赭曲霉毒素A标准检测规程

赭曲霉毒素A标准操作规程
1、目的
为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程，特制订本操作规程。

2、范围
本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。

3、检出限和定量限
项目
岛津安捷伦
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责
部门名称部门职责
质量管理部1、负责本制度的实施。

2、负责本制度的监督执行。

5、程序
5.1 原理
测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。

用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。

5.2 溶液配制
5.2.1 提取液Ⅰ（用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V甲
醇: V水=80 : 20）：取800mL甲醇，加入去离子水定容至1L。

5.2.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL
水中，加水定容至1L。

5.2.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）：称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳
酸氢钠溶于水中，加0.1mL吐温-20，用水定容至1L。

5.2.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约
950mL水中，加水定容至1L。

5.2.5 洗脱液（甲醇: 乙酸=49 : 1）：取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。

5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10
ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。

5.3 样品前处理
5.3.1 粮食类
----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的提取液Ⅰ（见5.2.1）；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；
----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：1
5.3.2 酒类
----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品20g±0.01g，加入提取液Ⅱ（见5.2.2）定容至25mL；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液；
----取1mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：1.25
5.2.3 酱油、醋类样品
----取样品25g±0.01g，加入提取液Ⅰ（见5.2.1）定容至50mL；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----移取10mL滤液用水定容至50mL；
----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液；
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：0.4
5.4 净化
5.4.1 上样
----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上；(3mL的免疫亲和柱去
掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与针筒固定后使用)
----将柱子与气控操作架上的针筒连接固定，取适量处理后的溶液上样；
----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1~2滴/秒的速度流出；
5.4.2 洗涤
----待液体排干；
----净化样品为粮食类时，用10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
----净化样品为酱油、醋类时，依次用10mL清洗缓冲液（见5.2.3），10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
----净化样品为酒类样品时，依次用10mL冲洗液（5.2.4），10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
5.4.3 洗脱
----待液体排干后，更换新针筒，上样2mL洗脱液（见5.2.5），用试管接洗脱液，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至2mL；
----洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。

* 每次上样前都要将上次液体完全排干。

* 也适用于GB 23502-2009。

5.5 液相测定
5.5.1 液相色谱条件
C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；
流动相：55%乙腈45%水（水：乙酸=99:2）
流速：1.0 mL/min；
柱温：40℃；
进样体积：20µL
荧光检测器：
激发波长：333nm
发射波长：477nm
5.5.2 色谱定量
分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中赭曲霉毒素A的峰面积带入标准曲线，得到试样中赭曲霉毒素A的浓度，标准品色谱图参考下图：
数据文件名:ota-10ppb.lcd 样品名:ota-10ppb
0.0
2.5 5.07.5
10.0min
05
mV
检测器A Ex:333nm,Em:477nm
O T A
附图：OTA-10ppb 标准品液相图谱
5.6 注意事项
----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。

----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。

----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。

----柱容量：柱容量是100ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。

----pH ：亲和柱的上样溶液pH 需在6～8之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调节pH 。

----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。

----赭曲霉毒素可致癌，应戴手套操作。

----使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V ）浸泡过夜。

6、
相关文件
《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、
相关记录 N/A 8、
附件 N/A 9、
修改历史记录
编号
变更类型
修改条款及主要内容
修改人
修改日期
01 A N/A 魏丹丹2016.3.16
变更类型：A –新起草M - 修订。