I目的基因与载体的连接
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末端转移酶还可用于DNA片段末端的 标记。
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总结：
同聚物加尾法就是利用末端转移酶 的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于
重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:
1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是
单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA
以最高的几率正确组合.
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
5‘
3‘
3‘
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
5’
调控
报告基因
机能
基因
3’
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二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载
体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互
相连接，形成新的重组分子。
1.对载体的要求：
一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可
与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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只要分别获得poly(dA)和poly(dT) 尾巴，就会彼此连接起来。这种连接 DNA分子的方法叫同聚物加尾法。
在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中， 平末端DNA也可以作底物, 而且4种 dNTP中任何一种都可以作反应的前 体，即给平末端DNA 3′-OH的末端， 加上4种同聚物“尾巴”。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末端 也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以
期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到
扩增或正确表达。
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构
建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启
动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目
的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候， 便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴， 如poly（dA）等，因此任何两条DNA分 子
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
有时载体DNA片段是平末端，而目的基因 却是粘性末端，那就需要处理，使载体 DNA和目的基因的末端一致，通常是将目 的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补 法和消除法。
视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白
至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，
则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。
➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一
些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基
因．将两者连接起来，将目的基因插入于可
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
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（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.
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总结：
同聚物加尾法就是利用末端转移酶 的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于
重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件:
1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是
单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA
以最高的几率正确组合.
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
5’
调控
报告基因
机能
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二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载
体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互
相连接，形成新的重组分子。
1.对载体的要求：
一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可
与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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只要分别获得poly(dA)和poly(dT) 尾巴，就会彼此连接起来。这种连接 DNA分子的方法叫同聚物加尾法。
在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中， 平末端DNA也可以作底物, 而且4种 dNTP中任何一种都可以作反应的前 体，即给平末端DNA 3′-OH的末端， 加上4种同聚物“尾巴”。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末端 也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以
期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到
扩增或正确表达。
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构
建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启
动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目
的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候， 便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴， 如poly（dA）等，因此任何两条DNA分 子
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
有时载体DNA片段是平末端，而目的基因 却是粘性末端，那就需要处理，使载体 DNA和目的基因的末端一致，通常是将目 的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补 法和消除法。
视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白
至关重要。
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析，
则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。
➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一
些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基
因．将两者连接起来，将目的基因插入于可
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
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（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.