赭曲霉毒素A标准检测规程
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赭曲霉毒素A标准操作规程
1、目的
为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程,特制订本操作规程。
2、范围
本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。
3、检出限和定量限
项目
岛津安捷伦
样本检出限
(µg/kg)
样本定量限
(µg/kg)
样本检出限
(µg/kg)
样本定量限
(µg/kg)
OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责
部门名称部门职责
质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序
5.1 原理
测定的基础是抗原、抗体反应,抗体连接在柱体内,样品经过提取、过滤后,缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱,在免疫亲和柱内毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A,然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。
5.2 溶液配制
5.2.1 提取液Ⅰ(用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取):80%甲醇-水溶液(V甲
醇: V水=80 : 20):取800mL甲醇,加入去离子水定容至1L。
5.2.2 提取液Ⅱ(用于酒类样品的提取):称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL
水中,加水定容至1L。
5.2.3 清洗缓冲液(用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤):称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳
酸氢钠溶于水中,加0.1mL吐温-20,用水定容至1L。
5.2.4 冲洗液(用于酒类样品净化步骤的洗涤):称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约
950mL水中,加水定容至1L。
5.2.5 洗脱液(甲醇: 乙酸=49 : 1):取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。
5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液:用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10
ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。
5.3 样品前处理
5.3.1 粮食类
----20g±0.01g样品(固体样品需粉碎,并过2mm分样筛),5g氯化钠于三角瓶中,加入100mL的提取液Ⅰ(见5.2.1);
----高速均质(≥10,000r/min)1min(或用摇床200r/min~300r/min剧烈振荡20min);----用快速定性滤纸过滤,收集滤液;
----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释,混匀;
----用微纤维滤纸过滤,并收集滤液作为上样液;
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数:1
5.3.2 酒类
----取脱气的酒类样品(含二氧化碳的酒类样品,使用前先搅拌或超声脱气)或不含二氧化碳的酒类样品20g±0.01g,加入提取液Ⅱ(见5.2.2)定容至25mL;
----高速均质(≥10,000r/min)1min(或用摇床200r/min~300r/min剧烈振荡20min);----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清,并收集滤液作为上样液;
----取1mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数:1.25
5.2.3 酱油、醋类样品
----取样品25g±0.01g,加入提取液Ⅰ(见5.2.1)定容至50mL;
----高速均质(≥10,000r/min)1min(或用摇床200r/min~300r/min剧烈振荡20min);----用快速定性滤纸过滤,收集滤液;
----移取10mL滤液用水定容至50mL;
----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清,并收集滤液作为上样液;
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数:0.4
5.4 净化
5.4.1 上样
----取出免疫亲和柱,将上方塞子取出斜剪断,再插回亲和柱上;(3mL的免疫亲和柱去
掉上方塞子,安装上转接头,将转接头另一端与针筒固定后使用)
----将柱子与气控操作架上的针筒连接固定,取适量处理后的溶液上样;
----去掉亲和柱下方堵头,调节开关,使液体以1~2滴/秒的速度流出;
5.4.2 洗涤
----待液体排干;
----净化样品为粮食类时,用10mL去离子水淋洗免疫亲和柱,流速2~3滴/秒;
----净化样品为酱油、醋类时,依次用10mL清洗缓冲液(见5.2.3),10mL去离子水淋洗免疫亲和柱,流速2~3滴/秒;
----净化样品为酒类样品时,依次用10mL冲洗液(5.2.4),10mL去离子水淋洗免疫亲和柱,流速2~3滴/秒;
5.4.3 洗脱
----待液体排干后,更换新针筒,上样2mL洗脱液(见5.2.5),用试管接洗脱液,流速1滴/秒,收集洗脱液并定容至2mL;
----洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。
* 每次上样前都要将上次液体完全排干。
* 也适用于GB 23502-2009。
5.5 液相测定
5.5.1 液相色谱条件
C18柱:250mm(长)×4.6mm(直径),填料粒径5μm;
流动相:55%乙腈45%水(水:乙酸=99:2)
流速:1.0 mL/min;
柱温:40℃;
进样体积:20µL
荧光检测器:
激发波长:333nm
发射波长:477nm
5.5.2 色谱定量
分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰面积),以标准品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标做标准曲线,将未知样本中赭曲霉毒素A的峰面积带入标准曲线,得到试样中赭曲霉毒素A的浓度,标准品色谱图参考下图: