目的基因的PCR扩增
目的基因的pcr扩增和检测实验报告
目的基因的pcr扩增和检测实验报告《目的基因的PCR扩增和检测实验报告》PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学技术，用于快速地复制DNA片段，是一种技术性强、方法灵活的遗传工具。
它可以重复地扩增小片段DNA，可以准确、有效地快速检测某个基因或者转录本的存在，这使得PCR成为一种重要的基因筛查技术，广泛应用于生物医学领域，也在动物育种中发挥重要作用。
本报告是对目的基因的PCR扩增和检测实验进行详细描述，其主要内容包括：实验材料和设备、实验步骤、实验结果及其解释以及实验总结。
实验材料和设备： 1. PCR反应体系：含有DNA模板（可能包含目的基因）的PCR反应液； 2. DNA提取剂：用于提取样本中的DNA； 3. 反转录酶：将RNA转录成可用于PCR的DNA片段； 4. 核酸脱氧核酸酶：用于分离DNA片段； 5. DNA聚合酶：用于复制DNA片段； 6. 实验仪器：PCR仪、离心机、离心柱、恒温循环水浴、称量等； 7. 试剂：PCR反应体系中使用的试剂； 8. 其它：管夹、片断管、静电整形器、高通量测序仪等。
实验步骤： 1. 样品准备：取液体样品，如血液、细胞液、培养液等，用DNA提取剂提取DNA； 2. 反转录：将DNA模板在室温下加入反转录酶，产生cDNA； 3. PCR扩增：将反转录后的cDNA及相关试剂混合，加入DNA聚合酶，进行PCR扩增； 4. 核酸电泳：将PCR产物加入核酸脱氧核酸酶，电泳分离，查看扩增结果； 5. 测序检测：将PCR产物纯化后加入高通量测序仪，进行目的基因的测序检测； 6. 结果分析：根据测序结果，分析是否存在目的基因。
实验结果及其解释：经过上述实验步骤，得到目的基因的PCR扩增片段，经过测序检测，发现样本中存在目的基因，这表明该实验成功扩增并检测出了目的基因。
实验总结：通过本次实验，我们成功地利用PCR技术，扩增和检测出了目的基因，这既验证了PCR技术的有效性，又为之后的基因研究提供了有效的技术支撑。
PCR扩增目的基因
引物浓度：通常为0.1-0.5μM，浓 度过高可能导致非特异性扩增，浓 度过低则会影响扩增效率
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引物序列：与目的基因的特异性结 合，避免与基因组其他序列发生同 源重组
引物末端修饰：如限制性内切酶位 点、启动子和终止子等，可根据实 验需求进行选择和添加
克隆方法：根 据目的基因序 列设计引物， 进行PCR扩增
,a click to unlimited possibilities
汇报人：
CONTENTS
PART ONE
定义：聚合酶链式反应 （PCR）是一种在体外 快速扩增特定DNA片 段的分子生物学技术。
原理：通过DNA双链 的变性、引物与模板的 结合及延伸、循环复制 等步骤，实现DNA片 段的指数级扩增。
基因组学研究：PCR扩增技术为基因组学研究提供了更准确、快速的方法，有助于深入了解 基因结构和功能。
疾病诊断和治疗：PCR扩增技术可用于检测和诊断各种疾病，以及监测治疗效果和评估病情 进展。
生物制药：PCR扩增技术为生物制药领域提供了高通量筛选和克隆技术，有助于加速新药研 发和生产过程。
农业育种：PCR扩增技术可用于基因编辑和转基因技术，提高作物产量和抗逆性，推动农业 可持续发展。
分类：根据扩增的模板不同，PCR可以分为特异性PCR和随机PCR 应用：PCR技术广泛应用于基因克隆、基因突变、疾病诊断、生物进化等领域 优势：PCR技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点 局限性：PCR技术对于模板的要求较高，对于某些复杂样本的扩增效果可能不佳
模板DNA的纯度
引物设计的准确性
PART FOUR
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因克隆：通过PCR扩 增目的基因，将其插入 到载体中，实现基因的 克隆和保存。
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
pcr技术扩增目的基因的步骤
pcr技术扩增目的基因的步骤
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于扩增特定DNA 片段的技术。
以下是一般PCR 技术扩增目的基因的步骤：
1. 设计引物：根据目的基因的序列，设计一对特异性的引物。
引物是一小段DNA 序列，与目的基因的两端互补。
2. 制备模板DNA：从含有目的基因的样本中提取DNA 作为模板。
可以使用各种方法，如苯酚-氯仿提取法或商业试剂盒。
3. 反应体系准备：将模板DNA、引物、PCR 反应缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶等试剂按照适当的比例混合在一起，形成PCR 反应体系。
4. 热循环：将反应体系放入PCR 仪中，进行热循环。
热循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，模板DNA 被加热至高温，使双链DNA 解开成为单链。
在退火步骤中，温度降低，引物与模板DNA 互补结合。
在延伸步骤中，温度再次升高，DNA 聚合酶开始合成新的DNA 链。
5. 循环次数：热循环通常进行多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
循环次数取决于目的基因的长度和扩增效率。
6. 产物分析：经过一定的循环次数后，PCR 反应产生大量的扩增产物。
可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对产物进行分析，以确认目的基因的扩增。
PCR 技术的具体步骤和条件可能因不同的实验目的和设备而有所差
异。
在进行PCR 实验之前，建议仔细阅读相关的实验指南和操作手册，并根据实际情况进行调整。
目的基因获取方法的四种探索
目的基因获取方法的四种探索目的基因获取方法的四种探索引言：目的基因修饰是一种可以在生物体中操控特定基因的技术，它具有重要的应用潜力，可用于诊断疾病、治疗基因缺陷以及改良农作物等领域。
为了实现目的基因修饰，首先需要获取目标基因。
本文将探讨目的基因获取的四种常见方法，分别是PCR扩增、基因合成、基因克隆和基因编辑。
第一种方法：PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种常见的基因扩增技术，可用于快速、有效地获取目的基因。
PCR扩增需要两个特异性引物，它们在目标DNA序列的起始和终止位点上结合，并通过热循环反应使目标序列扩增成数百万个拷贝。
这种方法在目的基因获取方面具有高度的选择性和灵活性，因为引物的设计可根据特定基因的序列进行定制。
然而，PCR扩增的局限性在于需已知目标序列的信息，并且在复杂基因组中，扩增特定基因可能面临挑战。
第二种方法：基因合成基因合成是一种通过化学方法人工合成目的基因的技术。
它不依赖于现有基因组，而是根据目标序列的设计和合成人工合成DNA。
该方法克服了PCR扩增中需要已知目标序列的限制。
基因合成还可以利用合成片段之间的异源重组，从而在合成过程中引入多个改变，如点突变或插入剪切位点。
这种方法在基因工程和合成生物学领域得到了广泛应用，但成本较高且对合成长度有限制。
第三种方法：基因克隆基因克隆是一种利用遗传学技术从源生物体中分离和复制DNA片段的方法。
它通过将源DNA插入携带适当测序引物的载体中，然后将构建的质粒转入宿主细胞进行复制。
基因克隆可用于获取整个基因或目的基因的片段，并可通过启动子和选定标签等方法对取得的基因进行调控和标记。
然而，基因克隆的整个过程通常较为繁琐，需要耗费较多的时间和实验条件。
第四种方法：基因编辑基因编辑是一种利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFN等蛋白质工具来精确编辑目标基因的方法。
基因编辑技术可以直接在基因组中修改目标序列，从而实现基因的添加、突变或删除。
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法目的基因的4种获取方法目的基因是指科学家们在研究某种生物学现象时，所需要的特定基因。
获取目的基因是进行分子生物学研究和基因工程实验的前提条件之一。
本文将介绍四种常见的获取目的基因的方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是一种常见且简便的获取目的基因方法。
其原理是利用DNA聚合酶在模板DNA上进行反复扩增，从而获得大量目标序列。
PCR扩增法适用于已知序列或有已知序列片段可供引物设计的情况下。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. PCR反应：将引物与模板DNA加入PCR反应体系，通过多轮温度循环反复扩增出目标序列。
4. 纯化PCR产物：通过凝胶电泳等手段纯化出PCR产物。
二、限制性内切酶消化法限制性内切酶消化法是一种利用限制性内切酶切割DNA，从而获得目标序列的方法。
其原理是在DNA双链中寻找特定的核苷酸序列，并将其切割成特定长度的DNA片段。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. 选择限制性内切酶：根据目标序列中存在的限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶。
4. 消化反应：将模板DNA与选择好的限制性内切酶加入反应体系，进行消化反应。
5. 纯化产物：通过凝胶电泳等手段纯化出所需长度的DNA片段。
三、基因克隆法基因克隆法是一种将外源基因插入到载体中并进行繁殖复制的方法。
其原理是通过PCR扩增或限制性内切酶消化等手段获取目标基因，并将其插入到载体中，再通过细胞培养等手段进行繁殖复制。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
实验23PCR扩增目的基因_基础生物学实验(安徽大学研究生复试用,生物 生命科学)
实验二十三 PCR扩增目的基因一、实验目的了解用PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作。
二、实验原理1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室K. Mullis等发明了一种DNA 体外扩增方法，即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。
这项重大的技术突破为分子生物学研究和基因工程发展提供了强大的工具，Mullis也因此获得1993年诺贝尔化学奖。
PCR技术的原理类似于原核细胞和真核细胞中DNA聚合酶催化下的DNA半保留复制过程。
以待扩增的DNA为模板，由与待扩增的DNA两侧互补的两个人工合成的寡核苷酸短链作引物，在DNA聚合酶和4种dNTP存在的情况下，经加热变性、降温退火和延伸，进行DNA的扩增。
多次重复类似循环能使微量的特异模板DNA得到极大程度的扩增(图24-1)。
1．变性：加热使待扩增的模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：降低体系温度，使人工引物在低温下(50～60℃)与待扩增的模板DNA片段按碱基配对原则特异性结合，形成部分双链，即退火阶段。
3．延伸：体系温度上升至中等温度(72℃)，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为原料，在引物的引导下催化合成互补的DNA，即引物的延伸阶段。
由变性、退火和延伸这3个基本步骤组成一轮循环。
理论上每一轮循环将使样品中的靶序列加倍，新合成的DNA又可作为下一轮循环的模板，结果产物将以指数速度扩增。
但实际反应中，DNA酶并非总处于最佳状态，而且引物退火也难以最大化，还有模板链变性分离不完全的问题，等等。
这些因素造成PCR效率达不到100%。
PCR效率公式可表示为：PCR产量=（初始模板量）×（1+%效率）循环数。
以此计算，在效率为70%的条件下，为实现106的扩增倍数，约需要26个循环，通常仅用几个小时就能完成。
pcr扩增目的基因实验报告
pcr扩增目的基因实验报告PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目的基因，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。
本文将介绍PCR扩增目的基因的实验过程和结果分析。
一、实验目的本实验的目的是通过PCR扩增目的基因，以便后续的分析和应用。
PCR技术的优势在于其高效、快速和特异性，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。
二、实验材料与方法1. 材料：（1）PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。
（2）DNA模板：包括待扩增的目的基因DNA。
（3）PCR仪：用于控制反应温度。
2. 方法：（1）DNA提取：从待扩增的样品中提取目的基因DNA，可以采用常规的DNA 提取方法，如酚/氯仿提取法或商用DNA提取试剂盒。
（2）PCR反应体系的准备：按照PCR试剂盒说明书中的比例将试剂加入PCR 反应管中，同时加入目的基因DNA模板。
（3）PCR扩增：将PCR反应管放入PCR仪中，按照以下程序进行扩增：预热（95℃，5分钟）；循环反应（95℃，30秒；退火温度，30秒；72℃，时间根据目的基因大小确定，一般为1分钟/千碱基）；最终延伸（72℃，10分钟）。
（4）PCR产物分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，可以采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
三、实验结果与分析通过PCR扩增目的基因后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳分析。
结果显示，在目的基因区域出现了明显的特异性条带，证明PCR扩增成功。
此外，我们还观察到PCR扩增产物的大小与预期一致，表明PCR反应的特异性良好。
根据PCR扩增产物的大小，我们可以进一步判断目的基因的存在与否。
如果PCR扩增产物与预期大小一致，则说明目的基因存在于样品中；反之，如果未观察到特异性条带，则说明目的基因不存在或浓度过低。
此外，PCR扩增产物的强度也可以反映目的基因的相对丰度。
如果PCR扩增产物的强度较弱，则说明目的基因在样品中的浓度较低；反之，如果PCR扩增产物的强度较强，则说明目的基因在样品中的浓度较高。
分子生物学实验PCR扩增目的基因
实验目的
(1)PCR扩增目的基因红细胞生成因子nap基因 部分片段；
(2)掌握PCR扩增原理； (3)学习并熟悉PCR操作
实验原理
(1)PCR反应原理
温度 （℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
72
60
60 ℃退火
（1min）
循环2
循环3
时间 （min）
三、仪器和试剂
1．仪器： 、1ml、5ml移液管；试管14个；分光光度计 等。
2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 蒸馏水并定容至100ml，制成的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取考马斯亮 蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v） 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中 释放出来。
(2)可用更剧烈的方法来分离小质粒
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于 去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基 配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒 DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复 正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然 的超螺旋分子。
步骤
二、实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当 它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在
0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在
595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用 比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法 （Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合 方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种 较好的蛋白质常用分析方法。
pcr检测目的基因是否转录的原理
pcr检测目的基因是否转录的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段，从而对其进行研究和分析。
PCR检测目的基因是否转录的原理，主要涉及PCR检测以及基因转录的相关知识。
基因转录是指DNA双螺旋分子中的一条链被RNA聚合酶酶解出来，形成一条RNA链。
这一过程在细胞核内进行，是生物体内基因信息从DNA向RNA的转换过程。
转录起始位点上游的DNA分子中有一个启动子，启动子与RNA聚合酶结合后，RNA聚合酶就将DNA的编码链信息转录成RNA。
一旦RNA转录完成，就成为成熟mRNA，进而合成蛋白质。
PCR检测目的基因是否转录的原理，主要是通过检测转录的mRNA来验证基因是否在细胞中得到转录。
具体步骤如下：需要从细胞中提取RNA。
RNA的提取可以使用专门的提取试剂盒，根据生产厂家提供的具体操作步骤进行操作。
提取RNA的过程需要在RNase-free环境中进行，避免RNA降解。
提取的RNA含有目的基因的mRNA，是后续PCR检测的起点。
接着，将提取的RNA逆转录成cDNA。
逆转录是将RNA模板转录成DNA分子的过程，这样得到的cDNA包含了RNA的信息。
逆转录过程通常使用逆转录酶和随机引物，将RNA转录成cDNA。
逆转录后的cDNA可以作为PCR的模板进行扩增。
随后，进行PCR扩增。
在PCR扩增中，需要设计针对目的基因的引物。
引物的设计需要特异性，确保只扩增目的基因序列而不受其他干扰。
PCR扩增的过程包括变性、退火和延伸，反复进行数次即可扩增出目的基因的DNA片段。
进行PCR产物的检测和分析。
PCR扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和分析。
如果PCR扩增得到的产物是预期大小的DNA片段，则说明目的基因已经在细胞中转录，且RNA得到了逆转录成cDNA，进而进行PCR扩增。
PCR检测目的基因是否转录的原理是通过提取RNA、逆转录成cDNA、PCR扩增和检测分析的过程，验证基因是否在细胞中转录。
实验六目的基因的PCR扩增
PCR引物设计
AKP CDS
554......2038
引物1 5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
二、实验原理
三、实验仪器与试剂
1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移 液器、吸头、电泳设备等。
2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq
酶（5u/μl）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂 糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲 液、溴化乙啶染液、等。
七、引物设计原则
⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与 模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在 很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端 碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差 异，最好选T、G、C，而不选A。
八、注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以 防反应混合物受痕量DNA的污染。 1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
引物2
HindⅢ 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、 中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环， 样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成 为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可 扩增106～109倍。
目的基因的制备方法
目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。
该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。
在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。
通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。
2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。
该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。
优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。
在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。
然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。
通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。
3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。
该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。
在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。
然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。
通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。
4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。
该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。
优点是精度高，易于实现定向编辑。
在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。
然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。
5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。
实验三PCR扩增制备目的基因
实验三PCR扩增制备目的基因概念反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。
区分:反转录与逆转录不等同。
反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。
二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。
2反转录酶与反转录过程反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。
合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。
反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。
人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。
在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。
大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。
①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。
此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。
反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。
③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。
反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。
用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
实验四 PCR扩增目的基因
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 • 体外程序化的DNA合成技术。 devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
3. Mg2+：
Mg2+ 浓度对 Taq DNA 聚合酶影响很大，它可影响酶 的活性和真实性，影响引物退火和解链温度 , 影响产物 的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范 围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少 有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等 可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ in the range of 100-300 bp long.
PCR扩增
PCR特点及应用
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可 靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
PCR应用
• • • • • • • 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents • 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases • 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA • 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations
实验二：目的基因的PCR扩增(含结果)
实验二热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延伸。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA 酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP 与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
PCR扩增目的基因
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3.结果观察
高度灵敏的荧光染色剂 染色效果好 操作方便 稳定性差 强致癌剂 中度毒性
取样进行琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭（EB）染色 观察DNA条带
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六、注意事项
1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有
必要进一步优化反应条件，包括改变退火 温度和时间，调整Mg2+浓度等。
2、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA 聚合酶和dNTP的量不宜过多。
• 聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术 ，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和 应用广泛等特点。
• PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程 ，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已 知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷 酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片 段的特异性和片段长度。
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• 标准的PCR过程分为三步：
pcr扩增目的基因一实验目的1掌握pcr扩增dna的技术与原理2学习pcr扩增仪的使用二实验原理聚合酶链式反应是一种体外dna扩增技术具有灵敏度高特异性强操作简便和应用广泛等特点
任务二： PCR扩增目的基因
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一、实验目的
1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理 2、学习PCR扩增仪的使用
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二、实验原理
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2、TaqDNA聚合酶（5U/μL），10×扩增 缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。
3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的 DNA两侧互补的引物。
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五、实验操作
（1）按序将如下成分混合置 于Eppendorf管内
1.准备PCR反应溶液
a.10×扩增缓冲液 10μL b.4×dNTPs 8μL c.引物11μL d.引物2μL e.模板DNA 1μL（10ng） f.TaqDNA聚合酶μL （2.5U） 加水至Ｖ终＝100μL
pcr扩增目的基因的原理
pcr扩增目的基因的原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种基于体外DNA增殖技术，能
在相对较短的时间内扩增出指定DNA序列的方法。
PCR扩增
目的基因的原理如下：
1. 反应体系：PCR反应液中包含目的DNA模板，DNA聚合酶、正反向引物、脱氧核苷酸和缓冲液等。
2. 反应步骤：
（1）首先，PCR反应液被加热到96℃以上，使DNA模板的
双链结构断开为单链。
（2）然后，反应液降温到50-65℃，以便引物结合到模板上。
正反向引物的5'-末端即可与目的DNA序列的3'-末端互补结合。
（3）接下来，反应液又被升温到72℃，以便DNA聚合酶将
脱氧核苷酸合成新链，并以模板为模板扩增出新的DNA分子。
3. 扩增结果：经过30-40个PCR周期，可以扩增出大约1亿
倍的目的DNA序列，其扩增产品可以使用各种方法检测和鉴别。
由于PCR技术可以在不依赖细胞的情况下扩增DNA序列，因此它在遗传学、疾病诊断、药物研发以及法医学等领域具有广泛应用价值。
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【实验项目五】目的基因的PCR扩增
实验室名称实验室地点实验楼8栋
学时 3 实验类型验证每组人数20 选做或必做必做实验目的理解引物设计的基本原则和灵活性；掌握PCR的基本实验操作和结果分析。
内容提要1、目的基因获取2、设计PCR程序3、PCR 4、结果分析
重点难点PCR的具体操作规程
PCR仪琼脂糖凝胶电泳系统
主要仪器及
耗材
实验概要
PCR扩增目标DNA片段。
实验原理
多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2. 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3. 引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。
SSR真核生物的基因组中散布着大量的串联重复序列，其中，2-4个bp的微卫星序列(Microsatellite或叫简单序列重复SSR:Simple Sequence Repeats)具有高度多态性。
微卫星在结构上的最大特点是两端序列较保守，SSR引物根据与微卫星重复序两端的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身，从而揭示微卫星的多态性。
SSR是检测多态性的一种有效方法。
微卫星（SSR）是广泛分布于真核生物基因组中的短串联重复序列（1－7bp），SSR实验一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；是共显性遗传，可鉴别杂合子和纯合子；结果重复性很高。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率高，可检测出单拷贝差异。
SSR广泛应用于生物遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定等方面。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：
DNA模板、1ul;5*反应缓冲液 2ul
dNTP(2mmol) 1ul;MgCl2 (25mmol) 1ul
两个合成的DNA引物(10um) 1.5ul
耐热 Taq聚合酶(5ul/ul) 0.1ul;Water 3.7 ul
PCR反应程序为:95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环;72℃延伸8min。