第二章目的基因连接及导入
第二章现代生物技术第一节基因工程教案
2、工程菌的培育过程
【学生活动】学生阅读叙述课文92——93页观察思考，小组内讨论完成下列问题:
教师个人介绍
省份：山东省学校：青州市益都街道东高初中姓名：冯学芹
职称：二级教师电话：3821217电子邮件：
通讯地址：山东省青州市益都街道东高初中
我始终以作一名学生喜欢的教师来约束自己，鞭策自己。对自己严格要求，积极参加各类政治和业务学习，多次外出参加培训和听课活动，努力提高自己的政治水平和业务水平，配合领导和老师们做好校内外的各项工作。积极撰写论文，并参加上级组织的各种活动。
【教师点拨】
为了扩大学生知识面，提高学生分析、解决问题的能力，增强学习兴趣，通过播放以上资料加深学生认知能力。可从正反两方面回答
1、安全：
1）因为所转入的基因都是功能已知的基因
2）转基因食品被食用多年，尚未发现严重危害人体健康的事例。
2、不安全：
1）转基因是将不同生物之间的基因进行重组，会不会产生新的变异，导致人体患病
第二章现代生物技术第一节基因工程教案
一、教案背景
1，面向学生：□中学□小学2，学科:生物
2，课时：1
3，学生课前准备：，学生课前准备：调查基因工程产品在生活中的应用。
一、预习课文，了解转基因技术的原理和应用
二、教学课题
通过学习使学生了解什么是基因工程，能正确对待转基因生物的安全性，确立正确的伦理观和价值观。
1、让学生快速浏览全节教材内容，并回忆教师的讲述内容，从整体上感知和把握所学知识。
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
第二章实验动物的遗传学分类
（二）重组近交系
概念 重组近交系：两个无血缘关系的近交系杂交后得 到F2代，分组分别经连续20代以上的兄妹交配而 育成的近交系列组动物。祖系：为重组近交系提 供亲代的两个近交系。 应用 重组近交系对祖系间有差异的性状和基因进行遗 传分析是非常有用的实验材料。分离分析、连锁 分析、功能分析。
命名 重组近交系的命名是在两个祖系名称之间加 上X，同一系列中不同的近交系在其后面加连字 号，再加数字。如AKR和C57BL杂交培育的一系 列重组近交系可命名为AKXB-1，AKXB-2，AKXB3等。
2.血缘扩大群
血缘扩大群的种动物来自基础群。以全 同胞兄妹交配方式进行繁殖；也应设个体 繁殖记录卡；血缘扩大群动物不超过5～7 代都应能追溯到其在基础群的一对共同祖 先。
3.生产群
设生产群的目的是生产供应实验用近交系动物，生产 群动物来自基础群或血缘扩大群。生产群动物一般以 随机交配方式进行繁殖；应设繁殖记录卡；生产群动 物随机交配代数一般不应超过4代，所以要不断从基础 群或血缘扩大群向生产群引入动物，确保基础群与生 产群动物的血缘关系和遗传一致性。这种方式也有人 称为红绿灯制度，即第一代为白标签，第二代为绿标 签，第三代黄标签，第四代为红标签，不再继续繁殖。 应注意生产的动物要全部作为实验用动物提供，不得 留种，种子动物从扩大群中引入。
三）同源突变、同源导入、分离近交系
同源近交系：
在一个普通的近交系中，几乎所有基因位点上 都带有相同的基因，如果两个近交系除了个别 位点上携带的基因不同外，其它位点上的基因 都一样，称这两个近交系是同源的，即遗传上 相同，称个别不同的基因为差异基因。
1.同源突变近交系
概念：两个近交系除了一个指明位点等位基因 不同外，其它遗传基因全部相同的品系。即是 某个近交系在某基因位点上发生突变而分离出 的近交系亚系，与原近交系的差异只是发生突 变的基因位点上带有不同的基因，而其它位点 上的基因完全相同。
人教版初中八年级生物下册第七单元第二章-生物的遗传与变异第二节 基因在亲子代间的传递-经典PPT教学
2.测量：部位 种子长轴 ，用具
、方法 。
3.处理数据：以 毫米 为单位计，四舍五入，保留 整数位。
讲授新课
学案A:测量不同品种花生种子长度填入数据记录表， 算出每个品种的平均值，并绘制不同品种花生种子 长度平均值统计图。 学案B: 统计每个长度范围内不同品种花生种子数目 填入分布情况记录表，并绘制不同品种花生种子长 度分布曲线。
性状
小小的树叶所具有的属性是多样的： 长短、宽窄、厚薄、色彩的浓淡、 边缘的锯齿形状、中间的脉络走向……
导入新课
地球是个物种丰富的星球！
也是一个充满变异的世界!
导入新课
快乐姐妹眼果蝇和白眼果蝇的头部
达尔文记载的安康羊
幼猪肤色
不同品种的玉米果穗
导入新课
玫瑰花色
产
量
选择、繁育
不
同
的
奶
选择、繁育
牛
高产奶牛
讲授新课
原 因 分 析
不同的奶牛控制产奶量的基因组成不同，通过人 工选择可以将产量高的奶牛选择出来，这种奶牛含有 控制高产奶量的遗传物质，经过繁殖，再从下一代中 选择产奶量多的奶牛，最终可以得到高产奶牛。
讲授新课
杂交 高产倒伏小麦 低产抗倒伏小麦
高产抗倒伏小麦
提出问题：
1.不同品种花生种子大小存在变异吗？ 2.花生种子的大小和环境有关吗？ 3.大花生的种子一定比小花生的大吗？ 4.大花生种子的平均值一定比小花生种子的平 均值大吗？
讲授新课
作出假设：
不同品种花生种子大小存在变异
讲授新课
制定计划：
1.材料：选用 两个品种的花生 种子， 随机 取样， 数量 各20粒 。
Ａ、同卵双生姐妹，姐姐比妹妹略胖 Ｂ、种在肥沃土壤中的水稻颗粒饱满 Ｃ、不同人种的肤色不同 Ｄ、某人用眼不当导致近视
实验动物学第二章实验动物质量的标准化
各类实验动物中已培育近交系的数目
实验动物 近交系数目
封闭群
近交系
突变系
⒉品种、品系的概念
在动物分类学中，种是动物分类的基本单位，其定义为一群形态相似、能互相交配的自然群体，它们在生殖上与其他群体相隔离。 而在实验动物分类系统中，品种、品系是基本分类单位。作为一个品种、品系，应具备以下条件。 相似的外貌特征：如体重、毛色等应相近或一致。C57BL/6小鼠毛色是黑色的，DBA/2小鼠的毛色是灰色的，昆明小鼠的毛色是白色的等。 独特的生物学特性：是一个实验动物品系、品种存在的基础。如高癌鼠、低癌鼠、糖尿病鼠、白血病鼠等。根据研究目的进行选择应用。
小鼠 300 大鼠 111 地鼠 35 中国地鼠 4 豚鼠 15 兔 12 鸡 40 鱼 9 两栖类 4
亚系和支系：亚系是由一个近交系分离出来的具有各不相同特性的品系。育成的近交系可能由于突变和残余杂合基因而导致部分遗传组成的改变，从而形成亚系。支系是亚系内的小分类，一般是由一个亚系引到另一单位形成的新亚系，也可经人为技术处置（如代乳、胚胎移植、卵巢移植等）形成支系。
⒉命名
四、重组近交系动物
⒈基本概念： 在两个近交系杂交生育F1代后，F1代互交生育F2代，从F2代中随机选择个体交配，连续进行20代以上的全同胞兄妹交配而育成的一个近交系称为重组近交系。 为重组近交系提供亲代的两个近交系称为祖系。
④关系相近，同一来源的不同品系，其名称基本相似，差异部分用一个大写英文字母表示，如NZB、ZNO、ZNX、ZNW等。 ⑤近交代数的表示，一般在品系符号后括号内写上代数，在代数前加写F，如A(F78)等。 ⑥书写品系命名符号要完全，应使用公布的全称，不能随便缩写。
第二章3目的基因获得915
1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
CCCCCC GGGGGG
GGGGGG
加装人工接头(adapter)
1978年，康奈尔大学吴瑞发明。 adapter是人工合成的一头具有某种限制 酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链 寡核苷酸短片断。
5’ GTCG 3’ CAGCTTAA
EcoR I adA的两端，直接 成为人工粘端。
问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。
原因：Taq 酶 无 3’→5’ 外 切 酶 活 性 ， 无 阅 读 校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次 循环Taq酶错配率约0.25％。
措施：选择高保真Taq酶，如Pfu。
由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有 一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎 总是A，因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。
维 oligo(dT) 素 柱 oligo(dT)
oligo(dT)
纤 oligo(dT)
维 oligo(dT) 素 柱 oligo(dT)
oligo(dT)
总mRNA
与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上， 非mRNA(tRNA、rRNA）流走。
2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合 到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。
Klenow酶合成cDNA第二链
primer dNTP
mRNA
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
基因工程(第二章答案)
第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
第二章 生物的遗传和变异教学设计教案(集体备课)
第二章生物的遗传和变异教学设计教案集体备课专用版第七单元第二章生物的遗传与变异第一节基因控制生物的性状一、知识与技能1.举例说出生物的性状，以及亲子代间在性状上的延续现象。
2.举例说出不同种性状和相对性状之间的区别。
3.举例说出生物的性状是由基因控制的。
二、过程与方法以观察分析图片资料、文字资料及实验资料为主线让学生自己归纳得出什么是性状、相对性状，并得出基因控制性状的结论。
三、情感态度与价值观关注转基因技术给人类带来的影响。
1、举例说出生物的性状与相对性状。
2、举例说出生物的性状是由基因控制的。
1、举例说出生物的相对性状。
2、分析“转基因鼠的启示”的资料。
1.多媒体课件2.各组成员在上课前观察自己家庭成员的性状特点并填写以下表格：性状本人父亲母亲兄弟姐妹眼皮单眼皮双眼皮舌能卷舌不能卷舌耳垂有耳垂无耳垂拇指会弯不会弯酒窝有无1、提问：我们知道生物个体的寿命是有限的，而整个生物圈的生命却在不断的延续和发展，这是为什么呢？2、陈述：是的。
通过生命个体的生殖与发育、遗传与变异，以及与环境变化的相互作用，才使得生物圈的生命生生不息，绵延不绝。
3、陈述：遗传和变异是生命得以延续和发展的重要内因。
生物的遗传是在生殖过程中完成的，生物的性状则是遗传物质在发育中和环境相互作用的结果。
在前一章我们已经学习了生物的生殖和发育，接着我们就要学习第二章的内容------生物的遗传和变异。
师：俗语“龙生龙，凤生凤，老鼠的儿子会打洞”，反映了什么生物现象？“龙生九子，九子九个样”说的又是什么生物现象?4、陈述：人们对遗传和变异的认识，最初是从性状开始的，以后随着科学的发展，才逐渐深入到基因水平，所以今天我们的学习就从第一节基因控制生物的性状开始，(出示本节课课题：第一节基因控制生物的性状)师：回忆自己与父母有哪些相似的特征,又存在哪些不同,为什么与父母既像又不像?生：学生判断是否有亲缘关系。
师：说了这么多遗传和变异，那么大家来总结一下遗传和变异的概念。
第二章 产酶微生物的分离与筛选
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 运动（周毛）或不运动， 不生芽孢。好气。含糖、 乙醇和酵母膏的培养基上 生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡 萄糖异构酶(高果糖浆 )山 梨糖 (维C中间体）
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
高中生物第二章第四节教案
高中生物第二章第四节教案
教学目标：
1. 了解遗传的基本概念和规律；
2. 掌握基因的概念，了解基因的结构和功能；
3. 理解遗传物质的传递和表达方式。
教学重点：
1. 遗传的基本概念和规律；
2. 基因的结构和功能；
3. 遗传物质的传递和表达方式。
教学难点：
1. 遗传的规律和机理；
2. 基因的结构和功能。
教学准备：
1. 教材《高中生物》第二章第四节相关知识点；
2. 讲义、教案、学案等教学资料。
教学过程：
一、导入
通过展示一张遗传的家谱图或者一个遗传实例，引出遗传的概念和重要性。
二、讲解
1. 遗传的基本概念和规律
介绍遗传的概念和遗传规律，包括孟德尔遗传规律的三法则。
2. 基因的概念、结构和功能
讲解基因的概念、结构和功能，强调基因对遗传的重要性。
3. 遗传物质的传递和表达方式
介绍DNA和RNA的结构，以及他们在遗传物质传递和表达中的作用。
三、示范
通过实例演示遗传物质的传递和表达方式，让学生理解遗传的基本规律。
四、练习
设计一些练习题，让学生运用所学知识解决问题，加深对遗传规律的理解。
五、归纳总结
让学生总结当天所学内容，强化遗传的规律和基因的作用。
六、作业布置
布置相关作业，如复习遗传的基本概念和规律，了解更多关于基因的知识等。
七、课堂反馈
了解学生对当天所学内容的掌握情况，并对不懂的问题进行解答。
教学结束。
第二章56 目的基因连接及导入
几种重要的
活性
工具酶
限制性核酸 识别特异碱基
内切酶序列，切割DNA
DNA连接酶 催化DNA5ˊ磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯 键
DNA聚合酶 以DNA为模板 合成DNA
逆转录酶 以RNA为模板 合成cDNA
碱性磷酸酶 切除5－末端磷 酸
T4多聚核苷 催化核酸5'酸激酶羟基磷酸化
末端脱氧核苷 催化3'-端合 酸转移酶成同聚尾
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连 接，构建重组DNA。 用接头连接
用同一种 限制性内切酶酶切 DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 + + DNA连接酶 接头(linker) 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ （四）同源多聚尾连接法
尾接法
DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 内切酶 末端转移酶 +dGTP 末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点 基因与载体的平末端连接方法有哪些？ (1)T4DNA连接酶法
点： ①基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工 程操作； ②培养简单，适于大规模生产，成本低廉；③可以分泌表达，便于产物 的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。 真核生物细胞-酵母受体细胞 植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就 是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗 传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组 DNA 分子。 动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或 胚细胞作为受体细胞，近年来干细胞成为新的研究热点。 原核生物细胞，大肠杆菌 优点：结构简单，便于操作分析 缺点：表达蛋白可能没有活性 真核生物细胞，酵母 优点：表达蛋白加工具有活性 缺点：操作相对麻烦 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。
高中生物必修二知识点总结(精华版)
生物必修2复习知识点第二章基因和染色体的关系第一节减数分裂一、减数分裂的概念减数分裂(meiosis)是进行有性生殖的生物形成生殖细胞过程中所特有的细胞分裂方式。
在减数分裂过程中，染色体只复制一次，而细胞连续分裂两次，新产生的生殖细胞中的染色体数目比体细胞减少一半。
（注：体细胞主要通过有丝分裂产生，有丝分裂过程中，染色体复制一次，细胞分裂一次，新产生的细胞中的染色体数目与体细胞相同。
）二、减数分裂的过程1、精子的形成过程：精巢（哺乳动物称睾丸）减数第一次分裂 1、精子的形成过程：精巢（哺乳动物称睾丸）间期：染色体复制(包括DNA复制和蛋白质的合成)。
前期：同源染色体两两配对（称联会），形成四分体。
四分体中的非姐妹染色单体之间常常交叉互换。
中期：同源染色体成对排列在赤道板上（两侧）。
后期：同源染色体分离；非同源染色体自由组合。
末期：细胞质分裂，形成2个子细胞。
减数第二次分裂（无同源染色体．．．．．．）前期：染色体排列散乱。
中期：每条染色体的着丝粒都排列在细胞中央的赤道板上。
后期：姐妹染色单体分开，成为两条子染色体。
并分别移向细胞两极。
末期：细胞质分裂，每个细胞形成2个子细胞，最终共形成4个子细胞。
2、卵细胞的形成过程：卵巢附：减数分裂过程中染色体和DNA的变化规律三、精子与卵细胞的形成过程的比较精子的形成卵细胞的形成不同点形成部位精巢（哺乳动物称睾丸）卵巢过程有变形期无变形期子细胞数一个精原细胞形成4个精子一个卵原细胞形成1个卵细胞+3个极体相同点精子和卵细胞中染色体数目都是体细胞的一半四、注意：（1）同源染色体：①形态、大小基本相同；②一条来自父方，一条来自母方。
（2）精原细胞和卵原细胞的染色体数目与体细胞相同。
因此，它们属于体细胞，通过有丝分裂的方式增殖，但它们又可以进行减数分裂形成生殖细胞。
（3）减数分裂过程中染色体数目减半发生在减数第一次分裂．．．．．．．．．．．．．．．．，原因是同源染色体分离并进入不同的子细胞．．．．．．。
高中生物必修2教案-第2单元 基因和染色体的关系
第二章第1节《减数分裂和受精作用》（1）一、教材分析本节内容是人教版必修二模块《遗传与进化》第二章第一节“减数分裂和受精作用”第一课时。
本节内容是建立在已有知识如细胞学、染色体和有丝分裂的基础之上，并与第一章孟德尔基因的分离定律和自由组合定律密切相关，因此，其在模块二中的地位十分重要。
通过对减数分裂的学习，学生对细胞分裂的方式、实质和意义产生全面而深刻的认识，更重要的是加深对前面所学的遗传规律的理解和应用。
本节课的设计理念是：将信息技术与学科教学进行整合，积极探索创设一个可以让学生在其中自由探究和自主学习的环境，并且开展师生互动、生生互动，体现以学生进行主动思维、参与并且活动、同时经历一个从具体的动手实践和不断创新到知识的归纳和升华的过程。
二、教学目标（1）（一）知识与技能1．了解减数分裂的概念。
2．通过精子的形成过程掌握减数分裂过程及图解。
（二）过程与方法1．观察有丝分裂和减数第二次分裂的染色体特点，培养学生的发现能力。
2．通过列有丝分裂和减数分裂比较表，训练学生的归纳、总结、比较能力。
（三）情感态度与价值观减数分裂过程中，染色体形态数目发生一系列规律性变化，通过受精作用使生物前后代之间能保持染色体数目的恒定，引导学生了解生命是运动的、有规律的。
三、教学重点、难点1．教学重点精子的形成（减数分裂）过程及图解2．教学难点减数分裂过程中染色体、DNA的数目变化四、学情分析在前面的学习中，学生就已经掌握了细胞、染色体、有丝分裂、有性生殖等相关知识，这为本节的学习奠定了基础，但学生在学习本节时还需要大量的感性认识和理性认识。
学生毕竟有着基础和其它方面（如空间想象及思维能力、兴趣、动机、毅力、情感等）非智力因素的差异，因此要进行因材施教。
从疑问的设置，到问题的回答要适合不同层次的学生；从基础知识的掌握，再到能力的培养，包括探索创新能力，学习兴趣等，教师要对不同层次学生进行相应点拨。
五、教学方法直观教学法、讲解法、实验法。
2第二章基因克隆载体的种类和特性 (1)
检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。
2、 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ， Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应， 如lacZ
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所
有的质粒都是DNA质粒。关于质粒DNA的大小,
文献中有多种说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿)
2、质粒的相容性和不相容性(又称为亲和性与不亲和性)
①：在同一时间内从一个细胞中发现多个不同类型的质粒 ，只有当 不同的质粒是相容的时才能存在于同一个细胞中； ②：质粒的不相容性是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密 切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。不相容 的质粒一般都利用同一复制系统，拷贝多的复制更快，结果在细菌 繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒 。 ③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质 粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用， 但这两种质粒却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A 和B是不亲和的质粒。 ④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和 群的质粒在亲缘关系上则比较接近。
严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制
高中生物基因工程的基本操作程序课件新人教版选修
在工业领域的应用
生物制药：基因工程药物的生产，如胰岛素、生长激素等 生物农药：利用基因工程生产高效、低毒的生物农药，如Bt杀虫剂 生物材料：利用基因工程生产生物可降解材料，如聚乳酸（PLA） 生物能源：利用基因工程生产生物燃料，如酒精、生物沼气等
在环境保护领域的应用
检测和鉴定环境污染的程度 治理污染的生物 生物降解 基因工程生产具有降解作用的微生物
基因工程的安全性问题
基因污染：基因工程可能会导致基 因污染，即插入的外源基因在环境 中扩散。
潜在风险：基因工程可能带来潜在 风险，如产生新的疾病或使某些生 物变得更具侵略性。
添加标题
体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术 • 基因工程的基本原理：基因重组、基因克隆等 • 基因工程的应用：医药、工业、农业等领域 • 基因工程的发展前景：随着技术的不断进步，基因工程将在未来发挥更加重要的作用
限制性核酸内切酶
作用：切割DNA分子，暴露 出黏性末端或平末端
分类：限制性内切酶和非限 制性内切酶
疫苗研发：利用基因工程技术生产 疫苗，如乙肝疫苗等。
在农业领域的应用
抗虫、抗病：通过基因工程培育出具有抗虫、抗病能力的农作物，提高农作物的抗病、抗 虫能力，减少农药使用量，降低环境污染。
抗逆性：通过基因工程培育出能够适应恶劣环境的农作物，提高农作物的抗逆性，从而增 加农作物的产量和品质。
转基因技术：将外源基因导入植物体内，产生具有特定性状的转基因植物，提高农作物的 产量和品质。
定义：能够识别DNA分子内 部的特异序列并准确切割的 酶
应用：在基因工程中用于切 割目的基因和控制其表达的
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质粒
产生平末端的 内切酶
目的基因
核酸酶S1
重组质粒
DNA连接 酶
本法适用于在质粒
和目的基因上没有相 同的酶切位点！
（三） 人工接头法
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割, 产生粘性末端→连接，构建重组DNA。
用接头连接
+
目的基因 质粒
用同一种 限制性内切酶酶切
+
接头(linker)
DNA连接酶
DNA连接酶
本法适用于在质粒
和目的基因上没有相
重组质粒
同的酶切位点！
（ 四 ） 同 源 多 聚 尾 连 接 法
尾接法
质粒
内切酶
末端转移酶 +dGTP
目的基因
末端转移酶 +dCTP
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点
基因与载体的平末端连接方法有哪些？
动物细胞同样可以作为受体细胞。早期 多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞 作为受体细胞，近年来干细胞成为新的 研究热点。
原核生物细胞，大肠杆菌 优点：结构简单，便于操作分析 缺点：表达蛋白可能没有活性
真核生物细胞，酵母 优点：表达蛋白加工具有活性 缺点：操作相对麻烦
大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。
工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分 子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。
几种重要的工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异碱基序列，切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚尾
受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转 导、杂交中接受外源基因的细胞。
分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真 核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和 昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。
受体细胞条件
具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶 缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠 ；在标记上和 载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培 养条件下生存，有利于安全。
体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合 发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。
3）用化学合成的衔接物连接
DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷 酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸 化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’ 端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性 内切酶处理，产生互补的粘性末端。
5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5’-P的目 的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性 末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有 两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低 于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。
⑵ 双向插入
一般受体细胞在对数生 长期转化能力最强。
基因导入方法
1、直接导入法：
（1）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下 直接把目的基因注入宿主细胞。
（2）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因 打入宿主细胞。
（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在 一起，让其吸收。
（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因， 然后发射到宿主细胞中。
（3）直接吸收法：
1.磷酸钙沉淀法
利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA 的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷 酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的 能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入 细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬 DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外 包装法。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：
①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， 同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使 细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来， 诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNa se)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜 的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时， 细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许 多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
• 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很 少采用。
（4）基因枪技术
又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰 击法
• 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受 态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA 可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足 质粒的常规克隆的需要
• Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与 Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效 率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进 一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化 效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行 有效的转化。
（一） 粘性末端连接
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘
性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组
DNA分子。
质粒
目的基因
用同一种或两种
限制性内切酶酶切
本法适用于在质粒和 目的基因上有相同单 或双酶切位点
重组质粒
DNA连接酶
（二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此
通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰 浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆 菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、 Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化 己胺钴处理制备感受态细胞。
感受态是指受体细胞 能吸收外源DNA分子而有 效地作为转化受体的某 些生理状态。
1.用一定的__限__制__酶___切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_黏__性__末__端_____。
2.用_同__一__种__限__制__酶__切断目 的基因，使其产生_相__同__ 的__黏__性__末__端____。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的_切__口___处， 再加入适量__D_N_A_连__接__酶__，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和 防止自我环化和提高连接效率？
目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如 EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ⑴ 高背景
载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自 我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克 隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体 的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的
真核生物细胞-酵母受体细胞
酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有 的特性外，还具有以下优点： ①基因结构相对简单，其基因表达调控机制 研究比较清楚，便于基因工程操作； ②培养简单，适于大规模生产，成本低廉； ③可以分泌表达，便于产物的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。
植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共 有的特性外，最突出的优点就是其体细胞 的全能性，一个获得外源基因的体细胞可 以培养出能稳定遗传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的 坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA 分子。
经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因 和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反 应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表 达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连 接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达 为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目 的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转 录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不 能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选 用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体 的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。(YL)
基因工程之
第五节 目的基因与载体连接
二、 目的基因与载体的连接（接）
质粒
DNA分子
同一种 限制酶
的基因
DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
（主要有以下4种连接方式）
1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法
(1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4D NA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给 平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶 进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接 酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P 末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度 酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末 端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。
DNA连接酶
DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在 一起的3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使 末端连接。
E. coli DNA 连接酶
只能催化互补粘性 末端之间的连接
T4 DNA 连接酶
催化互补粘性末端和 平末端之间的连接， 但平末端之间连接的 效率比较低 。
（1）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核 细胞内的方法；
又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液， 在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此 法常用于转基因动物的基因转移。