菌落总数测定注意点

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浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点

摘要：本文介绍了食品中大肠菌群和菌落总数的检验中容易不规范操作的几个方面，并针对性地提出解决办法。

关键词：食品大肠菌群菌落总数检测规范

前言

目前，食品大肠菌群与菌落总数的检测标准主要是采用

GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定[1]、

GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[2]、GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[3]这三个国家标准。但是目前国家标准只给出了实验的基本操作步骤及计算方法，而在实际的检验工作中，还存在一些影响操作可靠性的因素并未给出说明。本文结合笔者自身检验经验，对大肠菌群与菌落总数的检测过程中易发生不规范操作的部分做出强调，以期对每个检验环节精确控制，以获得稳定可信的检验结果。

一、大肠菌群测定的一些要点：

大肠菌群的发酵试验中要用到小倒管，主要用来观察气泡的出现。但是实验中经常会出现还未接种样液，小倒管内就出现气泡，这样会影响结果的判断。现列举出出现这种现象的几种原因及对策：

1.小倒管的口太小。在灭菌过程中，高压会将培养基压进小倒管，使空气排出，但如果小倒管开口过小，空气不容易出来，培养基也不容易进去，容易导致气泡残留在管内影响观察，若是这种情况，可以改用开口较大的V形管代替。

2.小倒管里面残留有水珠。因为小倒管开口很小，清洗后内部的水不容易干燥完全。这样会导致灭菌过程中培养基无法进去，使用时要注意放置小倒管前要将其内部的水甩干。

食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项

1菌落总数及测定

菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别

的生长物,它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度,与培养基混合,在一定培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

菌落总数就是指食品检样经过处理,在一定条件下(如需氧性质、培养基成分、pH、培养温度和时间等) 1 mL ( g)检样中所含菌落的总数。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度、食品的新鲜度及卫生质量,它反映食品在生产、加工、销售过程中是否符合卫生要求,

以便对被检样品做出适当的卫生学评价。也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣[ 1 ] 。

2菌落总数测定中的注意事项

2. 1 所用器皿及稀释液

2. 1. 1 检验中所用玻璃器皿,如培养皿,吸管、试管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的,并在灭菌前彻底洗涤干净,不得残留有抑菌

物质。

2. 1. 2 用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时,要查找原因,如可通过追加对照平板,以判定是空白稀释液,用于倾注平皿的培养基,还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。

2. 1. 3 检样的稀释液一般用灭菌盐水,如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释,则宜用蒸

馏水。做醋时用20% ～ 30%碳酸钠调pH 至中性。

2. 2 检样的稀释

2. 2. 1 检样稀释时,应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25

菌落总数的测定

菌落总数测定

1.原理：

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分，培养温度和时间，PH，需氧性质等），所得1ml (g) 检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

2.仪器设备与器具：

参照大肠菌群的检测方法

3.试剂：

3.1细菌营养琼脂培养基配置：

3.1.1称取31g营养琼脂培养基加入蒸馏水1000ml，摇动均匀。

3.1.2以棉塞或硅胶塞，牛皮纸包封瓶口。

3.1.3置于高压杀菌釜内，以121℃15分钟灭菌。

3.1.4取出培养基自然冷却至不烫手后（约45℃）备用。

3.2稀释液：参照大肠杆菌群测定标准

4.测定方法：

4.1检样稀释及培养：

4.1.1以无菌操作作将检样25ml(g)放于含有225ml灭菌生理盐水或

其他稀释的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。

4．1．2用1ml灭菌吸管1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管理体制内，用定量移液器在试管内鼓励气三至四次使其混合均匀，作成1：100的稀释液。4．1．3另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10售递增稀释液，每递增一次，换用一支1ml灭菌吸管。

4．1．4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选取二至三个适宜稀释度，分别在做10倍数递增的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做二个平皿。

食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项

一、什么是菌落及菌落总数

菌落是由单个细菌细胞或者一群同种细胞在适宜的培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落，即数以万计的细菌的集合。在食品微生物的检验过程中所检测到的1ml（g）样本中含有的菌落的数量称为菌落总数。

二、为什么要在食品微生物检验中测定菌落总数

随着社会的进步、经济的发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品安全越来越重视，国家层面对食品微生物的检测精度和力度也逐步加强，食品微生物的检验中菌落总数测定是其中的重要一项。菌落总数是食品安全评判的重要指标，菌落总数测定可以用来评价食品被细菌污染的程度、食品的新鲜度和卫生质量，判定食品在加工过程中是否严格遵守国家相关规定。食品安全与大众生命健康息息相关，国家相关部门也不断出台相关的法规政策，应用现代科技规范检测方法，更好的保障食品安全。

三、测定菌落总数有哪些注意事项

食品微生物检测中菌落总数的测定能够表明细菌的繁殖情况。菌落检测的具体过程是：处理、培养被检样品，测定1ml（g）被检样品中菌落总数。为保障食品的衛生安全，在检测过程中要严格把控、格外注意检测事项。具体注意事项如下：

1.样品的前期处理

（1）取样前：在对被检食品取样之前，首先应该确保在整个测定过程中使用到的仪器例如玻璃器皿、培养皿、吸管、试管、液器的吸头等都已经经过灭菌处理，而且不得残留抑菌物质。工作人员也要严格遵守佩戴无菌手套、口罩的规定，这是为了保证在操作过程中不会使样品人为地感染细菌。

（2）制备稀释液：用于稀释样品的液体必须保留空白对照实验组。对于盐含量较高的食品样本一般使用蒸馏水稀释;对于醋含量较高的食品一般使用碳酸钠溶液来稀释;其他的样本大多采用灭菌盐水来稀释。稀释时，将无菌操作得到的25ml样品放在225ml制备好的灭菌稀释液中，充分混合均匀得到稀释液。在加入样本的操作中应将样本沿试管壁缓缓滴入，注意整个过程不能使吸管触碰到瓶口，避免接触污染物，从而导致检测不准确。按照上述的稀释步骤连续稀释，需要配制逐渐递增10倍的稀释样品。

大肠杆菌、菌落总数检测步骤

大肠杆菌及菌落总数检测方法

为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。

下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。

一、大肠杆菌：

1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）

双料试管配制

A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。

B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。

C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。单料试管配制

A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。

B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。

C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。

4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：

A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）

B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。

C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。

D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。

E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。

F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。

G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml 吸管取样品液体分别注入双料试管中

食品微生物检测：菌落总数测定标准要点解析

一、称样

（1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；

（2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。

二、样品稀释

（1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。

（2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。

三、稀释度的选取

液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。

四、质量控制

空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。（若空白有菌落生长则该实验无效）。

五、平板计数琼脂（PCA）

灭菌条件为121℃、15min。一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

菌落总数的测定

一、菌落总数介绍：

菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

二、检验方法

菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。

基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。

国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。

菌落总数检验操作规程

目的：该操作规程用于规范公司产品及原料的活菌数量检验操作。

范围：该操作规程适用于公司要求检查该项的产品和原料的菌落总数检验

责任人：微生物检验员，QC主管

内容：

1 技术依据及原理

菌落总数计数采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一。

该方法以在琼脂平板上，样品经过处理在一定条件下培养后，所得1ml（或1g）检样中形成菌落的总数。测定结果只反映在规定条件下，只包括一群在平板计数琼脂生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。

在进行本法测定时，必须严格按本法规定的条件操作，以免产生实验误差。

2 材料、仪器、试剂的准备及基本要求

2.1 无菌室

2.1.1 结构和要求无菌室面积不超过10m2，高度不超过2.4m，应采光良好、避免潮湿、远离厕所所及污染区，有缓冲间（2个）、操作间组成。

操作间与缓冲间之间应有样品传递窗（箱），出入操作间和缓冲间的门不应直对。

无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不得安装下水道。

无菌室照明灯应嵌装在天花板内，室内光照分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5W/m3）, 紫外线杀菌灯距实验台面高度不超过1 m，并定期检查其辐射强度，辐射强度不低于70µW·cm-2

（1 m距离），不符合要求的紫外线杀菌灯应即使更换。

2.1.2 温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外线杀菌灯的杀菌效果，故应控制温度18～26℃，相对湿度40～60%。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，压差不低于4.9Pa。

细菌菌落总数的测定注意事项

检测过程中的注意事项：

1、在GB 4789.2的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。

2、根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择2~3个稀释度。加入样品时要注意外来的污染。

3、为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在15min 内倾注培养基。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。

4、培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。（倾注的温度：一般水浴和倾注温度在46±1℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，过低会导致琼脂发生轻微凝固。厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。

5、检验过程中还应该用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检验过程中应在工作台上打开一块空白的平板计数琼脂，其暴露时间应与检验时间相当，以了解检样在检验过程中有无受到来自空气的污染。

6、每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。

食品：36±１℃，48±2h 。

饮用水：36±１℃，48±2h 。

水产品（指原生态、未加工的水产品）：30±１℃，72±3h。(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。

食品中细菌总数的检验实验步骤及注意事项

一、实验目的要求

1、了解细菌总数检验的意义。

2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法

3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能

4、熟练无菌操作技术。

二、原理

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

三、试剂和仪器

（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）

规格名称

1、500ml广口瓶

2、500ml三角瓶

3、250ml三角瓶

4、18×180mm试管数量1个1个2个3支

用途:稀释样品

配制:生理盐水

配制:营养琼脂稀释样品倒营养平板

5、1ml移液管5支

6、直径为90mm平皿10套

7、250ml量筒1支

8、玻璃珠：直径约5mm

（二）应灭菌、消毒的器材

剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器

（三）应制备的培养基

培养基总量所用容器

1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶

2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶四、实验内容（一）、基本操作过程：

样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。（二）、样品的稀释（样品的处理）

样品：袋装乳粉

实验1.细菌总菌落数的测定

二、仪器设备
（1）培养箱：（36±1）℃。）培养箱：（36± （2）恒温水浴锅：（46±1）℃。）恒温水浴锅：（46± （3）天平。（4）灭菌广口瓶或三角瓶：500ml。）灭菌广口瓶或三角瓶：500ml。（5）灭菌培养皿：皿底直径9.0㎝。）灭菌培养皿：皿底直径9.0 9.0㎝（6）灭菌吸管：1.0㎝、10.1㎝。）灭菌吸管：1.0㎝ 10.1㎝（7）灭菌小试管。（8）玻璃珠：直径5㎜。）玻璃珠：直径5 （9）均质机。（10）灭菌刀、剪刀、镊子。 10）灭菌刀、剪刀、镊子。
表中例次说明：例1：应选择平均菌落数在30～300的稀释倍数报告。：应选择平均菌落数在30～300的稀释倍数报告。例2：及例3：若在30～300的两稀释倍数的菌落数之比小于2，应报告其：及例3：若在30～300的两稀释倍数的菌落数之比小于2 平均数；若大于2 平均数；若大于2，则报告较小的数字。：若各稀释倍数的菌落均大于300，则按稀释倍数大的报告。 300 例4：若各稀释倍数的菌落均大于300，则按稀释倍数大的报告。例5：若各稀释倍数的菌落数均于30，则按稀释倍数小的报告。：若各稀释倍数的菌落数均于30，则按稀释倍数小的报告。例6：若各稀释倍数的菌落数全部为0，则以1乘以最低稀释倍数报告。：若各稀释倍数的菌落数全部为0，则以1 例7：若各稀释倍数的菌落数均不在30～300，则以最近30或300的平均：若各稀释倍数的菌落数均不在30～300，则以最近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 3.结果报告 3.结果报告菌落数在100以内时，按实际数报告；大于100时，采用两位有菌落数在100以内时，按实际数报告；大于100时，采用两位有效数字，两位有效数字后面的数值，以四舍五入的方法取舍。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数形式来表示（见表1 短数字后面的零数，也可用10的指数形式来表示（见表1中“报告方式”栏）。

菌落总数测定注意事项

菌落总数测定是一种常用的微生物检测方法，用于评估食品、水源、环境等样品中的微生物污染程度。在进行菌落总数测定时，需要注意以下几个方面。

1. 实验室准备

在进行菌落总数测定之前，需要进行实验室的准备工作。确保实验室环境干净整洁，并且有足够的空间来进行操作。实验室应该配备必要的设备和试剂，如培养基、平板计数器、恒温培养箱等。

2. 样品处理

样品处理是菌落总数测定的关键步骤之一。选择合适的样品容器，并确保其干净无菌。根据不同样品的特性选择合适的处理方法，如稀释、过滤、均匀搅拌等。在处理样品时要注意避免污染和交叉感染。

3. 培养基选择

选择合适的培养基对于菌落总数测定至关重要。常用的培养基有营养琼脂、大肠杆菌培养基等。根据不同的样品特性和检测目的，选择适宜的培养基。要确保培养基质量良好，无菌且保存期限未过。

4. 接种方法

接种方法是影响菌落总数测定结果准确性的重要因素之一。常用的接种方法有涂布法、均匀涂布法和滴定法等。在进行接种时，要注意避免气泡的产生和交叉感染，保证每个接种点数量均匀、分散。

5. 培养条件

培养条件对于菌落总数测定结果的准确性和可重复性至关重要。应根据不同微生物的生长特性和培养基要求，设置合适的温度、pH值、湿度等条件，并严格控制培

养时间。要注意防止外界污染和细菌交叉感染。

6. 菌落计数

菌落计数是菌落总数测定的最后一步，也是最关键的一步。在进行菌落计数时，应使用合适的平板计数器或显微镜，并按照指定规则进行计数。为了提高准确性，建议对每个样品进行多次计数，并取平均值作为最终结果。

菌落总数的检测方法[教育]

菌落总数的检测方法

一、菌落总数介绍：

二、检验方法

基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。

探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项

【摘要】

食品微生物检验中菌落总数测定是一项重要的质量控制措施，有

助于检测食品是否受到微生物污染。在进行菌落总数测定时，需要注

意样品采集、实验室操作、菌落计数仪器操作、数据分析和质量控制

等方面的注意事项。样品采集时应保持无菌操作，实验室操作时严格

遵守操作规程，菌落计数仪器操作时应校准仪器并确保准确性，数据

分析时要认真记录数据并进行正确的统计分析，质量控制方面要定期

检验仪器和重复实验等。这些注意事项对于确保菌落总数测定结果的

准确性和可靠性至关重要。通过严格遵守这些注意事项，可以有效提

高食品微生物检验中菌落总数测定的准确性和实用性，保障食品安全。未来，我们可以进一步深入研究和优化相关方法，不断提高检验水平，确保食品质量和消费者健康。

【关键词】

食品微生物检验、菌落总数测定、注意事项、样品采集、实验室

操作、菌落计数仪器、数据分析、质量控制、总结、展望

1. 引言

1.1 研究背景

食品微生物检验是食品安全监管中非常重要的一个环节，其中菌

落总数测定是评价食品卫生质量的重要指标之一。菌落总数检测是指

在特定培养条件下，培养48小时到72小时后，对产生单一培养基上的菌落进行计数的方法，能够反映食品中微生物的总体数量。

食品微生物检验的对象广泛，包括食品生产加工中的原料、半成品和成品，也包括餐饮业中使用的食品和食材。食品微生物检验中菌落总数测定是评价食品卫生质量的重要手段之一，通过对食品中微生物总数的监测，可以及时发现食品中的污染源，并且评估食品的安全性。

研究背景：食品微生物检验中菌落总数测定的准确性关系到对食品安全的评估，因此在进行菌落总数测定时，需要注意一系列操作规范和注意事项，以确保测试结果的准确性和可靠性。接下来将分别介绍样品采集注意事项、实验室操作注意事项、菌落计数仪器操作注意事项、数据分析注意事项以及质量控制注意事项。

如何测定菌落总数

一、菌落总数介绍：

二、检验方法

基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。

菌落总数测定操作步骤

食品中菌落总数测定操作步骤

一、器皿、药品试剂准备

1、检查高压灭菌锅水水位（完全淹没发热管且与锅底支架相平），通电预热，检查恒温水

浴锅水位，通电，设定为46度，加热恒温；

2、取8套直径90毫米的培养皿用报纸包裹严密或用布袋封装，放入高压灭菌锅；

3、称量4.3克氯化钠于500毫升三角瓶中，用500毫升量桶量取500毫升水加入其中，溶

解；

4、取一250或300毫升的三角瓶、三支试管，用量桶量取225毫升上述（第3步所培溶液）

生理盐水于三角瓶中，用10毫升刻度吸管分别量取9毫升上述（第3步所培溶液）生理盐水于三支试管中，用透气塞或棉塞封口，放入高压灭菌锅；

5、称取4.7克平板计数琼脂培养基于250毫升三角瓶中，加200毫升水，溶解，用透气塞

或纸封口，放入高压灭菌锅；

6、取6支1毫升刻度吸管，用报纸包裹严密或用布袋封装，放入高压灭菌锅；

7、盖好锅盖（双手对角拧紧），使密闭步漏气，打开排气阀，排尽冷空气，关闭排气阀，

观察压力表指针变化，从压力表指针达121度时开始计时，使温度保持121度15分钟（根据不同的型号需手动或自动控制），15分钟后断电，自然冷却使压力表指针回到零位。

二、样品稀释和培养

1、打开超净工作台风机；

2、打开压力锅盖，取出包裹严密的8套直径90毫米的培养皿，放入超净工作台；

3、取出装有225毫升生理盐水和200毫升培养基的三角瓶（保持封口密闭）、编号-1，放

入恒温在46度的水浴锅中；

4、取出装有9毫升生理盐水的支试管（置于试管架上），分别编号-2、-3、K，放入超净工

作台；

5、取出包裹严密的6支刻度吸管，放入超净工作台；

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菌落总数检测中的注意要点

菌落总数测定

一、茵落总数的概念和测定意义

菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。

菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．

二、茵落总数测定的几项说明

1．菌落总数的测定。是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。

2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。

3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。

三、茵落总数的测定

测定食品中菌落总数时，是将食品检样做成几个不同的lO倍递增稀释液，然后从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与营养琼脂相混合，经培养后，按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数，并再根据检样的稀释倍数，计算出每g或m1样品中所含细菌菌落的总数。

四、菌落总数测定中的一些要求和规定

为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定。

(一)所用器皿及稀释液

1．检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

2．用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。

3．检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是O．1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宣采用蒸馏水。

(=)检样稀释

1．检样稀释时，应以无菌手续称取(或量取)有代表性的样品25g(或m1)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：lO的稀释液。

如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中(国产均质器，目前以江苏武进郑陆医学仪器厂产品较简便而实用)，以8000一l 0000rpm速度搅拌1分钟，使做成均匀的1：10稀释液。

2．根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述l：lO的检样稀释液再做成几个适当的lO倍递增稀释液。即取1：10稀释液1ml与9ml稀释液混和做成l：lOO的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1 000、1：10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支l ml灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。

3．从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。

4．在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液砸2．5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。

5．当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。

(三)平板接种与培养

1．将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作1O倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。

2．用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于45±1℃恒温水浴中待用。倾注平皿时，每皿内倾入约1.5ml，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。

3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。

4．检样与琼脂混和时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站童鹤泉设计制成的自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋转仪上(可同时放4只平皿)，加入琼脂后，开动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。 5．皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转培养；而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。

6．为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有l无受到来自空气的污染。

7．培养温度，应根据食品种类而定。肉、，乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2小时。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点．果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±2小时培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温摩较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。

(四)对照试验

1．加入平皿内的检样稀释液(特别是10_1的稀释液)，有肘带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿，不经培养，而于4℃环境巾放置，以便在计数捡样菌落时用作对照。

2．为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100ml加lml O．5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC)水溶液之量加入适量的TTC。培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落．配好的TTC溶液，应先用来与不加TTC的作对照，以观察其对计数是否有不利的作用(TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈现红色，其反应式如图2-I：