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
Real Time PCR 检测方法
分别是DNA结Βιβλιοθήκη 染料法、水解探针法、分子信标法、 杂交探针法、荧光引物法。
核酸染料技术 代表：SYBR Green I (SGI)
荧光探针技术
代表：TaqMan probe
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料 ，在游离状态下， SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强 。因此，SYBR Green I的荧 光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光 信号检测出PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR G reen I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大 约为 520nm。
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术一、实验目的：1、了解PCR的原理并熟悉其操作的方式。
2、学会使用PCR仪进行定量或定性的分析。
二、实验原理：常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。
2.1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-timePCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
2.2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。
这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异，所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。
2.3、荧光定量PCR中的概念2.3.1扩增曲线荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。
在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
实时荧光定量PCR技术
模板含有抑制物；···
火/延伸时间；提高引物浓
度；添加K+；改用三步法扩
增；添加增强剂；换酶；重
新设计引物；···
特异性差 探针，引物设计不合理，二级 提高退火/延伸温度；适当降
结构过多；探针，引物浓度 低探针，引物浓度；调整
过高；退火/延伸温度偏低； Mg2+的量；重新设计探针，
···
引物；换酶···
体系稳定性差 原料储存不当；体系配制时间 探针应避光；体系在冰上配制
过长；模板浓度低；模板不 ；使用合格的试剂盒制备模
纯，降解；
板，避免反复冻融；
···
谢谢
–反应体系监控：蒸发、操作
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称
作用
10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等）
引物mix 探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul）
缓冲液-提供反应环境
PCR反应的出发点 发出信号，指示扩增 聚合酶-催化合成反应
• 二，Ct值为扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数，即Ct值与荧光 阈值有关。
实时荧光定量PCR技术的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 此外，还其它非荧光类淬灭基团如BHQ1，BHQ2等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2-ΔΔc(t) =1.41~1.82
结果与双标准曲线法相近
Carcinoma RNA ERBB2 27.36 27.12 26.24 ± 0.17 GAPDH 22.81 22.86 22.83 ± 0.03 ΔC(t) 4.55 4.26 4.41 ±0.21
SNP检测
SNP（单核苷酸多态性）
激光强度、管盖透光性能 缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等
是一种综合校正，校正管间差异，保证实验结果的重 现性
SYBR ® Green I数据的ROX校正
熔解曲线的ROX校正
TaqMan数据的ROX校正
内对照(IPC)
同样重量或体积的样品并不来源于同样数目的细胞， 即使细胞培养的起始量相同、条件相同 IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其定量结 果代表了基因组的数量，也就是检材中细胞的数量 18S rRNA, β-actin, GAPDH
循环数Cycle Number
Ct
阈值和Ct值
Rn+
Sample Threshold Ct
Baseline
No Template
Rn-
标准曲线
Ct
起始拷贝数或起始浓度
教学安排
定量过程 定量原理的数学依据 化学原理 定量要素 应用实例
PCR理论方程
Rn RB X O (1 E X ) n RS
人类基因组中的单碱基突变 大约93%的基因至少含有一个SNP
SNP分型的意义
可能引起疾病或疾病的易感性 作为基因缺陷型疾病的标志物 SNP的漂变可作为进化研究手段 药物的抗药性研究
CT = CT Smpl - CT IPC将定量结果校正为以基因组为单 位，不同样品之间具可比性
绝对定量和相对定量
绝对定量：确定待测样品中某一目的基因的绝对量值， 即确切拷贝数。 标准曲线法
相对定量：确定待测样品中某一目的基因在不同条件 下的表达差异（倍数关系）。 双标准曲线法； 2-ΔΔc(t)法
提出问题
如何检测某个致病/抗旱/肿瘤/某种功 能基因在不同条件下的表达情况？
针对mRNA的原位杂交； 针对对应蛋白质的检测；
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实现了实时监测整个 PCR进程，对起始模板进行定量分析 的方法。
实时荧光定量PCR---不开盖测定核酸
0 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0
Soy Dessert Soy Flour Soy Burger
ND ND 28.2 27.2 26.2 24.6 24.6 ND 24.2
22.6 22.6 22.5 22.5 22.8 22.7 22.4 22.2 23.4
ND ND 5.7 4.7 3.4 1.9 2.1 ND 0.7
闭管化学（降低污染风险）； 无后处理（无需跑胶照相等）； 高度自动化； 定性定量分析，SNP鉴定
传统的终点PCR定量
终点法的结果
96个样品的重复性
PCR扩增曲线
Rn (荧光信号) 平台期
指数增长期 循环数Cycle Number
阈值和Ct值
Rn (荧光信号) 阈值Threshold
当n=30, Ex=0.95时， N=NO(1.95)30 =NO x 5.0 x 108 当n=30, Ex=0.90时， N=NO(1.90)30 =NO x 2.3 x 108
相差2.2倍
阳性对照和阴性对照
阳性对照
已知必定可以成功、得到扩增曲线的样品 用于判断仪器、试剂、操作是否存在问题（假阴性）
-0.20 -0.40 0 1 2 3 4 5 6
∆ C(t)
Standards/ Sample Soy Dessert Soy Flour Soy Burger
∆C(t) 2.1 ND 0.7
%GMO 4.40 < 0.5 >5
ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表 达差异（双标准曲线法/ 2-ΔΔc(t) 法）
Relative Expression 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA Tumor RNA 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 0.011
正向引物
5’ 3’ 5’
R
TaqMan® 探针
Q
5’ 3’ 5 反向引物’
R
正向引物
5’ 3’ 5’
Q
反向引物 5’ 3’ 5’
其它类型的荧光标记
LUX 引物
分子信标
荧光分子比较
TaqMan Probes 灵敏度 动态范围 特异性 多重反应 熔解曲线分析 设计简单 费 用 *** *** *** ** N/A * * Molecular Beacons *** *** *** ** N/A * * SYBR Green I * * * N/A *** *** *** LUX Primers *** *** ** *** *** *** ***
GAPDH表达
Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA 23.27 23.41 23.34± 0.10 Carcinoma 22.81 22.86 22.83 ± 0.03
实验结果
Healthy RNA ERBB2 GAPDH 1095 1052 95500 85730 Tumor RNA 2130 2492 136000 130800
TUBE 1
TUBE 2
PCR mix Lectin primers
PCR mix GMO primers
转基因大豆检测结果
Log percent GMO
Standards/ Sample
C(t) epsps
C(t) Lectin
∆C(t)
0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
y = -0.264x + 1.202 2 R = 0.998
已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因 此可以作为一个检测标准; 选用GAPDH作为内标基因
FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针
双标准曲线
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
目标基因
目标基因可以是DNA、cDNA或者质粒； RNA需要先反转录成cDNA； DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间
=1.8: 纯DNA 质/酚污染 > 2.0: RNA污染 < 1.6: 蛋白
DNA用量：基因组DNA：0.1 ng –1 ug
标准品
标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓 度之间的数学关系。
以上是来自Invitrogen公司的比较。
教学安排
定量过程 化学原理 定量原理的数学依据 定量的要素 应用实例
定量的要素
目标基因 产生标准曲线 监控试剂、系统 监控污染 校正操作误差 降低定量误差 数据之间可比性
未知样品 标准品 阳性对照 阴性对照 参比荧光(ROX) 3-6复管 内对照(IPC)
Where: Rn=Total fluorescence signal RB=Base fluorescence signal XO=Initial number of target molecules EX=Efficiency of target amplification n =Number of cycle RS=Fluorescence signal per target molecule
实时荧光定量PCR技术
熊 英 2014年12月05日
ABI 荧光定量PCR仪
ABI 7000
边缘效应
罗氏的荧光定量PCR仪
滤镜轮
CCD 相机 物镜 多孔板
罗氏 LC480
均一的激发和检测，无光程差 采用折叠光路增加光程，降低激发高度
教学安排
定量过程 化学原理 定量原理的数学依据 定量要素 应用实例
阴性对照/空白对照
除了模板DNA或RNA，具备其他全部成分 以水代替模板 用于判断系统是否存在污染（假阳性）
Passive Reference Dye （ROX)
以固定浓度存在于PCR缓冲液中，常用ROX 荧光强度归一化校正：Rn = RReporter / RROX 影响荧光信号强度的因素包括：
样品扩增：正常vs肿瘤
PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤
肿瘤
正常
正常
实验结果
ERBB2表达
Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA 28.40 28.46 28.43± 0.04 Carcinoma 27.36 27.12 26.24 ± 0.17
当n=CT时，Rn=RT，即设定的阈值 RT =RB+XO(1+Ex)CTRs log(RT -RB)=log XO +CTlog(1+ Ex)+logRs CTlog(1+ Ex)=log(RT -RB)-log XO -logRs